מאמר שיטה

בתעתיק במבחנה תקרת של mRNA בלוציפראז Gaussia ואחריו transfection Cell הלה

18.4K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/3702

⸱

26 במרץ 2012

 , 
1RNA Biology, New England Biolabs

במאמר זה

סיכום

שיטה זו מתארת סינתזה in vitro בתפוקה גבוהה של mRNA עם כיסוי (capped) וללא כיסוי (uncapped), מפלסמיד ליניארי המכיל את הגן של לוסיפראז Gaussia (GLuc). ה-RNA מטוהר, וחלק מה-RNA ללא הכיסוי עובר תהליך כיסוי אנזימטי באמצעות אנזים הכיסוי של נגיף ה-Vaccinia. בשלב הסופי, ה-mRNA מוחדר (transfection) לתאי HeLa, ותעליל התרבית של התאים נבדק לפעילות לוסיפראז.

תקציר

In vitro transcription הוא תהליך של סינתזה של תמלילי RNA על ידי RNA polymerase מתבנית DNA ליניארית המכילה את רצף הפרומוטור המתאים (T7, T3, SP6) ואת הגן להשכחה (איור 1A). תגובת שעתוק טיפוסית מורכבת מתבנית ה-DNA, RNA polymerase, ריבונוקלאוטיד טריפוספטים, מעכב RNase ובאפר המכיל יוני Mg2+.

כמויות גדולות של RNA באיכות גבוהה נדרשות לעיתים קרובות למגוון יישומים. שימוש ב- in vitro דווח כי תעתוק משמש למחקרי מבנה ותפקוד של RNA, כגון שחזור (Splicing)1, ניסויי RNAi בתאי יונקים2, הגברה של RNA אנטיסנס באמצעות "שיטת Eberwine"3, ניתוח מיקרו-מערך4 ועבור מחקרי חיסוני RNA5ניתן להשתמש בטכניקה זו גם להפקת גששים המסומנים רדיואקטיבית או באמצעות צבעים.6וורן, ואח' שוחזר לאחרונה תכנות מחדש של תאי אדם באמצעות טרנספקציה של in vitro RNA משוכתב עם מכסה (capped RNA)7ערכה לסינתזת RNA בתפוקה גבוהה באמצעות T7 מבית New England Biolabs תוכננה לסינתז של עד 180 μg RNA לכל תגובה של 20 μl. באמצעות ערכה זו בוצעה בהצלחה טרנסקריפציה של RNA באורך של עד 10kb. ניתן להשתמש ב-DNA פלסמידי ליניארי, בתוצרי PCR ובאוליגונוקלאוטידי DNA סינתטיים כתבניות לטרנסקריפציה, כל עוד הם כוללים את רצף הפרומוטור של T7 במעלה הזרם של הגן המיועד לטרנסקריפציה.

הוספה של מבנה כיסוי (cap) לקצה'5 של ה-RNA היא תהליך חשוב באוקריוטים. היא חיונית ליציבות ה-RNA8, לתרגום יעיל9, להובלה גרעינית10 ולשחזור (splicing)11. התהליך כולל הוספה של כיסוי 7-methylguanosine לקצה הטריפוספט'5 של ה-RNA. ניתן לבצע את כיסוי ה-RNA לאחר השעתוק (post-transcriptionally) באמצעות אנזימי כיסוי, או במהלך השעתוק (co-transcriptionally) באמצעות אנלוגים של כיסוי. בשיטה האנזימטית, ה-mRNA מקבל כיסוי באמצעות אנזים כיסוי של נגיף ה-Vaccinia12,13. האנזים מוסיף כיסוי 7-methylguanosine לקצה'5 של ה-RNA תוך שימוש ב-GTP וב-S-adenosyl methionine כתורמים (מבנה cap 0). שתי השיטות מניבות RNA מקוצב פעיל תפקודית, המתאים לטרנספקציה או ליישומים אחרים14, כגון יצירת RNA גנומי ויראלי עבור מערכות גנטיקה הפוכה15 ומחקרים קריסטלוגרפיים של חלבונים נקשרי-כיסוי כגון eIF4E16.

