תפוקה גבוהה מיפוי פיזי של הכרומוזומים באמצעות אוטומטי באתרו הכלאה

Phillip George; Maria V. Sharakhova; Igor V. Sharakhov

doi:10.3791/4007

מאמר שיטה

תפוקה גבוהה מיפוי פיזי של הכרומוזומים באמצעות אוטומטי באתרו הכלאה

DOI:

10.3791/4007

⸱

28 ביוני 2012

Phillip George¹ , Maria V. Sharakhova¹ , Igor V. Sharakhov¹

¹Department of Entomology, Virginia Tech

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מכלולי גנום המבוססים על טכנולוגיות ריצוף DNA מקבילות מסיביות הם בדרך כלל מקוטעים מאוד. פיתוח מפות כרומוזומים פיזיות יכול לשפר את מכלולי הגנום. כאן, אנו מדגימים גישות חדשניות להכנת כרומוזומים, הכלאה פלואורסצנטית באתרה והדמיה המגדילים משמעותית את התפוקה של פיתוח המפה הפיזית.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרויקטים להשגת רצפי גנום שלם עבור 10,000 מינים של בעלי חוליות¹ ועבור 5,000 מיני חרקים ופרוקי רגליים קרובים² צפויים להתרחש במהלך 5 השנים הקרובות. לדוגמה, ריצוף הגנום של 15 מיני יתושי מלריה נעשה כעת באמצעות פלטפורמת Illumina^3,4. אשכול מיני אנופלס זה כולל גם וקטורים וגם לא וקטורים של מלריה. כאשר מכלולי הגנום יהיו זמינים, לחוקרים תהיה הזדמנות ייחודית לבצע ניתוח השוואתי להסקת שינויים אבולוציוניים הרלוונטיים ליכולת הווקטור. עם זאת, הוכח שקשה להשתמש בקריאות ריצוף מהדור הבא כדי ליצור מכלולי גנום דה נובו באיכות גבוהה⁵. יתר על כן, מכלולי הגנום הקיימים עבור אנופלס גמביה, למרות שהתקבלו בשיטת סנגר, פעורים או מקוטעים^4,6.

הצלחתם של ניתוחים גנומיים השוואתיים תהיה מוגבלת אם החוקרים יתמודדו עם מספר רב של מקרי ריצוף, ולא עם מכלולי גנום מבוססי כרומוזומים. רצפים מקוטעים ולא ממופים יוצרים בעיות לניתוחים גנומיים כי: (i) פערים לא מזוהים גורמים לביאור שגוי או לא שלם של רצפים גנומיים; (ii) רצפים לא ממופים מובילים לבלבול בין גנים פרלוגיים וגנים מהפלוטיפים שונים; ו-(iii) היעדר הקצאת כרומוזומים והתמצאות של קונטיגים ברצף אינו מאפשר שחזור פילוגניית סידור מחדש ולימוד אבולוציה של כרומוזומים. פיתוח מפות פיזיות ברזולוציה גבוהה עבור מינים עם גנומים מרוצפים חדשים הוא השקעה מתוזמנת וחסכונית שתקל על הערת גנום, ניתוח אבולוציוני וריצוף מחדש של גנומים בודדים מאוכלוסיות טבעיות^7,8.

כאן, אנו מציגים גישות חדשניות להכנת כרומוזומים, הכלאה פלואורסצנטית באתרה (FISH) והדמיה המאפשרות פיתוח מהיר של מפות פיזיות. באמצעות An. gambiae כדוגמה, אנו מדגימים כי פיתוח מפות כרומוזומים פיזיות יכול לשפר את מכלולי הגנום ובכך לשפר את איכות הניתוחים הגנומיים. ראשית, אנו משתמשים בשיטה בלחץ גבוה להכנת ממרחי כרומוזומים פוליטניים. שיטה זו, שפותחה במקור עבור דרוזופילה⁹, מאפשרת למשתמש לדמיין יותר פרטים על כרומוזומים מאשר טכניקת הריסוק הרגילה¹⁰. שנית, מערכת חזיתית אוטומטית לחלוטין עבור FISH משמשת למיפוי גנום פיזי בתפוקה גבוהה. מערכת צביעת השקופיות האוטומטית מפעילה מספר בדיקות בו זמנית ומפחיתה באופן דרמטי את זמן הפעולה^{המעשית 11}. שלישית, מערכת הדמיה פלואורסצנטית אוטומטית, הכוללת שלב שקופיות ממונע, סורקת ומצלמת באופן אוטומטי כרומוזומים המסומנים לאחר FISH¹². מערכת זו שימושית במיוחד לזיהוי והדמיה של לוחות כרומוזומים מרובים באותה שקופית. בנוסף, תהליך הסריקה לוכד תוצאת FISH אחידה יותר. בסך הכל, פרוטוקול המיפוי הפיזי האוטומטי בעל תפוקה גבוהה יעיל יותר מפרוטוקול ידני סטנדרטי.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. הכנת כרומוזום פוליטן בלחץ גבוה מתאי אחות בשחלות

