זיהוי ואפיון של חלבונים באמצעות glycosylation ספציפי אנדו ו exoglycosidases

Summary

שימוש glycosidases ספציפי להסיר סוכרים מן גליקופרוטאינים ואחריו SDS-PAGE היא שיטה ערך כדי לזהות שינויים glycan על דגימות חלבון היא בחירה טובה עבור מחקרים glycobiology הראשונית. השינויים הבאים deglycosylation ניתן לאתר כמו משמרות ניידות ג'ל או מכתים עם ריאגנטים רגיש glycan.

Abstract

Glycosylation, תוספת של סוכרים קשורים קוולנטית, הוא שינוי חשוב שלאחר translational של חלבונים יכול להשפיע באופן משמעותי על תהליכים כגון הידבקות התא, סחר מולקולרית, אישור, ואת הולכת אותות ^1-4. ב אאוקריוטים, את השינויים glycosylation הנפוץ ביותר במסלול הפרשה הן תוספות ב asparagine שאריות הקונצנזוס (N-linked); או סרין או תראונין שאריות (O-linked) (איור 1). ייזום סינתזה של N-glycan נשמרת מאוד אאוקריוטים, בעוד מוצרי קצה יכולים להשתנות במידה רבה בין המינים, רקמות שונות, או חלבונים. Glycans חלקם יישארו ללא שינוי ("גבוה מנוז N-glycans") או עיבוד נוסף של Golgi ("מורכב N-glycans"). המגוון הגדול נמצא עבור O-glycans, אשר מתחיל עם משקע משותף (GalNAc) N-Acetylgalactosamine בתאים חיים, אך נבדלים אורגניזמים נמוכה ^1. אף אוזן גרון "> ניתוח מפורט של glycosylation של חלבונים הוא תחום בפני עצמו ודורש משאבים רבים ומומחיות כדי לבצע כראוי. עם זאת מגוון רחב של אנזימים זמין להסיר סוכרים (glycosidases) מאפשר לקבל מושג כללי על המצב של glycosylation . חלבון במעבדה הגדרה סטנדרטית כאן אנו מדגימים את השימוש glycosidases לניתוח גליקופרוטאין מודל:. רקומביננטי גונדוטרופין כוריוני אנושי בטא (hCGβ), אשר מחזיקה שני N-glycans וארבעה O-glycans ⁵ הטכניקה פשוטה דורשת רק מכשור וחומרים מתכלים טיפוסי, והוא יכול להתאים בקלות ניתוח של דגימות גליקופרוטאין מרובים.

מספר אנזימים יכול לשמש במקביל מחקר גליקופרוטאין. PNGase F הוא מסוגל להסיר כמעט את כל סוגי N-linked glycans ^6,7. עבור O-glycans, אין אנזים זמין לדבוק יכול oligosaccharide שלמים מתוך הדואר עמוד השדרה חלבון. במקום זאת, O-glycans הם גזומים ידי exoglycosidases לליבה קצר, אשר לאחר מכן להסיר בקלות על ידי Glycosidase-O. מערבבים Deglycosylation חלבון מכיל PNGase F, O-Glycosidase, neuraminidase (sialidase), β1-4 Galactosidase, ו β-N-Acetylglucosaminidase. הוא משמש בו זמנית להסיר N-glycans וכמה O-glycans ^8. לבסוף, מערבבים את Deglycosylation נוספו בתערובת של exoglycosidases אחרים (α-N-Acetylgalactosaminidase, α1-2 Fucosidase, α1-3, 6 Galactosidase ו β1 Galactosidase-3), אשר מסייעים להסיר מונוסכרידים עמידים אחרת זה יכול להיות נוכח בטוח O-glycans.