בשיטה המתוארת להלן, נעשה שימוש בערכת T7 High Yield RNA Synthesis Kit מבית NEB כדי לסנתז תמלילי RNA עם כיסוי (capped) וללא כיסוי (uncapped) של לוסיפראז Gaussia (GLuc) ולוסיפראז Cypridina (CLuc). חלק מ-RNA ה-GLuc ללא הכיסוי עובר כיסוי באמצעות מערכת Vaccinia Capping System (NEB). פלסמיד ליניארי המכיל את הגן GLuc או CLuc ופרומוטר T7 משמש כ-DNA התבנית. ה-RNA התמליל מוחדר (transfected) לתאי HeLa, ונוזלי העל של תרבית התאים נבדקים לפעילות לוסיפראז. RNA של CLuc עם כיסוי משמש כביקורת פנימית לנורמליזציה של ביטוי GLuc.

פרוטוקול

אנזימי RNases נפוצים בדרך כלל על העור, בשיער, באבק, על משטחי מעבדה, בתמיסות וכו'. יש להשתמש בכפפות ולנקות ביסודיות את משטח העבודה, את הפ pipette וכו' לפני השימוש כדי למנוע זיהום ב-RNase. מומלץ מאוד להשתמש בקצות פפטה, מבחנות, כלי זכוכית וריאגנטים נקיים מנוקלאז (nuclease-free).

1. תמלול In vitro באמצעות ערכה לסנתזת RNA בנשוא גבוה של T7

תבנית ה-DNA לתגובת השעתוק היא פלסמיד לינארי המכיל את הגן של לוציפראז Gaussia ופרומוטור T7 במעלה הזרם של רצף הקידוד (איור 1B).

  1. הפשיר את רכיבי ערכת T7 High Yield RNA Synthesis ושמור אותם על קרח.
  2. עבור RNA ללא כיסוי (uncapped), הכן את התגובה בטמפרטורת החדר לפי הסדר הבא:
רכיבנפח (μl)ריכוז סופי
מים נקיים מנוקלאז*X 
תמיסת ריאקציה 10X21X
ATP (100 mM)210mM
CTP (100 mM)210mM
UTP (100 mM)210mM
GTP (100 mM)210mM
DNA תבנית *X1 μg
T7 RNA Polymerase Mix2 
סה"כ20 

*הוסיפו 1 μg DNA והשלימו את נפח התגובה הכולל ל-20 μl באמצעות מים נקיים מנוקלאז (nuclease free water). כמות המים שתוסף תשתנה בהתאם לריכוז של ה-DNA התבנית.

  1. עבור RNA עם כיסוי (capped RNA): הכינו את התגובה בטמפרטורת החדר בסדר הבא:
רכיבנפח (μl)סופי
מים נקיים מנוקלאז*X 
בפר ריאקציה 10X21X
ATP (100 mM)210mM
CTP (100 mM)210mM
UTP (100 mM)210mM
GTP (20 mM)22mM
3´-0-Me-m7אנלוג כיסוי G(5')ppp(5')G (ARCA)(40mM)48mM
DNA תבנית*X1 μg
תערובת T7 RNA Polymerase2 
סה"כ20 

*הוסיפו 1 μg DNA והשלימו את נפח התגובה הכולל ל-20 μl באמצעות מים נטולי נוקלאז. כמות המים להוספה תשתנה בהתאם לריכוז ה-DNA התבנית.

  1. ערבבו היטב באמצעות וורטקס והדגירו את התגובות ב-37 °C למשך שעתיים בתוך אינקובטור לאוויר יבש.
  2. באמצעות שלבים 1.3-1.4, סנתזו תמלילי mRNA עם כיסוי (capped) של Cypridina luciferase (CLuc) מפלסמיד לינארי המכיל את הגן CLuc. mRNA זה יועבר בטרנספקציה משותפת (co-transfection) עם ה-GLuc mRNA עם ובלי כיסוי לצורך נרמול של ביטוי ה-GLuc.

2. הסרה של DNA התבנית

תגובות השעתוק מטופלות ב-DNase I כדי להסיר את תבנית ה-DNA לפני השלב של הטיהור.

  1. הוסיפו 70 μl מים נקיים מנוקלאז לתגובות השעתוק, ולאחריהם 10 μl של תמיסת בופר לתגובת DNase I.
  2. הוסיפו 2 μl של DNase I לתגובות.
  3. דגרו בטמפרטורה של 37 °C למשך 15 דקות באינקובטור לאוויר יבש.

