הרכבות גנום המבוססות על טכנולוגיות ריצוף DNA מקבילי מאסיבי הן בדרך כלל מקוטעות מאוד. פיתוח מפות כרומוזומים פיזיות עשוי לשפר את הרכבות הגנום. כאן, אנו מציגים גישות חדשניות להכנת כרומוזומים, היברידיזציה פלואורסצנטית in situ ודימוי, המגבירות משמעותית את התפוקה של פיתוח המפה הפיזית.
מאמר שיטה
תפוקה גבוהה מיפוי פיזי של הכרומוזומים באמצעות אוטומטי
במאמר זה
סיכום
תקציר
פרויקטים להשגת רצפי גנום מלאים עבור 10,000 מיני חוליית רגליים1 ועבור 5,000 מיני חרקים ופרוקי רגליים קרובים2 צפויים להתבצע במהלך 5 השנים הבאות. לדוגמה, ריצוף הגנומים של 15 מיני יתושי מלריה מבוצע כעת באמצעות פלטפורמת Illumina3,4. מקבץ מיני Anopheles זה כולל הן וקטורים והן מינים שאינם וקטורים של מלריה. כאשר הרכבות הגנום יהיו זמינות, לחוקרים תהיה הזדמנות ייחודית לבצע ניתוח השוואתי להסקת שינויים אבולוציוניים הרלוונטיים ליכולת הוקטורית. עם זאת, התברר כי קשה להשתמש בקריאות של ריצוף הדור הבא כדי ליצור הרכבות גנום de novo באיכות גבוהה5. יתר על כן, הרכבות הגנום הקיימות עבור Anopheles gambiae, אף שהושגו בשיטת Sanger, הן מקוטעות או בעלות פערים4,6.
הצלחתם של ניתוחים גנומיים השוואתיים תהיה מוגבלת אם חוקרים יעבדו עם מספר רב של קונטיגים (contigs) של רצפים, במקום עם הרכבות גנום מבוססות כרומוזומים. רצפים מקוטעים שאינם ממופים יוצרים בעיות עבור ניתוחים גנומיים מכיוון ש: (i) פערים לא מזוהים גורמים לאנוטציה שגויה או חלקית של רצפים גנומיים; (ii) רצפים שאינם ממופים מובילים לבלבול בין גנים פאראלוגיים לבין גנים מהפלוטיפים שונים; ו-(iii) היעדר שיוך כרומוזומלי וכיוון של קונטיגי הרצף אינם מאפשרים שחזור של פילוגניה של ארגון מחדש (rearrangement phylogeny) וחקר אבולוציית כרומוזומים. פיתוח מפות פיזיות ברזולוציה גבוהה עבור מינים עם גנומים שרוצפו לאחרונה הוא השקעה רלוונטית וכלכלית שתקל על אנוטציה של הגנום, ניתוח אבולוציוני ורי-סקוונסינג (re-sequencing) של גנומים פרטניים מאוכלוסיות טבעיות7,8.
כאן אנו מציגים גישות חדשניות להכנת כרומוזומים, היברידיזציה פלואורסצנטית in situ (FISH) ודימות המקלים על פיתוח מהיר של מפות פיזיות. באמצעות שימוש ב-An. gambiae כדוגמה, אנו מדגימים כי פיתוח של מפות כרומוזומים פיזיות יכול פוטנציאלית לשפר הרכבות גנום, ובכך את איכותם של ניתוחים גנומיים. ראשית, אנו משתמשים בשיטה של לחץ גבוה כדי להכין פריסות של כרומוזומים פוליטניים. שיטה זו, שפותחה במקור עבור Drosophila9, מאפשרת למשתמש להמחיש פרטים רבים יותר על הכרומוזומים מאשר טכניקת הריסוק (squashing) הרגילה10. שנית, מערכת קדם-מעבדת (front-end) אוטומטית לחלוטין עבור FISH משמשת למיפוי פיזי של הגנום בסריקה רחבה (high-throughput). מערכת צביעת השקופיות האוטומטית מריצה מספר בדיקות בו-זמנית ומקטינה באופן משמעותי את זמן העבודה הידנית11. שלישית, מערכת דימות פלואורסצנטית אוטומטית, הכוללת במה למשקופיות ממונעת, סורקת ומצלמת באופן אוטומטי כרומוזומים מסומנים לאחר FISH12. מערכת זו שימושית במיוחד לזיהוי ולהמחשה של מספר לוחות כרומוזומליים על אותה שקופית. בנוסף, תהליך הסריקה מקבל תוצאת FISH אחידה יותר. באופן כללי, פרוטוקול המיפוי הפיזי האוטומטי בסריקה רחבה יעיל יותר מפרוטוקול ידני סטנדרטי.
