מאמר שיטה

כושר ניתוח כמותי של זרימת עבודה

DOI:

10.3791/4018

⸱

13 באוגוסט 2012

 ,  , 
1Institute for Cell and Molecular Biosciences, Newcastle University Medical School

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ניתוח כמותי כושר (QFA) היא סדרה משלימה של שיטות ניסיוניות חישובית לאומדן fitnesses התרבות חיידקים. QFA מעריך את ההשפעה של מוטציות גנטיות, תרופות או טיפולים אחרים החלים על הצמיחה חיידק. ניסויים דרוג מניתוח מרוכז של תרבויות בודדות לאלפי תרבויות מקבילות יכול להיות מתוכנן.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ניתוח כמותי כושר (QFA) היא עבודה ניסיונית חישובית להשוואת fitnesses של תרבויות חיידקים הגדלים 1,2,3,4 במקביל. QFA יכול להיות מיושם על תצפיות ממוקד של תרבויות בודדים אך הוא שימושי ביותר עבור אינטראקציה הגנום כולו גנטית או מסכי סמים לחקור עד אלפי תרבויות בלתי תלויים. שיטת הניסוי המרכזי הוא חיסון של עצמאיים, תרבויות לדלל חיידקים נוזלי על גבי צלחות אגר מוצק אשר מודגרת וצילם באופן קבוע. צילומים מנקודת זמן זו מנותחים, ייצור כמותי צפיפות התאים הערכות, המשמשים לבניית עקומות גדילה, המאפשר כושר צעדים כמותיים שניתן להפיק. Fitnesses תרבות אפשר להשוות לכמת ולדרג את נקודות החוזק אינטראקציה גנטיים או רגישויות סמים. ההשפעה על כושר התרבות של טיפולים כלשהם הוסיף לתוך המצע אגר (מולקולות קטנות כגון אנטיביוטיקה או תזונה) או להחיל את לוחות חיצוניתLY (UV למשל קרינה, טמפרטורה) ניתן לכמת ידי QFA.

עבודה QFA מייצרת צמיחה מעריך מקביל לאלה שהושגו על ידי מדידת spectrophotometric של תרבויות נוזלי מקבילים קוראים צלחת 96-200-טוב או טוב. חשוב לציין, QFA יש תפוקה גבוהה באופן משמעותי בהשוואה לשיטות כאלה. תרבויות QFA לגדול על פני אגר מוצק ולכן הם מאוורר היטב במהלך הצמיחה ללא צורך לערבב או רועד.

התפוקה QFA אינו גבוה כמו זה של מערך גנטי כלשהו סינתטי (SGA) שיטות ההקרנה 5,6. עם זאת, מאז תרבויות QFA הם בדילול בכבדות לפני מחוסן על אגר, QFA יכול ללכוד עקומות גדילה שלם יותר, לרבות מעריכי שלבי הרוויה 3. כך, למשל, עקומת גדילה תצפיות לאפשר הכפלת פעמים תרבות כדי לאמוד באופן ישיר עם דיוק גבוהה, כפי שצוין קודם לכן 1.

כאן אנו מציגיםספציפית QFA הפרוטוקול מיושם על אלפי ש ' cerevisiae תרבויות אשר טיפל באופן אוטומטי במהלך הדגירה חיסון, והדמיה על ידי רובוטים. כל הפעולות האוטומטיות יכול להיות מוחלף על ידי ההליך, שווה ערך ידנית, עם ירידה קשור התפוקה, ויש לנו גם להציג ידנית נמוך פרוטוקול התפוקה. הכלים אותם QFA התוכנה ניתן להחיל על תמונות שנתפסו בזרימת העבודה או.

יש לנו ניסיון רב ביישום QFA לתרבויות של שמרים ניצני ס cerevisiae אך אנו צופים כי QFA יהיה שימושי באותה מידה לבחינת תרבויות של שמרים ביקוע ס pombe ותרבויות חיידקים.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מדריך QFA Protocol (עבור זנים ס cerevisiae)