לנתח נקבות אנופלס חצי גרבידיות 25 שעות לאחר האכלת הדם תחת מיקרוסקופ דיסקציה ולקבע שחלות בתמיסת קרנוי טרייה עם מתנול (100% מתנול: חומצה אצטית קרחונית 3:1). בשלב זה השחלות נמצאות בשלב ההתפתחות השלישי של כריסטופרס כאשר לזקיקים יש צורה אליפסה ולאזור שקוף עם תאי אחות בתוך זקיקים יש צורה עגולה¹³. הכניסו שחלות מחמש נקבות לתוך 500 מיקרוליטר של תמיסת קרנוי שונה בשפופרת אפנדורף של 1.5 מ"ל ושמרו אותן בטמפרטורת החדר למשך 24 שעות. העבירו את השחלות ל -20 מעלות צלזיוס לאחסון לטווח הארוך.
הכינו תמיסת קרנוי שונה עם אתנול (100% אתנול: חומצה אצטית קרחונית 3:1) ו-50% חומצה פרופיונית ממש לפני הכנת שקופיות. הניחו זוג שחלות אחד על שקופית נטולת אבק בטיפה אחת של תמיסת קרנוי שונה. פצלו את השחלות לכ-6 חלקים בעזרת מחטי חיתוך והניחו אותן לטיפות של 50% חומצה פרופיונית על שקופיות נקיות תחת סטריאומיקרוסקופ MZ6 Leica. השתמש בשקופית נפרדת עבור כל מקטע.
הפרד זקיקים המנתחים באמצעות מחטים ונגב את הרקמה שנותרה עם נייר פילטר או מגבת נייר תחת מיקרוסקופ דיסקציה. הוסיפו טיפה חדשה של 50% חומצה פרופיונית לזקיקים והניחו להם לשבת 3-5 דקות בטמפרטורת החדר. הניחו כיסוי על גבי טיפת 50% חומצה פרופיונית. הניחו לשקופית לעמוד כדקה.
עטפו את השקופית בנייר פילטר ופלסטיק. באמצעות כלי סיבובי Dremel 200 עם חיבור Flex-Shaft וקצה פלסטיק רך המוגדר בין 3000-5000 סל"ד, בטא את הזקיקים על ידי סיבוב הקצה במעגלים ולחיצה קלה על הכיסוי כדי לפזר את הגרעינים באופן שווה. שלב זה אמור להימשך כדקה אחת. בדוק את איכות ההתפשטות עם מיקרוסקופ פאזה Olympus CX41 באמצעות מטרה של פי 20.
הכינו כריך על ידי הנחת כיסוי נוסף ליד הכיסוי המכסה את הכרומוזומים, וכסו אותם בשקופית מיקרוסקופ שנייה. זה מקטין את הסיכוי לרסק את המגלשה במלחציים. עטפו את השקופיות ביריעת פלסטיק המגיעה במיכלי שקופיות זכוכית ונייר סינון כדי להחזיק את הכריך ולהגן על המגלשה מפני שריטות עקב המברגים.
הפעל לחץ על המגלשות באמצעות מלחצים מכניים. לחץ של 85-120 אינץ'-פאונד מספיק ומושג באמצעות מפתח מומנט. שלב זה הכרחי להשטחת הכרומוזומים ככל האפשר.
הסר את שקופית המיקרוסקופ השנייה ואת הכיסוי הנוסף. מחממים את השקופית עם כיסוי המכסה את הכרומוזומים ל-55 מעלות צלזיוס במערכת דנטורציה/הכלאה של שקופיות למשך 10-15 דקות כדי לשטח עוד יותר את הכרומוזומים. טבלו את השקופית בחנקן נוזלי למשך 15 שניות לפחות, וכאשר הבעבוע נפסק, המשיכו להסיר במהירות את החלקה בעזרת סכין גילוח. הניחו מיד שקופיות באתנול 50% קר למשך 5 דקות. ייבשו שקופיות ב-70%, 90%, 100% אתנול למשך 5 דקות כל אחת. מגלשות יבשות באוויר.

2. FISH באמצעות מערכת צביעת שקופיות אוטומטית

התוכנית מוגדרת עם מערכת צביעת השקופיות האוטומטית Xmatrx כדי להפעיל את השלבים הבאים, למעט תיוג הבדיקה. פרוטוקול תיוג תרגום הכינוי המפורט מתואר בתיעוד המסופק עם DNA פולימראז מבית Fermentas.