SDS-PAGE/Coomasie הכחול משמש כדי להמחיש הבדלים הגירה חלבון לפני ואחרי הטיפול glycosidase. בנוסף, סוכר ספציפי שיטה מכתים, ProQ אמרלד-300, מראה אות פחתה כפי glycans הם succeהוסר ssively. פרוטוקול זה מיועד לניתוח של כמויות קטנות של גליקופרוטאין (0.5-2 מיקרוגרם), למרות deglycosylation האנזימטית וניתן לשנותם עד כדי להכיל כמויות גדולות יותר של חלבון לפי הצורך.

Protocol

1. אנזימתי deglycosylation

1. השתמש צינורות PCR כדי להקטין את איבוד המים בשל התאדות. תווית אחת מערכת של צינורות 1-7.
2. ההפשרה חיץ G7 10X, 10X החיץ גליקופרוטאין denaturing, ושל 10% NP-40 ו לטפוח בעדינות את הצינורות כדי לערבב את תוכנו. שמור בטמפרטורת החדר.
3. מניחים את האנזים בקבוקונים המכילים על הקרח. נסו למזער את ההפשרה / ההקפאה מחזורים.
4. ממיסים את תכולת הבקבוקון hCGβ (150 מיקרוגרם) ב 600 μl של DH ₂ O ולשמור על הקרח.
5. הכן 1 מ"ל של חיץ 1X G7 על ידי דילול המניות 10X ב DH ₂ O.
6. מדולל 0.5 μl של PNGase F במאגר μl 25 G7 1X ולשמור על הקרח.
7. מכינים את תערובת exoglycosidase (EG לערבב) על ידי שילוב של 2 μl כל α-N-Acetylgalactosaminidase, α1-2 Fucosidase, β1 Galactosidase-3, ו α1-3, 6 Galactosidase.
8. הגדרת צינורות PCR כמצוין:

AK ">

Tube / מדגם #	1	2	3	4	5	6	7
hCGβ (0.25mg/ml)	9μl	9μl	9μl	9μl	-	-	-
גליקופרוטאין 10X Denaturing הצפת	1μl	1μl	1μl	1μl	1μl	1μl	1μl
DH 2 O	-	-	-	-	9μl	9μl	9μl

9. שווי הצינורות, מערבבים בעדינות ומניחיםthermocycler, לסגור את המכסה לפגל את החלבונים על ידי דוגרים 10 דקות 94 ° C, ואחריו להחזיק 4 מעלות צלזיוס (באמצעות צינורות PCR ב thermocycler מאוד ומונע אידוי בדגימות נפח קטן).
10. הסר את הצינורות מן thermocycler ו צנטריפוגות כדי להסיר כל התעבות גלוי.
11. מוסיפים את ריאגנטים הבאים כמצוין:

לדוגמה #	1	2	3	4	5	6	7
10% NP-40	2.5μl	2.5μl	2.5μl	2.5μl	2.5μl	2.5μl	2.5μl
מאגר ה-G7 10X	2.5μl	2.5μl	2.5μl	2.5μl	2.5μl	2.5 & mu; L	2.5μl
PNGase F 1:50 דיל.	-	2μl	-	-	2μl	-	-
Deglycosylation Mix	-	-	2μl	2μl	-	2μl	2μl
לערבב EG	-	-	-	2μl	-	-	2μl
DH 2 O	10μl	8μl	8μl	6μl	8μl	8μl	6μl
התגובה סך vol.	25 μ l	25 μ l	25 μ l	25 μ l	25 μ l	25 μ l	25 μ l

12. סגור את הצינורות באמצעות PCR כובעים חדשים (להשליך את אלה המשמשים מאז הם לא מתאימים כמו שצריך אחרי מחזור אחד הדגירה).
13. מערבבים בעדינות את הצינורות על ידי הקשה 4 פעמים ואז לסובב את התוכן כלפי מטה.
14. מניחים את צינורות thermocycler ו לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 4 שעות לאחר מכן לקרר את דגימות עד 4 ° C.