פרוטוקול
1. הכנת כרומוזומים פוליטנים בלחץ גבוה מתאי סיעוד שחלאיים
- בצעו דיסקציה של נקבות Anopheles בעלות בטן חציה-מלאה (half-gravid) 25 שעות לאחר הזנה בדם תחת מיקרוסקופ דיסקציה, וקבעו את השחלהות בתמיסת קרנוי (Carnoy's) משופרת טרייה עם מתנול (100% methanol: glacial acetic acid, 3:1). בשלב זה השחלהות נמצאות בשלב התפתחות III של כריסטופר (Christophers' III), כאשר לזקיקים יש צורה אליפטית ולאזור השקוף עם תאי הפענקים (nurse cells) בתוך הזקיקים יש צורה עגולה13. העבירו שחלהות מכ-חמש נקבות לתוך 500 μl של תמיסת קרנוי משופרת בתוך מבחנה מסוג Eppendorf בנפח 1.5 ml, ושמרו אותן בטמפרטורת החדר למשך 24 שעות. העבירו את השחלהות ל-20 °C- לאחסון לטווח ארוך.
- הכינו תמיסת קרנוי משופרת עם אתנול (100% ethanol: glacial acetic acid, 3:1) ו-50% חומצה פרופיונית רגע לפני הכנת השקופיות. הניחו זוג שחלהות אחד על שקופית נקייה מאבק בתוך טיפה אחת של תמיסת קרנוי משופרת. חלקו את השחלהות לכ-6 מקטעים באמצעות מחטי דיסקציה והניחו אותם בטיפות של 50% חומצה פרופיונית על שקופיות נקיות תחת מיקרוסקופ סטריאו MZ6 Leica. השתמשו בשקופית נפרדת לכל מקטע.
- הפרידו את הזקיקים באמצעות מחטי דיסקציה ונגבו רקמות שנותרו בעזרת נייר סינון או נייר סופג תחת מיקרוסקופ דיסקציה. הוסיפו טיפה חדשה של 50% חומצה פרופיונית לזקיקים והניחו להם לעמוד 3-5 דקות בטמפרטורת החדר. הניחו כיסוי זכוכית (coverslip) מעל טיפת ה-50% חומצה פרופיונית. הניחו לשקופית לעמוד למשך כדקה אחת.
- עטפו את השקופית בנייר סינון ובפלסטיק. בעזרת כלי רוטציוני Dremel 200 עם התקן Flex-Shaft וראש פלסטיק רך המכוון ל-3000-5000 RPM, פזרו את הזקיקים על ידי סיבוב הראש במעגלים ולחיצה קלה על כיסוי הזכוכית כדי לפרוס את הגרעינים באופן אחיד. שלב זה אמור להימשך כדקה אחת. בדקו את איכות הפריסה תחת מיקרוסקופ פאזה Olympus CX41 עם עדשה של 20x.
- הכינו "סנדוויץ'" על ידי הנחת כיסוי זכוכית נוסף לצד כיסוי הזכוכית המכסה את הכרומוזומים, וכסו אותם בשקופית מיקרוסקופ שנייה. פעולה זו מפחיתה את הסיכוי לשבירת השקופית במלחציים. עטפו את השקופיות ביריעת פלסטיק (המסופקת במכלים של שקופיות זכוכית) ובנייר סינון כדי להחזיק את ה"סנדוויץ'" ולהגן על השקופית משריטות כתוצאה מהמלחציים.
- הפעילו לחץ על השקופיות באמצעות מלחציים מכניים. לחץ של 85-120 inch-lbs הוא מספיק ומושג באמצעות מפתח מומנט. שלב זה נחוץ כדי לשטח את הכרומוזומים ככל האפשר.
- הסירו את שקופית המיקרוסקופ השנייה ואת כיסוי הזכוכית הנוסף. חממו את השקופית עם כיסוי הזכוכית המכסה את הכרומוזומים ל-55 °C במערכת דנטורציה/היברידיזציה של שקופיות למשך 10-15 דקות כדי לשטח את הכרומוזומים עוד יותר. טבלו את השקופית בחנקן נוזלי למשך 15 שניות לפחות, וכאשר ההבעה הבעבועית פסקה, הסירו במהירות את כיסוי הזכוכית בעזרת להב תער. הניחו מיד את השקופיות ב-50% אתנול קר למשך 5 דקות. בצעו דהידרציה לשקופיות ב-70%, 90% ו-100% אתנול למשך 5 דקות בכל שלב. ייבשו את השקופיות באוויר.
2. FISH באמצעות מערכת אוטומטית לצביעת סליידים
התוכנית מוגדרת במערכת הצביעה האוטומטית של הפתחים Xmatrx לביצוע השלבים הבאים, למעט סימון הגשש. פרוטוקול סימון ה-nick-translation המפורט מתואר בתיעוד המצורף ל-DNA polymerase מבית Fermentas.