3. טיהור בעמודה של RNA עם כיסוי (Capped) וללא כיסוי (Uncapped)

  1. טהרו את ה-RNA עם הכובע (capped) וללא הכובע (uncapped) באמצעות ערכת MEGAclearKit לפי הוראות היצרן (ניתן להשתמש בכל ערכה לטיהור RNA המבוססת על עמודות ספינ).
  2. כמתו את ה-RNA באמצעות ספקטרופוטומטר NanoDrop.
  3. העריכו את איכות דגימות ה-RNA באמצעות ערכת Agilent RNA 6000 Nano Kit ומכשיר Agilent 2100 Bioanalyzer, בהתאם להוראות היצרן.

4. כapping של RNA באמצעות מערכת ה-Capping של Vaccinia

  1. קח 10 μg של mRNA של GLuc מנוקה וללא כובע (uncapped).

תגובת כapping סטנדרטית יכולה להוסיף כיסוי לעד 10 μg של RNA (בגודל 100nt ומעלה). אם יש צורך בביצוע capping לכמות גדולה יותר של RNA, ניתן להגדיל את היקף התגובה בהתאם.

  1. הגדילו את הנפח ל-15 μl באמצעות מים נקיים מנוקלאז (nuclease free water).
  2. חממו את ה-RNA בטמפרטורה של 65 °C למשך 10 דקות כדי להסיר מבנים שניוניים. הניחו על קרח למשך 5 דקות.
  3. להכנת תגובת ה-capping, הוסיפו 2 μl של 10X Capping Buffer,‏ 1 μl של GTP (10 mM),‏ 1 μl של S-adenosyl methionine (2 mM) שדולל טרי, ו-1 μl (10 units) של Vaccinia capping enzyme ל-15 μl של ה-RNA שעבר דנטורציה.
  4. ערבבו היטב באמצעות וורטקס עדין והדגרירו את התגובה ב-37 °C למשך 30 דקות באינקובטור לאוויר יבש.

5. טיהור של RNA עם כובע באמצעות עמודה

  1. טהרו את ה-RNA עם ה-cap באמצעות ה-MEGAclear Kit (ניתן להשתמש בכל ערכה לטיהור RNA המבוססת על עמודי ספינ).
  2. בהתאם להוראות היצרן, העריכו את איכות דגימת ה-RNA באמצעות Agilent RNA 6000 Nano Kit ו-Agilent 2100 Bioanalyzer.

6. טרנספקציית תאי HeLa באמצעות TransIT mRNA Transfection Kit

  1. זריעה של תאי HeLa בלוחית 48-בארים ב-150 μl של Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), High Glucose, המועשר ב-10% fetal bovine serum (בריכוז של 0.7-2.3 × 105 תאים/באר).
  2. דגירה למשך 16-24 שעות ב-37 °C עד להשגת 60-90% התלכדות (confluency) של התאים.
  3. דילול ה-RNA של GLuc (עם כיסוי ובלי כיסוי) ושל CLuc לריכוז של 100 ng/μl.

כל טרנספקציה מבוצעת ב-8 חזרות.

  1. הכינו 8 מבחנות Eppendorf מבחנות. לכל מבחנה הוסף 1 μl RNA של GLuc ללא כיסוי (uncapped), 1 μl RNA של CLuc עם כיסוי (לצורך נורמליזציה) ו- 25 μl של DMEM ללא סרום. ערבב היטב.
  2. הכינו 8 מבחנות Eppendorf. לכל מבחנה הוסיפו 1 μl RNA של GLuc עם כיסוי (אנלוג כיסוי), 1 μl RNA של CLuc עם כיסוי (לצורך נורמליזציה) ו- 25 μl של DMEM ללא סרום. ערבב היטב.
  3. הכינו 8 מבחנות Eppendorf. לכל מבחנה הוסיפו 1 μl RNA של GLuc עם כיסוי (capped)וקסיניה), 1 μl RNA של CLuc עם כיסוי (עבור נורמליזציה) ו- 25 μl של DMEM נטול סרום. ערבב היטב.
  4. הוסף 0.2 μl הוסף mRNA Boost Reagent לסדרה הראשונה של 8 מבחנות וערבב.
  5. הוסף 0.2 μl תרגוםהוסף את ריאגנט ה-mRNA לסט הראשון של 8 מבחנות וערבב.
  6. דגרו בטמפרטורת החדר למשך 2–5 דקות. (אין לדגור למשך יותר מ-5 דקות).
  7. הוסיפו את תערובת הטרנספקציה בטיפות לבאריים המכילים תרביות של תאי HeLa (עיינו איור 3 להכנת המגש).
  8. חזור על שלבים 7 עד 10 עם ה-2נד ו-3rd סטים של 8 מבחנות.
  9. דגרו למשך לילה (16 שעות) ב- 37 °C ב-5% CO2.