לפני FISH, הכינו בדיקות פלואורסצנטיות על ידי תיוג DNA BAC גנומי עם פלואורוכרום באמצעות פרוטוקול תרגום ניק. מערבבים 1 מיקרוגרם של DNA, 0.05 מ"מ כל אחד של dATP, dCTP ו-dGTP ללא תווית ו-0.015 מ"מ dTTP, 1 מיקרוליטר Cy3- או Cy5-dUTP, 0.05 מ"ג/מ"ל BSA, 5 מיקרוליטר של מאגר תרגום 10x, 20 יחידות של DNA פולימראז I, 0.0012 יחידות של DNase I ומים נטולי נוקלאז ל-25 מיקרוליטר. יחס ה-DNA פולימראז I/DNase I נבחר באופן אמפירי כדי להשיג בדיקות בטווח גודל שבין 300 ל-500 bp. דוגרים את התערובת בחום של 15 מעלות צלזיוס למשך שעה.
הכנס שקופיות וריאגנטים למערכת צביעת השקופיות האוטומטית של Xmatrx והפעל את התוכנית כדי להפעיל את השלבים הבאים. מרחו 800 מיקרוליטר של 1x PBS למשך 20 דקות. לנשוף מגלשות עם אוויר. בצע קיבוע פורמלין על ידי מריחת 450 מיקרוליטר של 4% פורמלין ב-1x PBS למשך דקה אחת ולאחר מכן שטיפות עם 100% אתנול למשך שנייה אחת פעמיים ולמשך 2 דקות פעם אחת. לנשוף מגלשות עם אוויר.
מחליק חום ב-45 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות כדי למנוע בעבוע בעת מריחת הבדיקות. מרחו 20 מיקרוליטר מבדיקות ה-DNA, הוסיפו טיפות שמן מינרלי כדי למנוע אידוי של תמיסת הכלאה, והניחו כיסוי מעל. דנטורציה של כרומוזומים ובדיקות DNA על ידי חימום שקופיות ב-90 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
לצורך הכלאה, דגרו מגלשות בטמפרטורה של 42 מעלות צלזיוס למשך 14 שעות עם כיסויים. תמיסת ההכלאה מורכבת מ-2x SSC, 100 מ"מ נתרן פוספט, 1x תמיסת דנהרדט, 100 מיקרוגרם/מ"ל נתרן אזיד ו-10% דקסטרן סולפט בפורממיד.
לכביסות קפדניות, מחליק בחום ב-42 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות, הסר את הכיסויים, שטוף את המגלשות ב-2x SSC למשך שנייה אחת 4 פעמים. לנשוף מגלשות עם אוויר. יש למרוח 800 מיקרוליטר של 0.4x SSC ב-42 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות פעמיים. שטפו את המגלשות ב-2x SSC ב-25 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
בצע צביעת כרומוזומים על ידי מריחת 50 מיקרוליטר של 1 מיקרומטר YOYO-1 ב-1x PBS. מרחו טיפות שמן מינרלי כדי למנוע אידוי של תמיסת הצביעה, הניחו כיסויים ודגרו בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. הסר את הכיסויים, שטוף את המגלשות ב-2x SSC למשך שנייה אחת 4 פעמים. לנשוף מגלשות עם אוויר. מרחו 15 מיקרוליטר של מגיב נוגד דהייה. לבש כיסויים.

3. קריאת שקופיות עם מערכת הדמיה פלואורסצנטית אוטומטית

סעיף זה מפרט את השימוש בתוכנת Duet, שמגיעה כסטנדרט עם מערכת הסריקה האוטומטית ACCORD PLUS. ההוראות מתחילות לאחר ההפעלה בסדר זה: ספק כוח Olympus U-RFL-T לנורת הלוגן, מחשב Dell precision T3500, מיקרוסקופ Olympus BX61 עם מצלמה מחוברת Olympus U-CMAD3.