- לפני ביצוע FISH, הכין גששים פלואורסצנטיים על ידי סימון DNA גנומי מסוג BAC עם פלואורונוkrom באמצעות פרוטוקול של nick-translation. ערבב 1 μg של DNA, 0.05 mM מכל אחד של dATP, dCTP, ו-dGTP לא מסומנים ו-0.015 mM dTTP, כ-1 μl של Cy3- או Cy5-dUTP, 0.05 mg/ml BSA, כ-5 μl של 10x nick-translation buffer, 20 units של DNA polymerase I, 0.0012 units של DNase I, והשלם במים נקיים מנוקלאז עד לנפח של 25 μl. יחס ה-DNA polymerase I/DNase I נבחר באופן אמפירי כדי להשיג גששים בטווח גדלים של 300 עד 500 bp. הדגר את התערובת ב-15 °C למשך שעה אחת.
- הכנס את השקופיות והריאגנטים למערכת הצביעה האוטומטית Xmatrx והפעל את התוכנית לביצוע השלבים הבאים. החל 800 μl של 1x PBS למשך 20 דקות. ייבש את השקופיות בעזרת אוויר. בצע קיבוע בפורמלין על ידי הנחת 450 μl של 4% פורמלין ב-1x PBS למשך דקה אחת, ולאחר מכן שטיפות ב-100% אתנול למשך שנייה אחת פעמיים ולמשך 2 דקות פעם אחת. ייבש את השקופיות בעזרת אוויר.
- חמם את השקופיות ב-45 °C למשך 2 דקות כדי למנוע היווצרות בועות בעת הנחת הגששים. הנח 20 μl של גששי ה-DNA, הוסף טיפות של שמן מינרלי כדי למנוע התאיידות של תמיסת ההיברידיזציה, והנח זכוכית כיסוי מעל. דנטור את הכרומוזומים ואת גששי ה-DNA על ידי חימום השקופיות ב-90 °C למשך 10 דקות.
- להיברידיזציה, הדגר את השקופיות ב-42 °C למשך 14 שעות כאשר זכוכית הכיסוי מונחת עליהן. תמיסת ההיברידיזציה מורכבת מ-2x SSC, 100 mM סודיום פוספט, 1x Denhardt's solution, 100 μg/ml של סודיום אזיד, ו-10% דקסטראן סולפט בפורממיד.
- לשטיפות מחמירות (stringency washes), חמם את השקופיות ב-42 °C למשך 2 דקות, הסר את זכוכיות הכיסוי, ושטוף את השקופיות ב-2x SSC למשך שנייה אחת 4 פעמים. ייבש את השקופיות בעזרת אוויר. החל 800 μl של 0.4x SSC ב-42 °C למשך 10 דקות פעמיים. שטוף את השקופיות ב-2x SSC ב-25 °C למשך 10 דקות.
- בצע צביעת כרומוזומים על ידי הנחת 50 μl של 1 μM YOYO-1 ב-1x PBS. הוסף טיפות של שמן מינרלי כדי למנוע התאיידות של תמיסת הצביעה, הנח זכוכיות כיסוי, והדגר ב-25 °C למשך 10 דקות. הסר את זכוכיות הכיסוי, שטוף את השקופיות ב-2x SSC למשך שנייה אחת 4 פעמים. ייבש את השקופיות בעזרת אוויר. החל 15 μl של ProLong Gold antifade reagent. הנח זכוכיות כיסוי.
3. קריאת סליידים באמצעות מערכת דימות פלואורסצנטית אוטומטית
סעיף זה מפרט את השימוש בתוכנת Duet, המגיעה כסטנדרט עם מערכת הסריקה האוטומטית ACCORD PLUS. ההוראות מתחילות לאחר ההדלקה בסדר הבא: ספק הכוח Olympus U-RFL-T עבור נורת הלוגן, מחשב Dell precision T3500, מיקרוסקופ Olympus BX61 עם מצלמה מחוברת Olympus U-CMAD3.
- להגדרת 10x Pre-Scan, פתחו את תוכנת Duet במערכת הסריקה האוטומטית ACCORD PLUS. לחצו על כפתור "Online". הזינו Case ID חדש והקצו Slide ID. לחצו על הנקודה המסומנת "BF". זוהי אפשרות השדה בהיר (brightfield). הגדירו את בחירת הסריקה ל-"10x Prescan". השתמשו ב-"2500x circle", "10000x circle" או "rectangle". לחצו על "Set&run" עבור 10x Pre-Scan.
- לחצו על כפתור "OK" כדי להריץ את ה-10x Pre-Scan. עקבו אחר ההנחיות כדי להתאים את הסריקה כראוי. לחצו על "Finish" כדי להתחיל את הסריקה. לחצו על לשונית "Main" כדי לחזור למסך הראשי. לחצו על כפתור "Offline". אתרו את ה-Case ID וה-Slide ID שהוקצו ולחצו על "Offline Scan". בתיבה השחורה באזור השמאלי העליון לחצו על חץ ובחרו "10x Prescan". באמצעות החיצים (< || Δ > המוכרים ככפתורי "חזור", "השהה", "נגן", "קדימה"), עברו על התמונות שנסרקו.