7. בדיקת לוקיפראז Gaussia (GLuc)

בצעו בדיקה של הנוזל העליון מכל באער לפעילות GLuc באמצעות ערכה לבדיקת Gaussia Luciferase של BioLux באופן הבא:

  1. הכינו תמיסת בדיקה טרייה על ידי הוספת 15 μl של BioLux GLuc Substrate ל-1.5 ml של BioLux GLuc Assay Buffer (נדרש 50 μl מתמיסת הבדיקה לכל דגימה). הכינו כמות מספקת עבור הדגימות ועבור הכשרת (priming) המזרק של הלומינומטר (עיינו בהוראות היצרן).
  2. ערבבו היטב על ידי היפוך המבחנה מספר פעמים (אין להשתמש ב-vortex).

הלומניסנציה נמדדת באמצעות לומניומטר למיקרו-פלטה מדגם Centro LB 960 מבית Berthold Technologies.

  1. הגדירו את הלומנומטר לנפח הזרקה של 50 μl וזמן אינטגרציה של 2-10 שניות.
  2. הוסיפו 10 μl מהעליי של תרבית התאים מכל באער לתוך פלטה שחורה של 96 באערים.
  3. בצעו הטרייה (Prime) למזרק עם תמיסת הבדיקה והמשיכו במדידת הלומנס (luminescence).
  4. הערכים שיתקבלו מבאערים שלא עברו טרנספקציה ישמשו כביקורות שליליות.

8. בדיקת לוציפראז של Cypridina (CLuc)

מדדו את פעילות ה-CLuc בנוזל העילאי מכל באער באמצעות ערכת BioLux Cypridina Luciferase Assay Kit באופן הבא:

  1. הכן תמיסת מצע (substrate) רקונוסטיטוטית טרייה (100x) בהתאם להוראות המופיעות במדריך של הערכה.
  2. הפשר את ה-BioLux Cypridina Luciferase Assay Buffer וערבב היטב (הגנה מאור).
  3. להכנת תמיסת הבדיקה של CLuc, הוסף 15 μl של המצע הרקונסטיטוטית (100x) ל-1.5 ml של BioLux Cypridina Luciferase Assay Buffer (דרוש 50 μl מתמיסת הבדיקה לכל דגימה). הכן כמות מספיקה עבור הדגימות ועבור הכנת המזרק של הלומינומטר (עיין בהוראות היצרן).
  4. ערבב היטב על ידי היפוך השפופרת מספר פעמים (אין להשתמש ב-vortex).
  5. שמור את התמיסה בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות (הגנה מאור).

הלומינסנציה נמדדת באמצעות לומנימטר למיקרופלייטים מדגם Centro LB 960 מבית Berthold Technologies.

  1. הגדירו את הלומינומטר להזרקה של 50 μl, השהיה של 1-2 שניות ואינטגרציה של 2-10 שניות.
  2. העבירו 10 μl מהנוזל העליון של תרבית התאים מכל באר לפלטה שחורה של 96 בארות.
  3. הכינו את המזרק באמצעות תמיסת ה-CLuc assay ומדדו את הלומינסנציה.
  4. הערכים שיתקבלו מבארים שלא עברו טרנספקציה ישמשו כביקורות שליליות.

9. תוצאות מייצגות

ערכה לסנתזת RNA בתשואה גבוהה באמצעות T7 יכולה להפיק עד 180 μg של RNA ללא כיסוי (uncapped) ו-40 עד 50 μg של RNA עם כיסוי (capped) לכל תגובה של 20 μl. בניתוח באמצעות Agilent 2100 Bioanalyzer, RNA שלם ובאיכות טובה אמור להראות שיא בודד וחד המייצג את תמליל ה-RNA. שיא רחב או מספר שיאים מעידים על דגרדציה של ה-RNA. חשוב גם לוודא את גודל ה-RNA. תמלילי RNA באורך רב מהצפוי עשויים לנבוע מעיכול חלקי של ה-DNA הפלסמידי המשמש כתבנית. דגרדציה של RNA ותשואה נמוכה הן בדרך כלל תוצאה של מזהמים שהוכנסו לתגובה מה-DNA התבניתי. איור 2 הוא דוגמה לאלקטרופורוגרמה ולתמונת ג'ל שהתקבלו לאחר הרצת RNA שלם ובאיכות גבוהה ב-Bioanalyzer.