1. שמרים culturing זנים

  1. עד 96 זני שמרים מתורבתים עצמאיים ב μl 200 של התקשורת נוזלי עשיר בצלחת 96-גם תרבות. זנים מגודלים כדי הרוויה בטמפרטורה מבוקרת חממה.
  2. סיכה 96, 1/8 "בקוטר ידנית העתק plater (SIGMA R-2508) מעוקר על ידי 1 טובל plater העתק באתנול 100%, בוער ואז עוזב להתקרר.
  3. 200 μl של מים סטריליים הוא ערוכים בצלחת 96-גם תרבות. התרבויות רוויים vortexed (Eppendorf MixMate, 30 שניות, 750 סל"ד) ו בדילול ידי טבילה כלי סיכה ומעוקר לתוך זנים רווי שלוש פעמים לתוך צלחת ובה מים אחת.
  4. כלי סיכה מחדש עיקור לפי 1.2.
  5. כלי סיכה ומעוקר משמש לזהות את התרבות בדילול מלא על צלחות אגר הנמכרים על ידי טבילה לתוך צלחת ובה התרבות בדילול מלא פי שלושהn העברת כלי הצמד צלחת אגר מלבני מוצק.
  6. צלחות המלבני אגר מוצק מודגרת בטמפרטורה המתאימה לפני צילמו באופן ידני באמצעות S & P רובוטיקה spImager. שיטות חלופיות ללכוד תמונה ניתן גם לשמש כגון FujiFilm LAS4000, או מצלמה דיגיטלית SLR זול יותר אם הטיפול נלקח על מנת להבטיח אפילו תאורה ומיקום צלחת עקבית יחסית למצלמה הדמיה.
  7. השיטה ניתנת להתאמה מספרים קטנים יותר של תרבויות מקבילות, כגון 48, אשר ניתן להתקין על גבי צלחות פטרי עגולים אם הטיפול נלקח על מנת להבטיח את הזווית היחסית אותה למצלמה במהלך כל צילום הדמיה.

אוטומטי לחלוטין QFA Protocol (עבור זנים ס cerevisiae)

2. שמרים culturing זנים

  1. להתחיל עם מערך מלבני של זני שמרים עצמאיים גדל על אגר מוצק. בדוגמה זו הזנים החל הם תוצאה של מעבר חוםשאילתה מוטציה רגישה עם אוסף שמרים מחיקה (YDC) על ידי מערך גנטי סינתטי (SGA). גמר צלחות SGA הם בפורמט 1536. זה 16 שורות של 24 עמודים של מושבות / תרבויות המייצגות 4 משכפל של 384 זני שמרים עצמאיים. ראה איור 1 עבור פריסות צלחת.
  2. 384 זנים מתוך 1536 מועברים באמצעות רובוט S & P רובוטיקה Inc BM3-SC רובוט עם 96 פינים, 1 מ"מ בקוטר סיכה pintool סטרילית לארבע צלחות תרבית 96-המכילים גם 200 μl של התקשורת סלקטיבית (איור 1). ניקיון Pintool ועקרות מושגת על ידי ברצף כביסה במים סטריליים פעמיים (פעם אחת עם מברשת מסתובבת כדי להסיר שאריות), אתנול 70% (עם sonication) ולבסוף 100% אתנול.
  3. תרבויות מגודלים כדי רוויה (שלושה ימים בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס בדוגמה זו, ראה איור 1).

3. הבחינה תרבויות שמרים

  1. שימוש Biomek Beckman FX, תרבויות רווימחדש resuspended ידי vortexing על Teleshake Variomag (נגד כיוון השעון ב 1000rpm למשך 20 שניות) ו בדילול 1:70 בערך ידי מצמיד למים 200 סטרילית μl שימוש סטרילי 96 פינים רובוטית כלי סיכה (V & P מדעי מגנטי גובר pintool, 2 פינים בקוטר מ"מ). כלי סיכה ניקיון עקרות מושגת על ידי שטיפה במים סטריליים, כביסה באתנול 70% (עם מברשת כדי להסיר שאריות) ולבסוף טבילה באתנול 70% בעקבות הייבוש.
  2. תרבויות מדולל הם הבחינו על צלחות אגר מוצק בפורמט 384 באמצעות הכלי אותו סיכה רובוטית (ראה איור 1) לאחר ניקוי ועיקור.
  3. אחרי הצמיד, צלחות מועברים הטמפרטורה Cytomat מבוקר, בחממה humidified עם קרוסלה אוטומטי האץ' גישה.