- לאחר מציאת תמונה רלוונטית, לחצו פעמיים על מרכז אזור המטרה על המסך ולחצו על "Snap". פעולה זו תסמן תמונה לצילום מאוחר יותר. לאחר בחירת כל המטרות, לחצו על "Classify". בחרו "10x Prescan". לחצו לחיצה ימנית על תמונה כדי לסווג את התמונות. בחרו "Polytene".
- הגדירו 40x Pre-Scan בתוכנת Duet. לחצו על "Main" כדי לחזור לתפריט הראשי. בחרו שוב ב-"Online". בחרו סלייד. שנו את "BF" ל-"FL". שנו את שם המשימה ל-"Revisit-X40-RG". שנו את הסעיף מיד מתחת להגדרה האחרונה ל-"Revisit-ALL". לחצו על "Set&Run". לחצו על "OK". עקבו שוב אחר ההנחיות להגדרת האוטומציה. לחצו על כפתור "Start matching views" כדי להתאים בין תמונות 10x ל-40x. לחצו על "Finish" כדי להתחיל את הסריקה. עם סיום הפעולה, לחצו על "Classify" ועיינו בתמונות.
4. תוצאות מייצגות
איור 1 מציג באופן גרפי את תרשים ההכנה של כרומוזומים בלחץ גבוה. שלב זה כולל את תהליך המעיכה וההשטחה של הכרומוזומים באמצעות כלי Dremel ומלחץ מכני, וכן ויזואליזציה של הכרומוזומים באמצעות מיקרוסקופ ניגודיות פאזה. איור 2 מדגים את ההיברידיזציה של פרוב מסומן פלואורסצנטית ל-DNA מטרה על הכנות של נתיחי כרומוזומים באמצעות מערכת אוטומטית לצביעת נתיחים, שימוש במיקרוסקופ סריקה אוטומטי לוויזואליזציה ומיפוי של הפרובים לאחר ניסוי FISH, והצבה ומיקום של פיגומים גנומיים (genomic scaffolds) על הכרומוזומים.
הכנות של כרומוזומים פוליתניים מתאי תמיכה בשחלה של נקבות An. gambiae בוצעו באמצעות טכניקת הלחץ הגבוה. שיטה זו אינה פוגעת במבנה הכרומוזומים ואינה משנה את רובו (איור 3). היא מיישרת כרומוזומים מכופפים, ובכך חושפת פסי רוחב עדינים ונסתרים שאינם נראים בהכנות רגילות (איור 4).
הגששים המשמשים בפרוטוקול זה הם שיבוטי DNA גנומיים מסוג BAC שהושגו מספריית ND-TAM BAC שנוצרה מ-DNA של זן PEST של An. gambiae. ה-DNA הגנומי עבור ספרייה זו הופק מזחלים בגיל ראשון שזה עתה בקעו, משני המינים. איור 5 מציג את תוצאות ה-FISH באמצעות שיבוטי BAC שהיו בגיבוב עם כרומוזומים פוליטניים של An. gambiae. הליך זה בוצע באמצעות מערכת צביעת שקופיות אוטומטית מסוג Xmatrx. באמצעות מפת צילום ציטוגנטית עבור An. gambiae10, שני שיבוטי BAC, 102B24 (GenBank: BH372701, BH372694) ו-BAC 142O19 (GenBank: BH368703, BH368698), מוקמו בתתי-חלוקות 16C ו-16D של זרוע 2R, בהתאמה. עם זאת, חיפוש BLAST מול הרכבת AgamP3 של זן PEST של An. gambiae14 זיהה את הרצפים ההומולוגיים ל-102B24 ו-142O19 בתתי-חלוקות 16B ו-17A של זרוע 2R, בהתאמה (טבלה 1). לפיכך, ניתן כעת להתאים את ההתאמה בין הקואורדינטות הגנומיות לבין תתי-החלוקות הציטוגנטיות בהתאם לנתוני המיפוי שלנו. חיפוש BLAST מול הרכבות הגנום של צורת M וצורת S של An. gambiae מצא ששני שיבוטי ה-BAC ממוקמים בקונטיגים שונים, אך באותם סקאפולדים בתוך כל צורה (טבלה 1). כעת ניתן לקשר את הקונטיגים שזוהו למיקומים כרומוזומליים ספציפיים. יתרה מכך, כעת ניתן להכווין כראוי את הסקאפולדים שזוהו בתוך תתי-החלוקות הציטולוגיות 16CD. באופן מעניין, המרחקים בין הרצפים 102B24 ו-142O19 בסקאפולדים הם 1,892,981 bp, 1,658,391 bp ו-1,688,426 bp בהרכבות הגנום של זן PEST, צורת M וצורת S, בהתאמה. מאחר שזן PEST הוא היבריד בין צורות M ו-S, הבדל זה נובע ככל הנראה מהרכבה שגויה של גנום ה-PEST.