טרנספקציה של תאי HeLa עם GLuc RNA, הן עם כיסוי (capped) והן ללא כיסוי (uncapped), מלווה בדגירה ובבדיקת תמציות העל של תרבית התאים לפעילות לוסיפראז. מבנה ה-5' cap חשוב להגנה על ה-RNA מפני פירוק על ידי אקסונוקליאז8 ולקידום התחלת התרגום9 של ה-mRNA. לכן, כיסוי של ה-RNA (capping) הוא שלב חיוני בניסויי טרנספקציה. שיטת ה-co-transcriptional (באמצעות אנלוג של ה-cap) מניבה כ-40 μg RNA ש-80% ממנו מכוסה. הפרוטוקול המשתמש באנזים כיסוי של Vaccinia מכסה עד 10 μg RNA (בגודל 100 nt ומעלה) לכל תגובה ביעילות של כמעט 100%.

איור 4 מציג את ההבדל בביטוי לוסיפראז בין תרביות שהועברו להן (transfected) דגימות RNA עם כיסוי (capped) וללא כיסוי (uncapped). ניתן לראות בבירור כי תרביות תאים שהועבר להן RNA עם כיסוי מראות ביטוי גבוה בהרבה של לוסיפראז בהשוואה לאלו שהועבר להם RNA ללא כיסוי (שאינם מראים פעילות לוסיפראז). בנוסף, איור 4 מאשש כי שתי טכניקות הכיסוי, שימוש באנלוג של כיסוי ושימוש באנזים הכיסוי של Vaccinia, מייצרות בהצלחה תמלילי RNA תפקודיים עם כיסוי שיכולים להיתרגם לחלבון. ערך ה-p הדו-זנבי שהתקבל ממבחן t היה 0.2583, דבר המעיד על כך שאין הבדל סטטיסטי מובהק בין נתוני הלומנס (luminescence) משתי שיטות הכיסוי.

דיאגרמה של תעתוק T7; תבנית DNA, תמליל RNA; תהליך רצף נוקלאוטידים.

איור 1A. סינתזת RNA על ידי T7 RNA Polymerase

תרשים מפת פלסמיד של pCMV-GLuc, בגודל 5764 bp; ביטוי גנים, וקטורים לשיבוט, אתרי הגבלה.
איור 1B. וקטור pCMV-GLuc המכיל את הגן GLuc ופרומוטר T7.

תוצאות כרומטוגרפיה של RNA; ניתוח RNA לא חסום לעומת RNA חסום; תרשים אלקטרופורזה.
איור 2. אלקטרופורוגרמות של Bioanalyzer ותמונת ג'ל של RNA חסום ולא חסום. ציר ה-X הוא גודל ה-RNA בנוקלאוטידים (nt) וציר ה-Y מייצג יחידות פלואורסצנציה (FU). A) אלקטרופורוגרמה של mRNA של GLuc (לא חסום) לאחר טיהור. B) אלקטרופורוגרמה של mRNA של GLuc (חסום באמצעות אנזים capping של Vaccinia). C) אלקטרופורוגרמה של mRNA של GLuc (חסום באופן קו-טרנסקריפציונלי באמצעות אנלוג של cap). D) תמונה דמוית ג'ל שהופקה על ידי ה-Bioanalyzer. נתיב 'L' הוא סולם ה-RNA, נתיב 1 הוא mRNA של GLuc לא חסום, נתיב 2 הוא mRNA של GLuc חסום באמצעות אנלוג של cap ונתיב 3 הוא RNA של GLuc חסום באמצעות אנזים capping של Vaccinia.

תרשים פריסת פלטה לניסוי ביטוי גנים; סוגי דגימות: GLuc ו-CLuc ללא כיסוי/עם כיסוי.
איור 3. דוגמה להגדרת פלטה לטרנספקציית תאי HeLa. כל באר מכילה תאי HeLa בדרגת התמזגות (confluency) של 60-90%. לכל באר מתווספת תערובת טרנספקציה המורכבת מ-GLuc RNA המתאים (ללא כיסוי, עם כיסוי באמצעות אנלוג של כיסוי או כיסוי באמצעות אנזים כיסוי של Vaccinia), CLuc RNA עם כיסוי (לצורך נורמליזציה), mRNA Boost Reagent ו- TransIT mRNA Reagent. כל טרנספקציה מבוצעת ב-8 חזרות (בארים בעלות אותו צבע באיור).