להגדרת 10x Pre-Scan, פתח את תוכנת Duet במערכת הסריקה האוטומטית ACCORD PLUS. לחץ על כפתור "מקוון". הזינו מזהה מקרה חדש והקצו מזהה שקופית. לחצו על הנקודה עם התווית "BF". זוהי אפשרות השדה הבהיר. הגדר אפשרות סריקה ל-"10x Prescan". השתמש ב"עיגול 2500x", "עיגול 10000x" או "מלבן". לחץ על "Set&run" עבור 10x Pre-Scan.
לחץ על כפתור "אישור" כדי להפעיל 10x Pre-Scan. פעל בהתאם להנחיות כדי לכוונן את הסריקה כראוי. לחץ על "סיום" כדי להתחיל את הסריקה. לחץ על הכרטיסייה "ראשי" כדי לחזור למסך הראשי. לחץ על כפתור "לא מקוון". מצא את מזהה המקרה ומזהה השקופית שהוקצו ולחץ על "סריקה לא מקוונת". בתיבה השחורה באזור השמאלי העליון לחץ על חץ ובחר "10x Prescan". באמצעות החצים (< || Δ > הידועים גם בשם כפתורי "אחורה", "השהיה", "הפעל", "קדימה"), עברו על התמונות הסרוקות.
לאחר מציאת תמונה מעניינת, לחץ פעמיים על המסך באמצע אזור היעד ולחץ על "הצמד". זה ימקד תמונה לצילום מאוחר יותר. לאחר בחירת כל היעדים, לחץ על "סווג". בחר "10x Prescan". לחץ לחיצה ימנית על תמונה וקבל את ההזדמנות לסווג את התמונות. בחר "פוליטן".
הגדר 40x Pre-Scan בתוכנת Duet. לחץ על "ראשי" כדי לחזור לתפריט הראשי. בחר שוב "מקוון". בחר שקופית. שנה את "BF" ל-"FL". שנה את שם המשימה ל-"Revisit-X40-RG". שנה את המקטע שמתחת להגדרה האחרונה ל"בקר שוב בכולם". לחץ על "Set&Run". לחץ על "אישור". עקוב אחר ההנחיות שוב כדי להגדיר את האוטומציה. לחץ על כפתור "התחל תצוגות תואמות" כדי להתאים תמונות 10x ו-40x. לחץ על "סיום" כדי להתחיל את הסריקה. לאחר שתסיים, לחץ על "סווג" והסתכל על התמונות.

4. תוצאות מייצגות

איור 1 מתאר באופן גרפי את התוכנית של הכנת כרומוזום בלחץ גבוה. שלב זה כולל תהליך של ריסוק והשטחה של כרומוזומים באמצעות כלי דרמל ומברגים מכניים, כמו גם הדמיית כרומוזומים באמצעות מיקרוסקופ ניגודיות פאזה. איור 2 ממחיש את ההכלאה של בדיקה עם תווית פלואורסצנטית כדי למקד DNA על הכנת שקופיות הכרומוזום באמצעות מערכת צביעת שקופיות אוטומטית, שימוש במיקרוסקופ סריקה אוטומטי להדמיה ומיפוי של הבדיקות לאחר ניסוי FISH, והצבה והכוונה של פיגומים גנומיים על הכרומוזומים.

הכנות של כרומוזומי פוליטן של תאי אחות שחלות מנקבות An. gambiae נעשו בטכניקת הלחץ הגבוה. שיטה זו אינה פוגעת ברוב מבנה הכרומוזומים או משנה אותו (איור 3). הוא משטח כרומוזומים מכופפים ובכך חושף רצועות עדינות נסתרות שלא נראות בתכשירים רגילים (איור 4).

הבדיקות המשמשות בפרוטוקול זה הן שיבוטי DNA גנומיים של BAC המתקבלים מספריית ND-TAM BAC שנוצרה מ-DNA של זן An. gambiae PEST. ה-DNA הגנומי של ספרייה זו חולץ מזחלי כוכב ראשון שזה עתה בקעו משני המינים. איור 5 מציג את התוצאות של FISH באמצעות שיבוטי BAC הכלאה לכרומוזומי פוליטן של An. gambiae. הליך זה בוצע באמצעות מערכת צביעת השקופיות האוטומטית Xmatrx. באמצעות מפת ציטוגנטית עבור An. gambiae¹⁰, שני שיבוטי BAC, 102B24 (GenBank: BH372701, BH372694) ו-BAC 142O19 (GenBank: BH368703, BH368698), אותרו בתת-חטיבות 16C ו-16D של זרוע 2R, בהתאמה. עם זאת, חיפוש BLAST נגד מכלול AgamP3 ¹⁴ של זן An. gambiae PEST זיהה את הרצפים ההומולוגיים ל-102B24 ו-142O19 בחלוקות משנה 16B ו-17A של זרוע 2R, בהתאמה (טבלה 1). לכן, ניתן כעת להתאים את ההתאמה בין הקואורדינטות הגנומיות לחלוקות הציטוגנטיות בהתאם לנתוני המיפוי שלנו. חיפוש BLAST כנגד מכלולי הגנום של צורת An. gambiae M וצורת S מצא ששני שיבוטי ה-BAC ממוקמים בקונטיגים שונים, אך באותם פיגומים בתוך כל צורה (טבלה 1). כעת ניתן לשייך את הקונטיגים שזוהו למיקומים כרומוזומליים ספציפיים. יתר על כן, הפיגומים שזוהו יכולים כעת להיות מכוונים כראוי בתוך תת-החלוקות הציטולוגיות 16CD. מעניין שהמרחקים בין רצפי 102B24 ו-142O19 בפיגומים הם 1,892,981 bp, 1,658,391 bp ו-1,688,426 bp במכלולי הגנום של זן PEST, צורת M וצורת S, בהתאמה. מכיוון שזן ה-PEST הוא הכלאה בין צורות M ו-S, ההבדל הזה נובע ככל הנראה מהרכבה לא נכונה של גנום ה-PEST.