2. SDS-PAGE של דגימות deglycosylated

1. הכן 130 μl טרי חיץ 3X הפחתת SDS טוען ידי הוספת 4 μl של DTT 1.25M.
2. הוסף 12.5 μl של החיץ מוכן 3X SDS הפחתת העמסה לטעום כל אחד.
3. סגור את הצינורות עם כובעים חדשים לטפוח בעדינות את הצינורות כדי לערבב.
4. דגירה צינורות thermocycler על 94 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות ולאחר מכן לצנן עד 4 ° C.
5. טען 30 μl של המדגם כל 10 μl של הסמן חלבון על ג'ל טריס-גליצין 10-20%. שמור את שארית המדגם עבור חלק 3.1. טען 10μl של דה מרקר ColorPlus חלבון Prestained.
6. Electrophorese את הג'ל על 130 וולט בטמפרטורת החדר עד הכניסה לצבוע קרוב לתחתית הג'ל.
7. כאשר ג'ל סיימה ריצה, להסיר את הג'ל של השחקנים ולמקם אותו בתוך קופסת פלסטיק קטנה עם מספיק Coomasie כתם כחול על מנת לכסות את הג'ל.
8. הכתם ג'ל למשך שעה 1 עם תסיסה עדינה.
9. שטפו את הג'ל שלוש פעמים במשך 30 דקות ב 50 מ"ל של תמיסת destain.
10. הקלט את התמונות באמצעות transilluminator אור לבן או סורק. לחלופין, ג'ל יכול להיות מיובש בין דפי צלופן בתוך מסגרת.

3. Pro-Q אמרלד 300 לגילוי של חלבונים glycosylated ב SDS-PAGE ג'לים

1. במקביל הג'ל ב 2.1), עומס יתר של הדגימות על הג'ל טריס-גליצין 10-20%. טען 10 & mu; L של דה מרקר חלבון ColorPlus Prestained.
2. בעוד הג'ל פועל לפרק את מגיב Pro-Q אמרלד עם DMF ולהכין את תקן מלאי, שטפי ואת חמצון פתרונות אמרלד Pro-Q 300 כתם הבאים במדריך מוצר המסופק עם הערכה.
3. כאשר אלקטרופורזה תושלם, להסיר את הג'ל מתוך יצוק למקם אותו בתוך קופסת פלסטיק.
4. תקן את הג'ל על ידי הוספת 100 מ"ל של הפתרון לתקן ולהשאיר אותו לילה בטמפרטורת החדר עם תסיסה עדינה.
5. שטפו את הג'ל עם 100 מ"ל של הפתרון לשטוף עבור 10 עד 20 דקות בטמפרטורת החדר בהתרגשות גוי. חזור על לשטוף עם פתרון לשטוף טריים.
6. לחמצן את הפחמימות על ידי דוגרים את הג'ל עם תסיסה עדינה במשך 30 דקות ב 25 מ"ל של חמצון פתרון.
7. שטפו את הג'ל כמתואר בשלב 3.5.
8. בעוד הוא ג'ל כביסה להכין טרי Pro-Q אמרלד 300 כתם על ידי הוספת 500 μl של הפתרון Pro-Q 300 מגיב אמרלד מומס צעד 3.2 ל 25 מ"ל שלמכתים חיץ המסופק בערכה.
9. הכתם ג'ל על ידי הוספת 25 מ"ל של הכתם מוכן בשלב 3.8 ו דוגרים בחושך עם תסיסה עדינה במשך 90 עד 120 דקות.
10. חזור על שני השלבים המתוארים לשטוף צעד 3.5.
11. הקלט את התמונות עם transilluminator UV ב 300nm. השתמש בסמן 80 kDa, אשר מסומן עם Pro-Q אמרלד גרין, לחפוף את התמונה UV לתמונה אור לבן של הג'ל המציגה את הסולם prestained.
12. השווה את התמונות של הג'ל מוכתם Coomasie בשלב 2.10 עם ג'ל האזמרגד Pro-Q מוכתם משלב 3.11.