| כרומוזום מלאכותי בבקטריה מספר זיהוי (accession) | זן PEST AgamP3 קואורדינטות | צורת-M קונטיגים קואורדינטות | צורת-M פיגומים קואורדינטות | טופס S קונטיגים קואורדינטות | טופס S פיגומים קואורדינטות |
| 102B24 (BH372694) | 2R:AAAB0100 8844_26 (16B) 43,681,342- 43,681,874 | ABKP020247 53.1 32,513- 33,045 | EQ090167.1 1,858,377- 1,858,909 | ABKQ010123 32.1 4,299- 4,832 | EQ099711.1 215,891- 216,424 |
| 102B24 (BH372701) | 2R:AAAB0100 8844_28 (16B) 43,788,213- 43,788,969 | ABKP020247 51.1 24,816- 25,575 | EQ090167.1, 1,772,683- 1,773,442 | ABKQ010123 35.1 27,782- 28,540 | EQ099711.1, 305,514- 306,272 |
| 142O19 (BH368698) | 2R:AAAB0100 8805_5 (17A) 45,428,580- 45,429,264 | ABKP020247 01.1 2,499- 3,185 | EQ090167.1 315,806- 316,492 | ABKQ010123 76.1 49,242- 49,942 | EQ099711.1 1,791,625- 1,792,325 |
| 142O19 (BH368703) | 2R:AAAB0100 8805_8 (17A) 45,560,099- 45,574,323 | ABKP020220 17.1 30,971- 32,469 | EQ090167.1 200,518- 202,016 | ABKQ010123 79.1 27,760- 28,508 | EQ099711.1 1,903,569- 1,904,317 |
טבלה 1. תוצאות BLAST של רצפי קצאי ה-BAC אל מול הרכבות הגנום של An. gambiae.
איור 1. ייצוג סכמתי של הכנת כרומוזומים בלחץ גבוה. שחאות יתוש מוצגות בשלב ההתפתחותי המתאים.
איור 2. תרשים המייצג FISH אוטומטי, סריקת שקופיות ומיפוי כרומוזומלי של פיגומים גנומיים.
איור 3. פריסה של כרומוזום פוליטני 3 של An. gambiae שהתקבלה באמצעות טכניקת הלחץ הגבוה. 3L ו-3R מסמנים את הזרועות השמאלית והימנית בתלומרים שלהן. PH ו-IH מציינים, בהתאמה, הטרוכרומטין פריצנטרי ואינטרקלארי.
איור 4. השוואה של כרומוזומים פוליטניים של An. gambiae שהוכנו באמצעות הטכניקה המסורתית (למעלה) והטכניקה בלחץ גבוה (למטה). התמונות מכסות את תתי-החלקים 29A-30E של זרוע 3R (A) ואת 43D-46D של זרוע 3L (B).
איור 5. FISH של שיבוטי BAC לכרומוזומים פוליטניים של An. gambiae. A) היברידיזציה של 102B24 (אות אדום) עם זרוע 2R. B) FISH דו-צבעי של 102B24 (אות אדום) ו-142O19 (אות כחול) לתתי-החלוקות 16C ו-16D של זרוע 2R מתוחה, בהתאמה. חצים מצביעים על אותות היברידיזציה של שיבוטי BAC המסומנים ב-Cy3 (אדום) וב-Cy5 (כחול). C-האזור הצנטרומרי. a/+ מראה את האינברסיה ההטרוזיגוטית 2La. הכרומוזומים נצבעו בצביעה נגדית עם הפלואורופור YOYO-1.
דיון
השלב הקריטי ביותר בפרוצדורה בלחץ גבוה הוא מעיכה נכונה של תאי סיעוד שחלאביים שבודדו בשלב III של התפתחות השחלה (Christophers' III stage)13. מעיכה שאינה נאותה עלולה להוביל לכרומוזומים שאינם פרוסים דיו, דבר שעלול לגרום לבעיות בניסיון לקבוע את מיקומי הגשושים לאחר FISH. אם הכרומוזומים נמעכים יתר על המידה, הם עלולים להישבר או להתארך עד כדי אובדן דפוסי הפסים. הפקת מספר רב של סמפיסליות צריכה להוביל לעקביות בעת ניסיונות מעיכת הסמפיסליות באמצעות כלי ה-Dremel, דבר שיעלה את היעילות הכללית של הפקת הסמפיסליות. טכניקת הלחץ הגבוה פותחה תחילה עבור בלוטות רוק שבודדו טריים מ-D. melanogaster9. עם זאת, שחלות של יתושים נשמרות באופן שגרתי בתמיסת קיבוע של Carnoy' המוגמרת (3 מתנול: 1 חומצה אצטית קרחית לפי נפח) לפני שהן משמשות להכנות כרומוזומליות. לפיכך, התאמנו את פרוטוקול הלחץ הגבוה הקיים כדי להפוך אותו למתאים לכרומוזומים פוליטניים של תאי סיעוד שחלאביים מקובעים של יתוש המלריה An. gambiae. מכיוון שהלחץ הגבוה מופעל באמצעות מלחציים מדויקים בעלי משטח עבודה מקבילי מאוד לכל השמפיסליה, הכנת מעיכת הכרומוזומים אורכת זמן פחות באופן משמעותי מאשר שימוש בטכניקת ההקשה המסורתית עם מחק של עיפרון.