<גבול טבלה="1"> BAC
(הצטרפות) זן PEST
AgamP3

קואורדינטות M-form
contigs

קואורדינטות M-form
פיגומים

קואורדינטות S-form
contigs

קואורדינטות S-form
פיגומים

קואורדינטות 102B24
(BH372694) 2R:AAAB0100
8844_26 (16B)< />
43,681,342-< > 43,681,874 ABKP020247
53.1< >
32,513-< > 33,045 EQ090167.1< />
1,858,377-< > 1,858,909 ABKQ010123
32.1< >
4,299-< > 4,832 EQ099711.1< />
215,891-< > 216,424 102B24
(BH372701) 2R:AAAB0100
8844_28 (16B)< />
43,788,213-< > 43,788,969 ABKP020247
51.1< >
24,816-< > 25,575 EQ090167.1,

1,772,683-< > 1,773,442 ABKQ010123
35.1< >
27,782-< > 28,540 EQ099711.1,

305,514-< > 306,272 142O19
(BH368698) 2R:AAAB0100

8805_5 (17A)< /> 45,428,580-< > 45,429,264 ABKP020247
01.1< >
2,499-< > 3,185 EQ090167.1< />
315,806-< > 316,492 ABKQ010123
76.1< >
49,242-< > 49,942 EQ099711.1< />
1,791,625-< > 1,792,325 142O19
(BH368703) 2R:AAAB0100
8805_8 (17A)< />
45,560,099-< > 45,574,323 ABKP020220
17.1< >
30,971-< > 32,469 EQ090167.1< /> 200,518-< > 202,016 ABKQ010123
79.1< >
27,760-< > 28,508 EQ099711.1< />
1,903,569-< > 1,904,317

טבלה 1. תוצאות BLAST של רצפי קצה ה- BAC כנגד מכלולי הגנום של An. gambiae.

figure-protocol-1
איור 1. ייצוג סכמטי של הכנת כרומוזומים בלחץ גבוה. שחלות יתושים מוצגות בשלב ההתפתחות הנכון.

figure-protocol-2
איור 2. סכימה המייצגת FISH אוטומטי, סריקת שקופיות ומיפוי כרומוזומים של פיגומים גנומיים.

figure-protocol-3
איור 3. התפשטות של כרומוזום פוליטן 3 של An. gambiae המתקבלת בטכניקת הלחץ הגבוה. 3L ו-3R מסמנים זרועות שמאל וימין בטלומרים שלהם. PH ו-IH מצביעים על הטרוכרומטין פריצנטרי ובין-קלרי, בהתאמה.

figure-protocol-4
איור 4. השוואה בין כרומוזומי פוליטן An. gambiae שהוכנו בטכניקה המסורתית (למעלה) וללחץ גבוה (למטה). התמונות מכסות את תת-החלוקה 29A-30E של זרוע 3R (A) ו-43D-46D של זרוע 3L (B).

figure-protocol-5
איור 5. דגים של שיבוטי BAC לכרומוזומי פוליטן של An. gambiae. א) הכלאה של 102B24 (אות אדום) עם זרוע 2R. ב) FISH בצבע כפול של 102B24 (אות אדום) ו-142O19 (אות כחול) לחלוקות משנה 16C ו-16D של זרוע 2R המתוחה, בהתאמה. החצים מצביעים על אותות של הכלאה של שיבוטי BAC המסומנים ב-Cy3 (אדום) ו-Cy5 (כחול). C-האזור הצנטרומרי. a/+ מציג את ההיפוך ההטרוזיגוטי 2La. הכרומוזומים הוכתמו עם הפלואורופור YOYO-1.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