תרשים עמודות של לומניסנציה מנורמלת; RNA של GLuc עם כיסוי ובלי כיסוי; תוצאות ניתוח RNA.
איור 4.ביטוי GLuc בתאי HeLa. mRNA של GLuc מנוקה, עם כיסוי ובלי כיסוי, הותסף (transfected) לתאי HeLa ודגר למשך לילה (16 שעות) ב-37 °C. עלי-נוזל (supernatants) של תרבית התאים מכל באער נבחנו לפעילות של GLuc ו-CLuc, וערכי הלומניסנציה נרשמו. ערכי הלומניסנציה של GLuc נורמלו לערכי הלומניסנציה של RNA של CLuc עם כיסוי.

נוסחת יחס לומינסנציית GLuc, מדידת לומינסנציה, משוואה לערכים מנורמלים, RLU.

* לומינסנציה מתאים שאינם טרנספקטיים הופחתה מערכי ה-GLuc וה-CLuc לפני הנורמליזציה.

סימנים מסחריים

BioLux הוא סימן מסחר של New England Biolabs, Inc.

TransIT הוא סימן מסחרי רשום של Mirus Bio LLC.

MEGAclear הוא סימן מסחרי של Ambion.

דיון

In vitro transcription היא שיטה שימושית להשגת תשואות גבוהות של RNA למגוון יישומים. היתרון המרכזי בשימוש בערכה T7 High Yield RNA Synthesis Kit הוא שהרכב שלה עבר אופטימיזציה כדי להשיג תשואות גבוהות של RNA. בנוסף, הרכיבים המסופקים בערכה נקיים מנוקלאזים מזוהמים, מה שמוביל לסינתזה של תמלילי RNA שלמים ובאיכות גבוהה. הערכה תוכננה ליציבות וגמישות גבוהות, כך שניתן להשתמש בה לסינתזה של mRNA, RNA מסומן בצבע, גשים רדיואקטיביים בעלי פעילות סגולית גבוהה ו-RNA עם כיסוי (capped RNA). מדריך הערכה כולל רשימה של פרוטוקולים ספציפיים וחומרים נוספים הנדרשים לכל אחד מהיישומים הללו. הוא כולל גם מידע טכני על שימוש בתוצרי PCR ובאוליגנוקלאוטידי DNA סינתטיים כתבניות לתמלול. חשוב לציין כי ערכת התמלול יכולה להשתמש רק בתבניות DNA המכילות מקדם T7.

השיטה המתוארת במאמר זה מדגימה הוספת כיספת (capping) ל-RNA לאחר השעתוק באמצעות אנזים כיספת של Vaccinia, וכן הוספת כיספת תוך כדי שעתוק (co-transcriptional capping) באמצעות אנלוג למבנה הכיספת של RNA. הראינו כי שתי השיטות מסנתזות RNA בעל כיספת הפעיל תפקודית לאחר טרנספקציה. מבנה הכיספת בקצה '5 משפר את יציבות ה-RNA ואת יעילות התרגום, ולכן הוא חשוב לניסויי מיקרו-הזרקה11 וטרנספקציה7. שיטת הוספת הכיספת תוך כדי שעתוק מייצרת 40-50 μg של RNA עם כיספת בשיעור של כ-80%. חשוב לציין כי שימוש באנלוג לכיספת RNA מסוג 3'-0-Me-m7G(5')ppp(5')G (ARCA), אשר חסום בקצה ה-3'-hydroxyl של ה-m7G, מבטיח שילוב של הכיספת בכיוון הנכון17. כדי להוסיף כיספת לכמויות גדולות יותר של RNA, ניתן להגדיל את היקף התגובות הסטנדרטיות עבור שתי שיטות הכיספת. עם זאת, שימוש במערכת הכיספת של Vaccinia יהיה אפשרון יותר מבחינת עלויות, מכיוון שהוספת כיספת תוך כדי שעתוק עושה שימוש באנלוג לכיספת, שהוא רכיב יקר יחסית. מערכת הכיספת של Vaccinia היא גם שיטה טובה יותר, שכן יעילות הכיספת שלה היא של כמעט 100%.

