שיטת צעד אחר צעד לכינונה מחדש של טרנספורטר ABC לחלקיקי ליפידים Nanodisc

סיכום

Nanodiscs הם חלקיקי discoid קטנים המשלבים חלבונים בממברנה לתיקון קטן של bilayer פוספוליפידים. אנו מספקים פרוטוקול חזותי המציג את שילוב צעד אחר הצעד של טרנספורטר MalFGK2 לתוך דיסק.

תקציר

Nanodisc הוא חלקיק discoidal (~ 10-12 ננומטר גדול) שחלבוני קרום מלכודת תיקון קטן של bilayer פוספוליפידים. Nanodisc היא אופציה אטרקטיבית במיוחד ללימוד חלבונים בממברנה, במיוחד בהקשר של יחסי גומלין יגנד לרצפטור. השיטה החלוצית שSligar ועמיתים מתבססים על המאפיינים של amphipathic מהונדס מאוד סליל חלבון פיגום נגזר מאפוליפופרוטאין A1. הפנים ההידרופובי של חלבון פיגום אינטראקציה עם רשתות הלוואי acyl השומן של bilayer השומנים ואילו אזורי הקוטב להתמודד בסביבה המימית. אנליזות של חלבוני קרום בnanodiscs יש יתרונות משמעותיים על פני יפוזום מפני החלקיקים קטנים, הומוגנית ומסיסים במים. בנוסף, שיטות ביוכימיות וbiophysical השמורים בדרך כלל לחלבונים מסיסים יכולות להיות מיושם, ומשני הצדדים של הקרום. בפרוטוקול החזותי הזה, אנו מציגים כינון מחדש צעד אחר צעד וגם characטרנספורטר terized חיידקי ABC, ₂ המורכב גברי MalFGK. ההיווצרות של הדיסק היא תהליך הרכבה עצמית שתלוי באינטראקציות הידרופוביות המתרחשות במהלך ההסרה ההדרגתית של חומר הניקוי. אנו מתארים את הצעדים החיוניים ואנו מדגישים את החשיבות של בחירה נכון יחס חלבון לשומנים בדם, במטרה לצמצם את ההיווצרות של אגרגטים וחלקיקים גדולים יותר polydisperse יפוזום דמויים. איכות פשוט שולטת כגון כרומטוגרפיה ג'ל סינון, ג'ל אלקטרופורזה יליד וספקטרוסקופיה פיזור האור דינאמי להבטיח כי את הדיסקים כבר מחדש כראוי.

פרוטוקול

תהליך כינונה מחדש באופן כללי

תהליך הבנייה מחדש מתחיל על ידי ערבוב קרום פיגום החלבון (MSP) עם ₂ המורכבים MalFGK המטוהר בנוכחות פוספוליפידים דטרגנט-solubilized. הצעד אחריו ההסרה האיטית של חומר הניקוי על ידי חומר הנקרא פוליסטירן סופח-Bio חרוזים או Amberlite (איור 1). התהליך אוטומטי ההרכבה מתרחש ככל הנראה בשל אינטראקציות apolar בין פוספוליפידים הידרופובי, ₂ המורכבים MalFGK ועל פני השטח של חלבון amphipathic MSP. המוצר הסופי הוא חלקיק discoid המורכב משתי מולקולות של עטיפת MSP סביב ₂ המורכבים MalFGK. החלקיקים הם מופרדים ....

דיון

אנו מתארים הליך פשוט לכינון מחדש של טרנספורטר מלטוז לnanodiscs. טרנספורטר הוא ATPase הפעיל והאינטראקציה עם זכר השותף מחייב המסיס ניתן ליצור מחדש (איור 3). הכינון מחדש המוצלח של טרנספורטר לnanodiscs לפתוח את הדרך לניתוח biophysical וביוכימיים נוספים. מעניין במיוחד יהיה הניתוח השיטתי את פעילות תחבורת מלטוז בחומר הניקוי וMalK ATPase, יפוזום וnanodiscs. מובילי ABC לשנות תצורות במהלך מחזור התחבורה אבל התרומה של שומנים לשינויים קונפורמציה אלה יישארו כדי להיחקר.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
שם המגיב	חברה	מספר קטלוגים	תגובות
Amicon Ultra-4 50K מסנן צנטריפוגלי	Millipore	UFC805008	עקוב הפרוטוקול של היצרן לשימוש נכון
Bio-חרוזי SM-2 כושר ספיג	Bio-Rad	152-3920
חיידק שומנים כלל	שומני פולאר AVANTI	100500C	מומס בכלורופורם, לטפל לפי צורך ממס אורגני
Ni sepharose HP שרף	GE Healthcare	17-5268-01
פתרון סטנדרטי זרחן	סיגמה אולדריץ	P3869
pMSP1D1	Addgene	20061
Superdex 200 HR 10/300	GE Healthcare	17-5172-01
			ריאגנטים ספציפיים I. טבלה.
			שם הרכב תגובות DDM המניות 10% w / v DDM Resuspend במים וחנות milliQ ב -20 ° C 2 מניות MalFGK 1-2 מ"ג / מ"ל 50 mM טריס-HCl, pH7.9 100 המ"מימ NaCl 10% גליצרול v / v 0.03% w / v DDM חנות ב -70 ° C לאחר טיהור MSP המניות 10-15 מ"ג / מ"ל 50 mM טריס-HCl, pH7.9 100 המ"מימ NaCl 10% גליצרול v / v חנות ב -70 ° C לאחר טיהור ב< 1 aliquots המ"ל ולהימנע ממחזורים מוגזמים הקפאה / פשרה מניית פוספוליפידים 5 nM E. coli סך שומנים 0.5% w / v (10 מ"מ) DDM 50 mM טריס-HCl, 7.9 pH 50 mM NaCl חנות ב 4 מעלות צלזיוס למשך השבוע 1 TS חיץ 50 mM טריס-HCl, 7.9 pH 50 mM NaCl לאחסן ב 4 ° C TSG10 חיץ 50 mM טריס-HCl, pH7.9 100 המ"מימ NaCl 10% גליצרול v / v לאחסן ב 4 ° C TSG20 חיץ 50 mM טריס-HCl, pH8 100 המ"מימ NaCl 20% גליצרול v / v לאחסן ב 4 ° C חיץ TSGD 50 mM טריס-HCl, pH7.9 100 המ"מימ NaCl 10% גליצרול v / v 0.03% w / v DDM חנות ב 4 ° C ולהוסיף DDM ממש לפני השימוש טבלה השנייה. פתרון מתכונים.