השלב הקריטי ביותר בהליך בלחץ גבוה הוא ריסוק נכון של תאי אחות השחלה שבודדו בשלב השלישי של התפתחות השחלות של כריסטופרס¹³. ריסוק לא תקין עלול להוביל לכרומוזומים לא מפוזרים מספיק, מה שעלול לגרום לבעיות כאשר מנסים לקבוע את מיקומי הבדיקה לאחר FISH. אם הכרומוזומים נמעכים יתר על המידה, הם יכולים להישבר או להתארך עד לנקודה שבה דפוסי הפסים הולכים לאיבוד. ייצור של שקופיות מרובות אמור להוביל לעקביות בעת ניסיון למעוך את השקופיות באמצעות כלי Dremel, מה שיגדיל את יעילות ייצור השקופיות הכוללת. טכניקת הלחץ הגבוה פותחה לראשונה עבור בלוטות רוק מבודדות טריות של D. melanogaster⁹. עם זאת, שחלות של יתושים נשמרות באופן שגרתי בתמיסת הקיבוע של קרנוי (3 מתנול: 1 חומצה אצטית קרחונית בנפח) לפני שהן משמשות לתכשירים כרומוזומליים. לכן, שינינו את פרוטוקול הלחץ הגבוה הקיים כדי להתאים אותו לכרומוזומי הפוליטן של תאי האחות הקבועים של יתוש המלריה An. gambiae. מכיוון שהלחץ הגבוה מופעל באמצעות מלחצים מדויקים בעלי משטח עבודה מקביל מאוד של המגלשה כולה, לוקח הרבה פחות זמן להכין את דלעת הכרומוזום מאשר שימוש בטכניקת הקשה מסורתית עם מחק עיפרון.

צעדים חשובים אחרים כוללים השריית זקיקים מספיק בחומצה פרופיונית של 50% וחימום המגלשה. שני השלבים הללו חיוניים בסיוע בהשטחת הכרומוזומים. אם הם מוזנחים, הכרומוזומים יכולים להיראות מבריקים לאחר התייבשות, מה שעלול להוביל לשפע יתר של רקע שניתן לטעות בו כאות ב-FISH. טכניקת הריסוק בלחץ גבוה עובדת היטב גם באמצעות אותם פתרונות בעת הכנת תכשירי כרומוזומים מיטוטיים. ההתפשטות וההשטחה הנוספת עוזרת לבטא טוב יותר את הכרומוזומים מהגרעינים שלהם. הוספת לחץ שווה אמורה לשטח אותם בהתאם כדי לאפשר מדידות ורזולוציה טובה יותר של רצועות הנראות מכתמים. הפרטים על בידוד כרומוזומים מיטוטיים מיתושים ניתנים במקום אחר¹⁵. למרות שתכשירי דלעת רגילים מספיקים למטרות רבות כולל FISH ¹⁶ ו-immunostaining¹⁷, שיטת הלחץ הגבוה לא רק מורידה את השונות הפוטנציאלית משקופית אחת לאחרת, אלא גם מגבירה את איכות הכרומוזומים הכוללת, מה שמוביל לפירוט גבוה יותר בעת מיפוי כרומוזומים. הליך זה יכול לשמש גם להכנת שקופיות ממברנת כרומוזום פוליטן למיקרודיסקציה של לכידת לייזר.

מגבלות לשיטת הלחץ הגבוה כוללות שבירת שקופיות ומתיחה יתר של הכרומוזומים. שבירת מגלשה הנגרמת על ידי הפעלת לחץ רב מדי על המגלשה דרך המברגים אפשרית, אך מוגבלת על ידי שימוש בלחצים המצוינים במאמר. למתיחת יתר של הכרומוזומים, אם כלי הדרמל מוחל על המגלשה לפרק זמן ממושך, קיימת אפשרות שהכרומוזומים יכולים להימתח מדי ולאבד רזולוציה. ניתן לתקן זאת על ידי הפעלת הכלי לפרק זמן קצר, בדיקה במיקרוסקופ והפעלת זמן רב יותר עם כלי Dremel אם הכרומוזומים אינם מפוזרים מספיק.

פרוטוקול FISH מסורתי כולל מספר שלבי שטיפה ודגירה, שאורכם בדרך כלל 5-20 דקות ודורשים תשומת לב כמעט מלאה של חוקר במשך כל הניסוי. יתר על כן, מספר השקופיות שניתן לטפל בהן באופן ידני מוגבל בדרך כלל לכמה שקופיות בניסוי נתון. לעומת זאת, מערכת אוטומטית לצביעה על שקופיות מבצעת את כל השלבים (כולל כביסה, דגירה, יישום בדיקה, דנטורציה, הכלאה, יישום כיסוי והסרה) באופן אוטומטי. זה משחרר עד 6-8 שעות עבודה לחוקר בניסוי FISH. יתר על כן, מערכת FISH אוטומטית יכולה להגדיל משמעותית את התפוקה. לדוגמה, מערכת Xmatrx מסוגלת לעבד עד 40 בדיקות בשקופיות הכנה בודדות ועד 80 בדיקות בשקופיות הכנה כפולות בו זמנית. בין המגבלות של מערכת זו היא שהיא אינה יעילה למספר קטן של ניסויי FISH מכיוון שהיא דורשת הכנת כמויות גדולות של פתרונות. בנוסף, פרוטוקול FISH המתוכנת במערכת עשוי לדרוש שינויים והתאמות עבור יישומים חדשים.