4. נציג תוצאות

השינויים הגירה חלבון לאחר deglycosylation האנזימטית מוצגות באיור 2. השווה את מדגם הביקורת (לוח א ', מסלול 1) עם הטיפול F PNGase (הסרת N-glycans, מסלול 2), מערבבים Deglycosylation (PNGase F; פלוס אנדו ו exoglycosidases להסיר O-glycans, מסלול 3). הפחתה נוספת לאבגודל נתפס לאחר עיכול עם glycosidases נוספים (מסלול 4). מלבד שינוי המוני, להקות להיות חדה כמו glycans יוסרו. הלהקה פועלת תחת סמן 17 kDa (כוכבית) מייצג את (MW: 16 KDA) deglycosylated מלא hCGβ פוליפפטיד. להקות אחרות שאולי נובעות deglycosylation שלם או את החלבונים מזוהה מרובים הנוכחי במדגם hCGβ (ראה מסלול 1). Lanes 5-7 (שולטת) להראות את להקות המתאימים glycosidases.

מכתים גליקופרוטאין ידי אמרלד גרין מוצג בלוח זה ב מגיב oxidizes וכתמים כל glycans נוכח מולקולת חלבון. לכן עוצמת האות יורדת ככל hCGβ הוא deglycosylated enzymatically (מסלול 1 לנתיב 4). האות שיורית במסלולים 3 ו -4 להעיד על נוכחות של מוטיבים glycan, אשר עמידים בפני אנזימים בשימוש. Glycosidases נוספים המשמשים במסלול 4 להסיר שאריות כמה סוכר נוסף: ההגירה חלבון זהה, אבלירידה קלה בעוצמה של מכתים ניתן לראות. Moieties סוכר עמיד לא נכחו כל מיני חלבון: כמה להקות לא היו מזוהים על ידי אמרלד גרין (נעדר בתמונה UV, בסוגריים), המציין שהם deglycosylated בהרחבה. נתונים נוספים תומכים למסקנה hCGβ glycosylated הוא הטרוגני. הלהקה נמוך על מסלול 2 (חץ) הוא קלוש על התמונה אמרלד גרין, בעוד הלהקה העליון על מסלול 2 הוא בהיר, המציין כי הרבה קבוצות glycans עדיין קיימות. נתונים אלו מחזקים את המסקנה כי hCGβ רקומביננטי לידי ביטוי בתאים העכבר מכיל glycoforms מספר ^9. אלה glycoforms שונים הן בשל ההטרוגניות הטבועה glycosylation שם כמה פוליפפטידים לא מקבלים glycan בכל אתר הסכמה ו / או כמה glycans מורחבות וחלקם אפילו על אותו חלבון לא.

באיור 1.Glycosylation דפוסים אופייניים המופרשים או גליקופרוטאינים על פני קרום התא.

2. איור SDS-PAGE ג'לים מראה deglycosylation האנזימטית של hCGβ. לוח מראה כתמים כחולים Coomasie תוך לוח B מראה את התוצאות של Pro-Q אמרלד 300 עבור להדמיה של חלבונים glycosylated. מספר דוגמאות: 1, שליטה hCGβ; 2, PNGase F העיכול; 3, מערבבים העיכול Deglycosylation: 4, מערבבים Deglycosylation פלוס עיכול exoglycosidases, דגימות 5-7 הם שולטת מגיב (O-Glyc, O-Glycosidase; GNA, β-N -Acetylglucosaminidase; Fucosidase גל / Fuc, β1-3 Galactosidase, α1-3, 6 Galactosidase ו α1-2; GalNA, α-N-Acetylglalactosaminidase; Neu, neuraminidase; PNGase; F PNGase)