שלבים חשובים נוספים כוללים השראה מספקת של הזקיקים בחומצה פרופיונית 50% וחימום של השקף. שני השלבים הללו חיוניים לסיוע בהשטחת הכרומוזומים. אם הם יוזנחו, הכרומוזומים עלולים להיראות מבריקים לאחר התייבשות, דבר שעלול להוביל לעודף של רקע שניתן לטעות ולפרש כסיגנל ב-FISH. טכניקת המעיכה בלחץ גבוה עובדת היטב גם בשימוש באותם תמיסות בעת הכנת כרומוזומים מיטוטיים. הפריסה וההשטחה הנוספות מסייעות בביטוי טוב יותר של הכרומוזומים מתוך הגרעינים שלהם. הפעלת לחץ שווה אמורה להשטיח אותם בהתאם כדי לאפשר מדידות ופוטנציאלית רזולוציה טובה יותר של פסים הנראים לצביעה. פרטים על בידוד כרומוזומים מיטוטיים מיתושים מופיעים במקום אחר15. למרות שהכנות מעיכה רגילות מספיקות למטרות רבות, כולל FISH 16 וצביעה אימונוהיסטוכימית17, שיטת הלחץ הגבוה לא רק מפחיתה שונות פוטנציאלית משקף לשקף, אלא גם משפרת את איכות הכרומוזומים הכללית, מה שמוביל לפירוט גבוה יותר במיפוי כרומוזומים. ניתן להשתמש בהליך זה גם להכנת שקפי ממברנה של כרומוזומי פוליטן עבור מיקרו-דיסקציה בלייזר (laser-capture microdissection).
המגבלות של שיטת הלחץ הגבוה כוללות שבירה של הזריקה ומתירה יתרה של הכרומוזומים. שבירה של הזריקה עקב הפעלת מאמץ רב מדי על הזריקה באמצעות המלחץ היא אפשרית, אך היא מוגבלת על ידי שימוש בלחצים המצוינים במאמר. לגבי מתירה יתרה של הכרומוזומים, אם כלי הד רמל (Dremel) מופעל על הזריקה למשך זמן ממושך, קיימת אפשרות שהכרומוזומים יימתחו יתר על המידה ויאבדו רזולוציה. ניתן לפתור זאת על ידי הפעלת הכלי למשך זמן קצר, בדיקה תחת המיקרוסקופ, והפעלת כלי הד רמל למשך זמן נוסף אם הכרומוזומים אינם פרוסים מספיק.
פרוטוקול FISH מסורתי כולל מספר שלבי שטיפה ודגירה, אשר נמשכים בדרך כלל 5-20 דקות ודורשים תשומת לב כמעט מלאה של החוקר לאורך כל משך הניסוי. יתרה מכך, מספר השקופיות שניתן לטפל בהן ידנית מוגבל בדרך כלל למספר מצומצם של שקופיות בניסוי נתון. לעומת זאת, מערכת אוטומטית לצביעת שקופיות מבצעת את כל השלבים (כולל שטיפה, דגירה, יישום גשש, דנטורציה, היברידיזציה, הנחה והסרה של זכוכית כיסוי) באופן אוטומטי. דבר זה מפנה עד 6-8 שעות עבודה עבור החוקר בניסוי FISH. בנוסף, מערכת FISH אוטומטית יכולה להגדיל משמעותית את התפוקה. לדוגמה, מערכת Xmatrx מסוגלת לעבד עד 40 בדיקות על שקופיות בעלות הכנה בודדת ועד 80 בדיקות על שקופיות בעלות הכנה כפולה בו-זמנית. בין המגבלות של מערכת זו היא שאינה יעילה עבור מספר קטן של ניסויי FISH, מאחר שהיא דורשת הכנה של נפחים גדולים של תמיסות. בנוסף, הפרוטוקול של ה-FISH המתוכנת במערכת עשוי לדרוש שינויים והתאמות עבור יישומים חדשים.
