Method Article

ניתוח הפנמה נייד של חלקיקים וחיידקים על ידי Cytometry Multi-Flow דימות ספקטרלי

DOI:

10.3791/3884

⸱

June 8th, 2012

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Veterinary Microbiology and Preventive Medicine, Iowa State University, 2Amnis Corporation, 3Department of Chemical and Biological Engineering, Iowa State University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

במאמר זה, אנו מתארים את שיטת ניצול רב רפאים זרימת cytometry הדמיה לכמת את ההפנמה של חלקיקים polyanhydride או חיידקים של 264.7 תאים הגלם.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מערכות nanoparticulate התפתחו כמו כלים יקרי ערך במתן חיסון דרך יכולתם יעיל לספק המטען, כולל חלבונים, לתאים מציגי אנטיגן 1-5. ההפנמה של חלקיקים (NP) על ידי תאים מציגי אנטיגן הוא שלב קריטי ביצירת תגובה חיסונית יעילה אנטיגן כמוס. כדי לקבוע כיצד שינויים בתפקוד ניסוח nanoparticle השפעה, ביקשנו לפתח קצב העברת נתונים גבוה, פרוטוקול הניסוי הכמותי שהיה תואם גילוי חלקיקים פנימיים כמו גם חיידקים. נכון להיום, שתי טכניקות עצמאיות, מיקרוסקופיה cytometry זרימה, היו האמצעים שננקטו כדי ללמוד phagocytosis של חלקיקים. טבע קצב העברת נתונים גבוה של זרימת cytometry מפיק נתונים סטטיסטיים חזקים. עם זאת, בשל ברזולוציה נמוכה, הוא אינו מדויק לכמת הפנימו לעומת חלקיקים הנכנס סלולריים. מיקרוסקופיה מייצר תמונות עם רזולוציה מרחבית גבוהה, However, זה זמן רב וכרוכה גודל מדגם קטן 6-8. רב רפאים הדמיה תזרים cytometry (MIFC) היא טכנולוגיה חדשה המשלבת היבטים של מיקרוסקופיה והן cytometry זרימה שמבצע רב בתחום ספקטרלי צבע דימות פלואורסצנטי ובהיר בו זמנית דרך הליבה למינרית. יכולת זו מספקת ניתוח מדויק של עוצמת אות ניאון ומערכות יחסים מרחביים בין מבנים שונים ותכונות סלולריות במהירות גבוהה.

במסמך זה אנו מתארים שיטת ניצול MIFC לאפיין את אוכלוסיות תאים אשר הפנימו חלקיקים polyanhydride או סלמונלה enterica serovar Typhimurium. כמו כן, אנו מתארים את הכנת תרחיפים nanoparticle, תיוג התא, רכישת במערכת ImageStream X וניתוח של נתונים באמצעות יישום רעיונות. יש לנו גם להדגים את היישום של השיטה, שניתן להשתמש בהם כדי להבדיל עמ 'הפנמהathways עבור חלקיקים וחיידקים באמצעות cytochalasin-D כמעכב של phagocytosis אקטין בתיווך.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. תא RAW 264.7 תרבות

  1. הגלם קציר 264.7 תאים צלוחיות שלהם כאשר הם מגיעים confluency ידי גירוד אותם בעדינות עם מגרד התא. הרוזן ואת צלחת אותם מנה 24 גם תא התרבות בצפיפות של 5 x 10 5 תאים / גם ב 0.5 בינוני מלא מ"ל שינוי הנשר של Dulbecco (cDMEM: 10% חום מומת בסרום שור עוברית (FBS), 2 מ"מ Glutamax, ו 10 מ"מ) HEPES דגירה של לילה ב 37 מעלות 5% CO 2 באינקובטור.

2. סלמונלה פתוגניים enterica Serovar Typhimurium 14028 טרנספורמציה והתרבות

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקרים הראו כי חלקיקים מתכלה על בסיס חומצה פולי לקטית-Co-גליקולית ((PLGA) או polyanhydrides ניתן להשתמש כדי לספק אנטיגנים כמוס או תרופות לתאי מטרה. הספיגה של חלקיקים אלה על ידי תאים phagocytic חשוב האפקטיביות שלהם, ובכך כמותית . ניתוח של הפנמה קריטי בעיצוב nanoparticle הרומן מערכות אספקת ידי שימוש בשיטה זו, ספיגת ההפרש של חלקיקים על ידי סוגי תאים שונים ניתן לנתח בקלות עד כה, מיקרוסקופיה קונבנציונאלי cytometry זרימת שימשו לכימות ספיגת החלקיקים,. עם זאת, כל אחד מהם מגבלות עם תפוקה ג.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

לחבר Sherree ל מועסק על ידי Amnis Corporation, המייצרת את מערכת X ImageStream.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מבקשים להודות פרס ONR-Muri (NN00014-06-1-1176) של צבא ארה"ב למחקר רפואי ואמצעי פיקוד (במדבר גרנט W81XWH-09-1-0386 ו W81XWH-10-1-0806) עבור כספי תומכים.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
שם מגיב חברה מספר קטלוגי תגובות
תא RAW 264.7 קו סוג האמריקאי תרבות אוסף (ATCC) TIB-71
Dulbecco של שינוי הנשר בינוני (DMEM) Cellgro 10-013-CV
בסרום שור עוברית אטלנטה ביולוגיות S 11150 Premium Grade
Glutamax Gibco 35050-061
HEPES Gibco 15630-080
24 גם צלחת TPP 92024
תרבית תאים צלוחיות TPP 90151
תא מגרד TPP 99002 24 ס"מ
סלמונלה enterica serovar Typhimurium ATCC 14028
BTX ECM630 תא אלקטרו Manipulator BTX הרווארד Apparatus
מגבים פישר סיינטיפיק BP308
פוספט בופר סליין (PBS) Cellgro 21-040-CV
מעבד נוזל קולי MISONIX S-4000
Cytochalasin-D Sigma-Aldrich, C8273
פורמלדהיד Polysciences 04018
לשטוף את החיץ החום FBS 2% מומת, אזיד הנתרן 0.1% ב PBS.
פן / לשטוף חיץ BD Biosciences 554714
ברור להציג שווי microtubes הצמד סיגמא T4816
Alexa פלואוריד phalloidin 660 Invitrogen A22285
ImageStream X Amnis Corporation 100200 אפשרויות: 658nm לייזר, autosampler
אזיד הנתרן פישר סיינטיפיק S-500 227I

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ulery, B. D., Kumar, D., Ramer-Tait, A. E., Metzger, D. W., Wannemuehler, M. J., Narasimhan, B. Design of a protective single-dose intranasal nanoparticle-based vaccine platform for respiratory infectious diseases. PLoS One. 6, e17642(2011).
  2. Kasturi, S. P., Skountzou, I., Albrecht, R. A., Koutsonanos, D., Hua, T., Nakaya, H. I., Ravindran, R., Stewart, S., Alam, M., Kwissa, M., Villinger, F., Murthy, N., Steel, J., Jac....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Multispectral Imaging Flow CytometryNanoparticle InternalizationBacterial PhagocytosisActin dependent InternalizationCytochalasin D InhibitionImageStreamX SystemIDEAS Analysis SoftwareFluorescent Signal IntensitySpatial Resolution AnalysisInternalization Feature Quantification

Related Articles