Discussion

השיטה המתוארת כאן על ידי שימוש deglycosylation האנזימטית SDS-PAGE יכול לספק מידע רב ערך על מצב glycosylation של חלבון של עניין, בעוד glycan ספציפי ריאגנטים להקל על הפרשנות של הנתונים. פרוטוקול זה מיועד המחקרים הראשוניים של glycosylation חלבון זה מתאים במיוחד עבור הפרשה ואת גליקופרוטאינים בממברנה של בתאי יונקים: האנזימים נבחר במקרה הזה יהיה דווקא להסיר את כל N-glycans, ו או N-glycans פלוס ואת סוכרים הנפוצים ביותר הארכת ויוצרים הליבה של O-glycans. Glycosidases יש את היתרון הנוסף של להיות קלה, בהשוואה לשיטות deglycosylation כימיים, תוך שמירה על שלמות עמוד השדרה הן סוכרים וחלבונים.

כדי להבהיר את תפוסת (אשר חומצות אמינו הן glycosylated), היקף glycosylation, או על מנת לקבוע את המבנה העדין של glycans, טכניקות מתוחכמות יותר, כגון מ 'ספקטרומטריית התחת, כרומטוגרפיה נוזלית או NMR נדרשים.

בגלל הפשטות שלו, מספר צעדים בפרוטוקול זה יכול להיות מותאם, להחליף ו / או בשילוב כדי להתאים לצרכים ניסיוניים שונים. עם זאת, על מנת להשיג תוצאות כי ניתן לפרש בבירור חשוב להבין את נקודות החוזק שלו ואת המגבלות. ראשית, סגוליות וטוהר glycosidases הם קריטיים: אנזימים היטב מאופיין רק נבדק להשתחרר פרוטאזות ופעילויות מזהמים אחרים יש להשתמש. למרבה הצער, אין תקן יחידת אנזים הגדרה glycosidases: המשתמש צריך לקבוע את התחליף המתאים על פי מפרט של היצרן. שנית, בחירה זהירה של זיהוי צורך: א) מכתים ריאגנטים חלבון שימושיים רק אם תוצאות deglycosylation בשינוי משמעותי מסה מולקולרית. תוצאה כזו ברורה כפי שמוצג כאן לא מתקבל תמיד. במקרים אחרים, שראינו mi נורמליgration לאחר deglycosylation (רחוק משקל מולקולרי חזה, או אפילו הגירה איטי יותר). תופעה זו אינה מובנת היטב, אך ניתן לומר כי כל שינוי הגירה ראיות כי החלבון כבר deglycosylated. ב) זיהוי סוכר עם נוגדנים מציבה אתגרים ייחודיים הגבלת התחולה שלהם. זה כבר קשה מאוד כדי ליצור כללי אנטי glycan נוגדנים, הם גדלים בדרך כלל נגד יעד glycan מורכבים, אשר מגבילה את השימוש בהם. יתר על כן, מספר חד שבטיים נוגדנים נגד glycan להציג תגובתיות לחצות רצויים ^10. ג) לקטינים (חלבונים עם סוכר זיקה מהותית) מתאימים היטב לאיתור סוכר, ובנוסף הם נותנים תובנה על מבנה glycan. עם זאת, לא כולם יש סגוליות צר; רבים מאופיינים באופן חלקי בלבד (כלומר, הם יכלו זיקות לא ידוע). בתור מכתים חיובי תוצאה מספקת לקטינים, אינדיקציה לא הוכחה, נוכחותם של given סוכר. ד) ערכות כימית תיוג (מבוסס על periodate חמצון של סוכרים) הן את שיטת הבחירה להכתים את כל גליקופרוטאינים, ומתאים וכך גם לעקוב deglycosylation.