4. לכידת תמונה

  1. S & P רובוטיקה אוטומטי imager מסיר שוב ושוב את הצלחות מן החממה Cytomat, מסיר את המכסה בצלחת, ממקמת אותם בדיוק מתחת לתחוםד, חלל מואר באופן אחיד מתחת Canon EOS Rebel Ti 35mm DSLR, לוכדת תמונה ב 5184 x 3456 פיקסלים ברזולוציה, מחליף את המכסה בצלחת, ומחזירה להם קרוסלה חממה. תמונה אחת הוא נתפס מיד לאחר ההעברה הראשונית בחממה כדי לאפשר מדידת הצמיחה אפס נקודת זמן (ברקע). טיפול רובוט וצילום לוקח 2 דקות לכל צלחת.
  2. עם קרוסלה טעון, תמונה מקסימלית השגה הצלחת ללכוד תדר הוא תמונה אחת כל שש שעות. צלחות מודגרת עד שישה ימים (עד רוויה גידול המושבה. איור 1 מציג שלוש תמונות אופייני כמובן פעמי ב 20 ° C.
  3. למטרות מעקב, צלחות נקראים על פי חממה, שם הטמפרטורה, מספר ייחודי אצווה עמדה רציפים ו בחממה. שמות תמונה הן שרשור שם צלחת חותמת ו נבנים באופן אוטומטי עם לכידת תמונה (למשל K000011_030_010_2011-09-22_09-47-54.jpg, סוג קובץ FT1, טבלה 1).

5. צלמו של מטה ניסויית

הקבצים מטה המתוארים בסעיף זה הם מופרד באמצעות טאבים קבצי טקסט אשר שנוצר באופן ידני (למשל באמצעות תוכנת גיליון אלקטרוני). תיאור הקובץ ניסויית (לוח FT2, 1) היא ייחודית כל ניסוי, אבל תיאור הספרייה (FT3, טבלה 1) ניתן מחדש נעשה שימוש נרחב נבנה פעם אחת.

  1. הניסוי המתואר בקובץ תיאור ניסיוני (FT2, טבלה 1) המכיל עמודות עבור ברקוד (או שם צלחת באופן אוטומטי), חותמת הניסוי החל, טיפול צלחת, תוכן בינוני אגר מוצק, כינוי, ספריה, מספר לוחית (לספריות עם הצלחות מרובות) ומספר חוזר ברבע (ראה איור 1) על קנה המידה במורד מתבנית 1536 לפורמט 384.
  2. הספרייה זן שמרים מתואר עם קובץ ספריית תיאור (FT3,
  3. שם אופציונלי תקן ג'ין הקובץ (FT4, טבלה 1) המתאר את שם הגן הרגילה (למשל RAD9) קשור כל ORF שיטתית Y-מספר (למשל YDR217C) זיהוי זנים שהוקרנו ניתן לספק. קובץ זה מכיל שתי עמודות: שם ORF & ין.

6. ניתוח נתונים

עבודה QFA חישובית מחייבת גישה לתחנת העבודה מרובי עוצמה סבירה המחשב (למשל Dell Precision T3500 עם Xeon Quad-Core 2.67 GHz מעבד 12GB RAM) שבו מותקנת תוכנת ניתוח תמונת Colonyzer כלי 3,4 ו R חבילה QFA 7 , שניהם מתועדים באינטרנט, הם זמינים באופן חופשי ולרוץ על מגוון מערכות הפעלה.