שיטות ה-RNA capping המתוארות לעיל מסנתזות RNA בעל מבנה cap 0 בקצה ה-5'. מבנה cap 1 כולל מתילציה נוספת בעמדה 2'-O של סוכר הריבוז בנוקלאוטיד הראשון בקצה ה-5' של ה-RNA. דווח כי מבנה ה-cap 1 משפר את יעילות התרגום של ה-RNA18 וניתן להטמיעו באמצעות 2'-O-Methyltransferase20, 21.

ניתן להשתמש בשיטה המתוארת במאמר זה כדי לבצע תמלול (transcribe), הוספת כיפה (cap) והחדרה (transfect) של כל mRNA רצוי. הלוסיפראזים GLuc ו-CLuc שימשו באופן ספציפי בפרוטוקול זה בשל יתרונותיהם הרבים. הם מופרשים ישירות אל מצע התרבית של התאים, ובכך נמנע הצורך בליסיס של התאים. כמו כן, הם מייצרים עוצמת אות ביו-לומנסנס גבוהה, ובדיקות הפעילות שלהם רגישות מאוד וקלות לביצוע. חשוב לציין כי הביטוי של GLuc בתאים עשוי להיות מושפע מגורמים שונים מלבד התפקוד של ה-RNA עצמו. מספר דוגמאות כוללות שגיאות פיפטינג, מספר תאים משתנה לכל באר, יעילות ההחדרה וכו'. נורמליזציה של הנתונים משמשת כדי להתחשב בגורמים אלה. בפרוטוקול שלנו, אנו מבצעים co-transfection של RNA של CLuc כבקרת פנימית יחד עם ה-RNA של GLuc. כאשר מחלקים את הלומנסנס של GLuc בערכי הבקרה של CLuc, מתבצעת נורמליזציה לשגיאות ולשונות ביעילות ההחדרה19.

גילויים

כל המחברים הם עובדים של New England Biolabs, Inc.

תודות

דונגשיאן יואו, ברט רוב, ג'ורג' צרציניס, טניה בהטיה, ברטון הורנבלוואר.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
ערכה להסנתזת RNA בתפוקה גבוהה באמצעות T7New England BiolabsE2040S
3’-0-Me-m7G(5’(ppp(5’אנלוג למבנה ה-RNA Cap New England BiolabsS1411S
DNase I (נקי מ-RNase)New England BiolabsM0303S
מערכת כביעה של VacciniaNew England BiolabsM2080S
ערכה MEGAclearAmbionAM1908
ספקטרופוטומטר NanoDropThermo Fisher Scientific, Inc.
Agilent RNA 6000 Nano KitAgilent Technologies5067-1511
Agilent 2100 BioanalyzerAgilent TechnologiesG2939AA
<מיקרוסקופיה אלקטרונית חולמית (EM)>תרגםערכה להעברת mRNA (טרנספקציה) בתאי T Mirus Bio LLCMIR2250
HyClone* Classical Liquid Media: Dulbecco’mEagle השונה (Modified Eagle)’מצע, גלוקוז גבוהThermo Fisher Scientific, Inc.SH30285.01
חומצות אמינו לא חיוניות של HyCloneThermo Fisher Scientific, Inc.SH30238.01
Centro LB 960 Berthold Technologies
BioLux<מיקרוסקופיה אלקטרונית (EM)> Gaussia ערכה לבדיקת לוסיפראז (Luciferase Assay Kit)New England BiolabsE3300S
BioLux <מיקרוסקופיה אלקטרונית (EM)>Cypridina ערכה לבדיקת לוסיפראז (Luciferase Assay Kit)New England BiolabsE3309S
מעכב RNase, עכברי New England BiolabsM0314
מעכב RNase, שליה אנושיתNew England BiolabsM0307
pCMV-GLuc פלסמיד בקרהNew England BiolabsN8081