כאשר עיבוד מדגם לא ידוע, זהו תרגול טוב כדי לכלול שולטת גליקופרוטאין. Fetuin הוא N זמינים - ו - O-גליקופרוטאין, גונדוטרופין כוריוני (הן יחידות משנה) היא גם בחירה טובה. שור אלבומין (BSA) יכול לשמש כביקורת שלילית. עם זאת, יש לציין כי חלק לא glycosylated חלבונים להגיב עם מעט אמרלד Pro-Q 300, במיוחד כאשר נעשה שימוש בריכוזים גבוהים. Non-glycosylated סטנדרטים משקל מולקולרי, כגון סמן את החלבון prestained שימוש בפרוטוקול זה, יש את היתרון של הצגת להקות חדה. רק במקרה אחד של החלבונים האלה (80 KDA) תגובתי Pro-Q אמרלד 300. לכן, ייתכן שהמשתמש רוצה להפעיל סולם רגיל גליקופרוטאין במקום, כמו קנדי ​​מ-Cane Invitrogeהערה

לבסוף, זיהוי פשוט ג'ל של גליקופרוטאינים nucleocytosolic (אשר שונה עם אחד O-GlcNAc) אפשרי עם שימוש של נוגדנים חד שבטיים, יחד β-N-Acetylglucosaminidase שליטה סגוליות ^11. התיאור של טכניקה זו היא מעבר היקפו של מאמר זה, אבל זה צריך להיות כאמור glycosidases הם כלי שימושי לחקר גליקופרוטאינים אחרים glycoconjugates רבים הנמצאים בתאים. טיפול מקיף של כל הצורות הידועות של glycosylation ניתן למצוא במהדורה השנייה של "יסודות של glycobiology"; מקוון חינם בכתובת מדף הספרים צמח השדה (ID Bookshelf: NBK1908; PMID: 20301239) ^12.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
שם מגיב	חברה	מספר קטלוגי	תגובות
האדם β גונדוטרופין כוריוני	סיגמא אולדריץ'	C6572
מנורות ה-PCR	VWR	20170-004
PCR Thermocycler	Applied Biosystems	4359659
PNGase F	ניו אינגלנד Biolabs	P0704	מסופקים עם חוצצי
Deglycosylation חלבון מערבבים	ניו אינגלנד Biolabs	P6039	מסופקים עם חוצצי
α-N-Acetylglalactosaminidase	ניו אינגלנד Biolabs	P0734	מסופקים עם חיץ
α1-2 Fucosidase	ניו אינגלנד Biolabs	P0724	מסופקים עם חיץ
α1-3, 6 Galactosidase	ניו אינגלנד Biolabs	P0731	מסופקים עם חיץ
β1-3 Galactosidase	ניו אינגלנד Biolabs	P0726	מסופקים עם חיץ
מאגר 10X ה-G7 (500 סודיום פוספט mM)	ניו אינגלנד Biolabs	---	מסופקים עם PNGaseF או Degl Mix
גליקופרוטאין הצפת 10X Denaturing (5% SDS, 400 מ"מ DTT)	ניו אינגלנד Biolabs	---	מסופקים עם PNGaseF או Degl Mix
10% NP-40	ניו אינגלנד Biolabs	---	מסופקים עם PNGaseF או Degl Mix
3X SDS טוען חיץ (187.5 mM טריס-HCl pH 6.8, SDS 6%, 30% גליצרול, ברום 0.03%ophenol כחול)	ניו אינגלנד Biolabs	B7703	מסופקים עם 1.25M DTT
ColorPlus Prestained מרקר חלבון	ניו אינגלנד Biolabs	P7709
10-20% טריס-גליצין Multigel	קוזמו ביו ושות	DCB-414893
אלקטרופורזה קלטת יחידה	קוזמו ביו ושות	DCB-303111
Power Supply אלקטרופורזה EPS 301	GE Healthcare	18-1130-01
Pro-Q אמרלד 300 גליקופרוטאין כתמים Kit	Invitrogen	P-21857
בריליאנט בלו R	סיגמא אולדריץ'	B0149
AlphaImager HP System	תא Biosciences	92-13823-00