מערכת סריקת שקופיות היא גרסה אוטומטית של מיקרוסקופ פלורסנט. הזזת במה אוטומטית ולוח בקרה פשוט של מיקרוסקופ משחררים את זמנו של החוקר והופכים את הפעלת המיקרוסקופ לפשוטה ביותר. לדוגמה, התוכנה במערכת הסריקה ACCORD PLUS מאפשרת לכידה קלה של ערוצים מרובים של פלואורסצנטיות, ורכישת תמונות קלה לניהול. דוגמה לכך היא הכללת לכידת z-stack, במקום צילום תמונה בודדת; התוכנה לוכדת ערימת Z הניתנת להגדרה של תמונות כדי להבטיח שלפחות תמונה אחת תישאר בפוקוס. למרות שמערכת זו מיועדת יותר לרכישת תמונות מרובות (הרבה תאים בשקופית אחת), היא עדיין הופכת את מציאת הכרומוזומים בשקופית להרבה יותר קלה מאשר ניווט בשקופית באופן ידני.

הן מערכת צביעת השקופיות האוטומטית והן מערכת הסריקה משמשות באופן שגרתי לאבחון FISH של הפרעות כרומוזומליות בתאים אנושיים על ידי מרפאות ציטוגנטיקה. במחקר זה, פיתחנו פרוטוקול המשתמש במערכות אוטומטיות אלה ליישום מחקר בסיסי. פרוטוקול המיפוי הפיזי האוטומטי בעל תפוקה גבוהה יכול להקל על פיתוח מהיר של מפות כרומוזומים פיזיות עבור כל מין מעניין. למרות שבדוח זה השתמשנו בכרומוזומי פוליטן למיפוי פיזי, ניתן להשתמש בכרומוזומים מיטוטיים גם עם מערכות אלה. זה יהיה שימושי אם הפרוטוקול יותאם לכרומוזומים מיטוטיים מכיוון שרוב האורגניזמים אינם מפתחים כרומוזומי פוליטן קריאים. עם זאת, כרומוזומי הפוליטן, כאשר הם זמינים, יכולים לספק מידע שימושי על ההתאמה של תחומי גנום פונקציונליים עם מבנה הכרומוזום ברזולוציה הגבוהה ביותר. העקרונות הארגוניים של כרומוזומי פוליטן, כגון דפוסים של רצועות ואינטרפסים, הושוו לאחרונה לזה של כרומוזומים רגילים שאינם פוליטנים (אינטרפאז)¹⁸. לכן, למיפוי הפיזי המפורט המבוצע על תכשירי כרומוזומים בלחץ גבוה יש פוטנציאל לקשר רצפי DNA למבנים כרומוזומיים ספציפיים כגון רצועות, פסים, נשיפה, צנטרומרים, טלומרים והטרוכרומטין; לפיכך, יצירת מכלולי גנום מבוססי כרומוזומים.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

לא הוכרז על ניגוד עניינים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי מענק מהמכונים הלאומיים לבריאות 1R21AI094289 לאיגור ו. שרחוב. מערכת צביעת השקופיות האוטומטית Xmatrx ומערכת הסריקה האוטומטית ACCORD PLUS נרכשו בעזרת תוכנית קרן הנאמנות לציוד, מכון מדעי החיים פרלין, המחלקה לאנטומולוגיה והמחלקה לביוכימיה של וירג'יניה טק.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
כיסויי מיקרוסקופ 22x22 מ"מ פישר		12-544-10
18x18 מ"מ כיסויי מיקרוסקופ	פישר	12-553-402
חומצה אצטית	פישר	A491-212
מתנול	פישר	A412-4
חומצה פרופיונית	סיגמא-אולדריץ	402907
כלי סיבובי Dremel 200 עם גל גמיש קובץ מצורף		מטחנת ספסל מיני רב-תכליתית Rand 3 אינץ' (עם מגביל קצב)
l קצות פלסטיק (קצוות פלסטיק חרוזים) לכלי Dremel	Pipetman	F171300	לחתוך ולחמם את קצה השומן של קצות הפיפט
מצופה פח מהיר	Avenger Gold Toolmaker	MTC-200-1	ריבוע טחון מדויק ומקביל לטווח של 0.00025
מפתח מומנט	אומן	44593
ThermoBrite מערכת דנטורציה/הכלאה של שקופיות	Abbott Molecular	30-144110
שקופיות מחסום 25 מ"מ	Abbott Molecular	XT108-SL
25 מ"מ כיסויים	Abbott Molecular	XT122-90X
Xmatrx מערכת צביעת שקופיות אוטומטית	Abbott Molecular	08L46-001
MZ6 Leica סטריאומיקרוסקופ	Leica	VA-OM-E194-354	ניתן להשתמש בסטריאומיקרוסקופ אחר
אולימפוס CX41 מיקרוסקופ פאזה	אולימפוס	CX41RF-5	ניתן להשתמש במיקרוסקופ פאזה שונה
ACCORD PLUS מערכת סריקה אוטומטית	BioView (ארה"ב)	BV-5000-ACCP
10x PBS	Invitrogen	P5493
10% NBF (פורמלין חוצץ ניטרלי)	Sigma-Aldrich	HT501128
99% פורממיד	פישר סיינטיפיק	BP227500
מלח נתרן דקסטרן סולפט	Sigma	D8906
20x SSC buffer	Invitrogen	AM9765
נתרן פוספט	Sigma-Aldrich	S3264
50x הפתרון של דנהרדט	Sigma-Aldrich	D2532
נתרן אזיד	Sigma-Aldrich	S2002
1 מ"מ YOYO-1 תמיסת יודיד (491/509) ב-DMSO	Invitrogen	Y3601
מגיב אנטי-דהייה ProLong Gold	Invitrogen	P36930
dATP, dCTP, dGTP, dTTP	Fermentas	R0141, R0151, R0161, R0171
Cy3-dUTP, Cy5-dUTP	GE Healthcare	PA53022, PA55022
BSA	Sigma	A3294
DNA פולימראז I	Fermentas	EP0041
DNase I	Fermentas	EN0521