מקורות

  1. Lazarev, D., Manley, J. L. Concurrent splicing and transcription are not sufficient to enhance splicing efficiency. RNA. 13, 1546-1557 (2007).
  2. Donze, O., Picard, D. RNA interference in mammalian cells using siRNAs synthesized with T7. RNA Polymerase. Nucl. Acids Res. 30, 10-46 (2002).
  3. Van Gelder, R. N. Amplified RNA synthesized from limited quantities of heterogeneous cDNA. Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 87, 1663-1667 (1990).
  4. Schneider, J. Systematic analysis of T7 RNA polymerase based in vitro linear RNA amplification for use in microarray experiments. BMC Genomics. 5, 29-29 (2004).
  5. Conry, R. M. Characterization of a messenger RNA polynucleotide vaccine vector. Cancer Research. 55, 1397-1400 (1995).
  6. Huang, F., Wang, G., Coleman, T., Li, N. Synthesis of adenosine derivatives as transcription initiators and preparation of 5′ fluorescein- and biotin-labeled RNA through one-step transcription. RNA. 9, 1562-1570 (2003).
  7. Warren, L. Highly efficient reprogramming to pluripotency and directed differentiation of human cells with synthetic modified mRNA. Cell Stem Cell. 7, 618-630 (2010).
  8. Furuichi, Y., LaFiandra, A., Shatkin, A. J. 5'-Terminal structure and mRNA stability. Nature. 266, 235-239 (1977).
  9. Topisirovic, I., Svitkin, Y. V., Sonenberg, N., Shatkin, A. J. Cap and cap binding proteins in the control of gene expression. Wiley Interdisciplinary Reviews. 2, 277-298 (2011).
  10. Lewis, J. D., Izaurflde, E. The Role of the Cap Structure in RNA Processing and Nuclear Export. Eur. J. Biochem. 247, 461-469 (1997).
  11. Inoue, K., Ohno, M., Sakamoto, H., Shimura, Y. Effect of the cap structure on pre-mRNA splicing in Xenopus oocyte nuclei. Genes Dev. 3, 1472-1479 (1989).
  12. Martin, S. A., Paoletti, E., Moss, B. Purification of mRNA guanylyltransferase and mRNA (guanine 7-)methyltransferase from vaccinia virus. J. Biol. Chem. 250, 9322-9329 (1975).
  13. Martin, S. A., Moss, B. Modification of RNA by mRNA guanylytransferase and mRNA (guanine-7-)methyl-transferase from vaccinia virions. J. Biol. Chem. 250, 9330-9335 (1975).
  14. Shuman, S., Moss, B. Purification and use of vaccinia virus mRNA capping enzyme. Meth. Enzymol. 181, 170-180 (1990).
  15. Thiel, V., Herold, J., Scelle, B., Siddell, S. G. Infectious RNA transcribed in vitro from a cDNA copy of the human coronavirus genome cloned in vaccinia virus. J. Gen. Virol. 82, 1273-1281 (2001).
  16. Marcotrigiano, J., Gingras, A. -C., Sonenberg, N., Burley, S. K. Cocrystal Structure of the Messenger RNA 5′ Cap-Binding Protein (eIF4E) Bound to 7-methyl-GDP. Cell. 89, 951-961 (1997).
  17. Stepinski, J. Synthesis and properties of mRNAs containing the novel "anti-reverse" cap analogs 7-methyl (3'-O-methyl)GpppG and 7-methyl (3'-deoxy) GpppG. RNA. 7, 1486-1495 (2001).
  18. Kuge, H., Brownlee, G. G., Gershon, P. D., Richter, J. D. Cap ribose methylation of c-mos mRNA stimulates translation and oocyte maturation in Xenopus laevis. Nucl. Acids Res. 26, 3208-3214 (1998).
  19. Schagat, T., Paguio, A., Kopish, K. Normalizing Genetic Reporter Assays: Approaches and Considerations for Increasing Consistency and Statistical Significance. Cell Notes. 17, 9-12 (2007).
  20. Barbosa, E., Moss, B. mRNA (nucleoside-2'-) - methyltransferase from Vaccinia Virus. J. Biol. Chem. 253, 7698-7702 (1978).
  21. Lockless, S. W. Recognition of capped RNA substrates by VP39, the vaccinia virus-encoded mRNA cap-specific 2'-O-methyltransferase. Biochemistry. 37, 8564-8574 (1998).

הדפסות חוזרות והרשאות

גלה מאמרים נוספים

כapping של RNAערכה לסנתזה של RNA ביבול גבוה באמצעות T7אנזים Capping של Vacciniaשיטת אנלוג Capבדיקת פעילות לוסיפראזטיהור RNAכימות באמצעות NanoDrop
בתעתיק במבחנה תקרת של mRNA בלוציפראז Gaussia ואחריו transfection Cell הלה
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.