מערכת לסריקת סליידים היא גרסה אוטומטית של מיקרוסקופ פלואורסצנטי. תנועה אוטומטית של השולחן ולוח בקרה פשוט למיקרוסקופ מפנות את זמנו של החוקר והופכות את הפעלת המיקרוסקופ לפשוטה ביותר. לדוגמה, התוכנה במערכת הסריקה ACCORD PLUS מאפשרת לכידה קלה של ערוצי פלואורסצנציה מרובים וניהול פשוט של רכישת תמונות. דוגמה לכך היא הכללת לכידת z-stack, במקום צילום תמונה אחת; התוכנה לוכדת z-stack של תמונות ברמה ניתנת להגדרה כדי להבטיח שלפחות תמונה אחת תישאר במיקוד. למרות שמערכת זו מיועדת יותר לרכישת תמונות מרובות (מספר רב של תאים על סלייד בודד), היא עדיין מקלה מאוד על מציאת כרומוזומים על הסלייד בהשוואה לניווט ידני על פניו.
הן מערכת צביעת השקופיות האוטומטית והן מערכת הסריקה משמשות באופן שגרתי לאבחון FISH של חריגות כרומוזומליות בתאי אנוש על ידי מרפאות ציטוגנטיקה. במחקר זה, פיתחנו פרוטוקול המשתמש במערכות אוטומטיות אלו ליישום במחקר בסיסי. פרוטוקול המיפוי הפיזי האוטומטי בעל התפוקה הגבוהה יכול להקל על פיתוח מהיר של מפות כרומוזומליות פיזיות עבור כל מין רלוונטי. למרות שבדיווח זה השתמשנו בכרומוזומים פוליטניים למיפוי פיזי, ניתן להשתמש במערכות אלו גם עבור כרומוזומים מיטוטיים. יהיה זה מועיל להתאים את הפרוטוקול לכרומוזומים מיטוטיים, מכיוון שמרבית האורגניזמים אינם מפתחים כרומוזומים פוליטניים קריאים. עם זאת, כרומוזומים פוליטניים, כאשר הם זמינים, יכולים לספק מידע שימושי על ההתאמה של דומיינים גנומיים פונקציונליים למבנה הכרומוזומלי ברזולוציה הגבוהה ביותר. עקרונות הארגון של כרומוזומים פוליטניים, כגון דפוסי פסים ורווחים בין-פסיים, הושוו לאחרונה לאלו של כרומוזומים רגילים שאינם פוליטניים (בשלב האינטרפאזה)18. לפיכך, למיפוי הפיזי המפורט המבוצע על תכשירים כרומוזומליים בלחץ גבוה יש פוטנציאל לקשר רצפי DNA למבנים כרומוזומליים ספציפיים כגון פסים, רווחים בין-פסיים, פאפים (puffs), צנטרומרים, טלומרים והטרוכרומטין; ובכך, ליצור הרכבות גנומיות מבוססות כרומוזומים.
גילויים
לא הצהיר על ניגודי אינטרסים.
תודות
עבודה זו נתמכה על ידי מענק מה-National Institutes of Health מספר 1R21AI094289 לאיגור ו. שרחוב. מערכת צביעת הפחים האוטומטית Xmatrx ומערכת הסריקה האוטומטית ACCORD PLUS נרכשו בעזרת תוכנית קרן הנאמנות לציוד, במכון פראלין למדעי החיים, המחלקה לחרקים והמחלקה לביוכימיה של Virginia Tech.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| לוחיות כיסוי למיקרוסקופ 22x22 mm | Fisher | 12-544-10 | |
| לוחיות כיסוי למיקרוסקופ 18x18 mm | Fisher | 12-553-402 | |
| חומצה אצטית | Fisher | A491-212 | |
| מתנול | Fisher | A412-4 | |
| חומצה פרופיונית | Sigma-Aldrich | 402907 | |
| כלי רוטט Dremel 200 עם התקן Flex-Shaft | Rand | משחזת שולחנית קטנה רב-תכליתית בגודל "3 (עם מגביל קצב) | |
| טיפים פלסטיים של μl 200 שתוכננו במיוחד (קצוות פלסטיק מחובבדים) עבור כלי Dremel | Pipetman | F171300 | לחתוך ולחמם את הקצה השמן של טיפי הפפיטה |
| מלחציים מהירים מצופי בדיבך | Avenger Gold Toolmaker | MTC-200-1 | דיוק השחזה של ריבוע ומקבילי עד 0.00025 |
| מפתח מומנט | Craftsman | 44593 | |
| מערכת ThermoBrite לדנטורציה/היברידיזציה של סליידים | Abbott Molecular | 30-144110 | |
| סליידים עם מחסום 25 mm | Abbott Molecular | XT108-SL | |
| לוחיות כיסוי 25 mm | Abbott Molecular | XT122-90X | |
| מערכת Xmatrx אוטומטית לצביעת סליידים | Abbott Molecular | 08L46-001 | |
| סטריאומיקרוסקופ MZ6 Leica | Leica | VA-OM-E194-354 | ניתן להשתמש בסטריאומיקרוסקופ אחר |
| מיקרוסקופ פאזה Olympus CX41 | Olympus | CX41RF-5 | ניתן להשתמש במיקרוסקופ פאזה אחר |
| מערכת סריקה אוטומטית ACCORD PLUS | BioView (USA) | BV-5000-ACCP | |
| 10x PBS | Invitrogen | P5493 | |