' תוכנן במיוחד 200 μ

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Genome 10K: a proposal to obtain whole-genome sequence for 10,000 vertebrate species. J. Hered. 100, 659-674 (2009).
Robinson, G. E., et al. Creating a Buzz About Insect Genomes. Science. 331, 1386-1386 (2011).
Project description at Broad Institute [Internet]. , The Eli and Edythe L. Broad Institute of Harvard and MIT. Cambridge, MA. Available from: http://www.broadinstitute.org/annotation/genome/anopheles/ (2012).
Besansky, N. Genome Analysis Of Vectorial Capacity In Major Anopheles Vectors Of Malaria Parasites. White Paper. , 1-15 (2008).
Alkan, C., Sajjadian, S., Eichler, E. E. Limitations of next-generation genome sequence assembly. Nature. 8, 61-65 (2011).
Sharakhova, M. V., et al. Update of the Anopheles gambiae PEST genome assembly. Genome Biol. 8, R5(2007).
Lewin, H. A., Larkin, D. M., Pontius, J., O'Brien, S. J. Every genome sequence needs a good map. Genome Res. 19, 1925-1928 (2009).
Bhutkar, A., et al. Chromosomal rearrangement inferred from comparisons of 12 Drosophila genomes. Genetics. 179, 1657-1680 (2008).
Novikov, D., Kireev, I., Belmont, A. S. High-pressure treatment of polytene chromosomes improves structural resolution. Nature. 4, 483-485 (2007).
George, P., Sharakhova, M. V., Sharakhov, I. V. High-resolution cytogenetic map for the African malaria vector Anopheles gambiae. Insect Mol. Biol. 19, 675-682 (2010).
FISH Complete Automation [Internet]. , Abbott Laboratories. Abbott Park, IL. Available from: http://www.abbottmolecular.com/products/instrumentation-automation/fish/fish-automation.html (2012).
The ACCORD system [Internet]. , BioView Ltd. Billerica, MA. Available from: http://www.bioview.co.il/htmls/article.aspx?c0=12510&bsp=12332&bss53=12332 (2012).
Clements, A. N. The Biology of Mosquitoes: Development, Nutrition and Reproduction. , Chapman & Hall. (1992).
BLAST @ VectorBase.org [Internet]. , VectorBase.org. Notre Dame, IN. Available from: http://agambiae.vectorbase.org/Tools/BLAST/ (2012).
Sharakhova, M. V., et al. Imaginal discs--a new source of chromosomes for genome mapping of the yellow fever mosquito Aedes aegypti. PLoS Negl. Trop. Dis. 5, e10(2011).
Scriven, P. N., Kirby, T. L., Ogilvie, C. M. FISH for Pre-implantation Genetic Diagnosis. J. Vis. Exp. (48), e2570(2011).
Cai, W., Jin, Y., Girton, J., Johansen, J., Johansen, K. M. Preparation of Drosophila Polytene Chromosome Squashes for Antibody Labeling. J. Vis. Exp. (36), e1748(2010).
Vatolina, T. Y., et al. Correction: Identical Functional Organization of Nonpolytene and Polytene Chromosomes in Drosophila melanogaster. PLoS ONE. 6, (2011).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

FISH Anopheles gambiae Nick Translation

תפוקה גבוהה מיפוי פיזי של הכרומוזומים באמצעות אוטומטי באתרו הכלאה

במאמר זה

סיכום

תקציר

פרוטוקול

דיון

גילויים

תודות

חומרים

מקורות

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

מאמרים קשורים