| 10% NBF (פורמלין במאזן ניטרלי) | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| 99% פורממיד | Fisher Scientific | BP227500 | |
| מלח נתרן של דקסטראן סולפט | Sigma | D8906 | |
| בופר 20x SSC | Invitrogen | AM9765 | |
| נתרן פוספט | Sigma-Aldrich | S3264 | |
| תמיסת Denhardt בריכוז 50x | Sigma-Aldrich | D2532 | |
| נתרן אזיד | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| תמיסת 1 mM YOYO-1 iodide (491/509) ב-DMSO | Invitrogen | Y3601 | |
| ריאגנט ProLong Gold למניעת דהייה (antifade) | Invitrogen | P36930 | |
| dATP, dCTP, dGTP, dTTP | Fermentas | R0141, R0151, R0161, R0171 | |
| Cy3-dUTP, Cy5-dUTP | GE Healthcare | PA53022, PA55022 | |
| BSA | Sigma | A3294 | |
| DNA polymerase I | Fermentas | EP0041 | |
| DNase I | Fermentas | EN0521 |
מקורות
- Genome 10K: a proposal to obtain whole-genome sequence for 10,000 vertebrate species. J. Hered. 100, 659-674 (2009).
- Robinson, G. E., et al. Creating a Buzz About Insect Genomes. Science. 331, 1386-1386 (2011).
- Project description at Broad Institute [Internet]. , The Eli and Edythe L. Broad Institute of Harvard and MIT. Cambridge, MA. Available from: http://www.broadinstitute.org/annotation/genome/anopheles/ (2012).
- Besansky, N. Genome Analysis Of Vectorial Capacity In Major Anopheles Vectors Of Malaria Parasites. White Paper. , 1-15 (2008).
- Alkan, C., Sajjadian, S., Eichler, E. E. Limitations of next-generation genome sequence assembly. Nature. 8, 61-65 (2011).
- Sharakhova, M. V., et al. Update of the Anopheles gambiae PEST genome assembly. Genome Biol. 8, R5(2007).
- Lewin, H. A., Larkin, D. M., Pontius, J., O'Brien, S. J. Every genome sequence needs a good map. Genome Res. 19, 1925-1928 (2009).
- Bhutkar, A., et al. Chromosomal rearrangement inferred from comparisons of 12 Drosophila genomes. Genetics. 179, 1657-1680 (2008).
- Novikov, D., Kireev, I., Belmont, A. S. High-pressure treatment of polytene chromosomes improves structural resolution. Nature. 4, 483-485 (2007).
- George, P., Sharakhova, M. V., Sharakhov, I. V. High-resolution cytogenetic map for the African malaria vector Anopheles gambiae. Insect Mol. Biol. 19, 675-682 (2010).
- FISH Complete Automation [Internet]. , Abbott Laboratories. Abbott Park, IL. Available from: http://www.abbottmolecular.com/products/instrumentation-automation/fish/fish-automation.html (2012).
- The ACCORD system [Internet]. , BioView Ltd. Billerica, MA. Available from: http://www.bioview.co.il/htmls/article.aspx?c0=12510&bsp=12332&bss53=12332 (2012).
- Clements, A. N. The Biology of Mosquitoes: Development, Nutrition and Reproduction. , Chapman & Hall. (1992).
- BLAST @ VectorBase.org [Internet]. , VectorBase.org. Notre Dame, IN. Available from: http://agambiae.vectorbase.org/Tools/BLAST/ (2012).
- Sharakhova, M. V., et al. Imaginal discs--a new source of chromosomes for genome mapping of the yellow fever mosquito Aedes aegypti. PLoS Negl. Trop. Dis. 5, e10(2011).
- Scriven, P. N., Kirby, T. L., Ogilvie, C. M. FISH for Pre-implantation Genetic Diagnosis. J. Vis. Exp. (48), e2570(2011).
- Cai, W., Jin, Y., Girton, J., Johansen, J., Johansen, K. M. Preparation of Drosophila Polytene Chromosome Squashes for Antibody Labeling. J. Vis. Exp. (36), e1748(2010).
- Vatolina, T. Y., et al. Correction: Identical Functional Organization of Nonpolytene and Polytene Chromosomes in Drosophila melanogaster. PLoS ONE. 6, (2011).
הדפסות חוזרות והרשאות