  1. הפעל Colonyzer עם כל אחד צלחת תמונות שנתפסו כקלט, הפקת פלט אחד Colonyzer הקובץ (לוח FT5 1) עבור כל תמונה בשבי. קבצים Colonyzer פלט לציין צפיפות תרבות הערכות, אזור התרבות, צורה וצבע עבור כל אחד 384 מקומות על צלחת הדמיה. קובץ הפלט מועתק באופן אוטומטי קובץ מקור התמונה (למשל את התמונה צלחת K000011_030_010_2011-09-22_09-47-54.jpg (FT1, טבלה 1) תואם לקובץ הפלט Colonyzer K000011_030_010_2011-09-22_09-47-54.dat ( FT5, לוח 1)).
  2. באמצעות חבילת R QFA, טען מטה ניסיוני (FT2, טבלה 1) וקבצים Colonyzer פלט (לוח FT5 1). נתונים אלה ימוזגו לתוך מסגרות R נתונים (שיכולה להיות מיוצא בשם QFA קבצי נתונים גולמיים (טקסט FT6, לוח 1)) לצורך ניתוח נוסף.
  3. חבילת R QFA מכיל פונקציות לאסוף צפיפות timecourses התא עבור כל תרבות, כדי להתאים Lo להכלילמודלים האוכלוסייה gistic על תצפיות ועל העלילה הן (ראה איורים 2 ו -3 על דוגמאות). ערכי פרמטרים מצויד נכתבות קבצים QFA פרמטר לוגיסטיים (FT7 טבלה 1). ראה QFA תיעוד R החבילה לקבלת פרטים נוספים.
  4. חבילת R QFA מכיל גם פונקציות של בקרת איכות: מושבות קצה מבוטלים בשל זמינות גבוהה יותר של חומרים מזינים בשולי צלחת וקושי עם ניתוח תמונה ליד קירות צלחת, תרבויות אשר נכשל SGA ו גנוטיפים הצגת הקשר עם מסך ספציפיים גנים סמן יוסרו ניתוח.
  5. כמה צעדים כמותיים כושר נגזרות לוגיסטיים מודל פרמטרים אוכלוסייה כל תרבות. אלה כוללים הכפלת האוכלוסייה שיעורי מקסימום (MDR) ומספר חטיבות של חיסון כדי רוויה (MDP). עבור כל קבוצה של תרבויות לשכפל (של גנוטיפ ייחודי למשל) ועל הגדרה של כל כושר, סטטיסטיקה סיכום של מספר הערכות הכושר computed: ממוצע וחציון, כושר כושר סטיית תקן של מספר משכפל ציין. סיכום הנתונים הסטטיסטיים הם הפלט קבצים QFA כושר סיכום (FT8, טבלה 1) לניתוח נוסף, למשל חישוב של עשרות אינטראקציות גנטיות (FT9 טבלה 1).

7. נציג תוצאות

תרשים 2 מציג 1 עקומת גידול אופיינית מתוך 384 תרבויות QFA גדל ב 20 ° C על אגר מוצק כמו לכמת ידי Colonyzer, עם עלייה בצפיפות התא הראשון הופך לגילוי לאחר כ 2 ימים. עיכוב זה עלול ההשפעה המשולבת של שלב התרבות בעומר לאחר חיסון על בינוני מוצק הגבול התחתון של גילוי צפיפות התאים. איור 3 מציג 308 עקומות גדילה דומים שנתפסו מהצלחת אחד. איור 4 מדגים את ההשוואה בין 2 הגנום כולו QFA מסכי להסיק גנטיתאינטראקציה עוצמות (מותאם מ 1). R QFA חבילת 7 כוללת גם פונקציות לייצר איור 3 ו פלט רשימות מדורגת של גנוטיפים שנבדקו ושל האומדנים של כוח אינטראקציה גנטית (GIS), יחד עם הערך ש-(שיעור גילוי שקר (רוזוולט) תיקן p-value) עבור משמעות GIS הנצפה.

figure-protocol-1
באיור 1. קרן שנועדה למתן חיסון הרובוטית של זני שמרים בפורמט 384-Spot. הליך זה מתחיל ב 1536 תרבויות עצמאיות לכל צלחת (משמאל). בדוגמה זו אופיינית, מושבות על עמדות 1,1, 1,2, 2,1 ו 2,2 (בצבע אדום) הם 4 משכפל של גנוטיפ זהה his3 :: תרבויות KANMX בצהוב, גדל על שפת הצלחת. , יש יתרון הצמיחה בשל חוסר התחרות ולכן הם לא נבדק על ידי QFA. אחד כזה שכפול (למשל 1,1) הוא מחוסן לתוך התקשורת גדילה נוזלי בצלחת 96-טוב שימוש בכלי של 96 פינים אשר inoculates 96 מתוך 1536 מושבות בכל פעם. על מנת לחסן 1 לשכפל עבור כל אחד 384 מחיקות, ארבעה גנים שונים "הרביעים" (כפי אדום, כחול, ירוק וסגול) הם מחוסן לארבע 96-גם צלחות שונות המכילות מדיה הצמיחה. לאחר הצמיחה רוויה (למשל 3 ימים בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס), תרבויות הם מדולל במים, אז ארבעת הרביעים של חוזר 1 הם הבחינו בפורמט-384 על צלחת אגר מוצק (מימין) בתבנית זהה צלחת SGA המקורי (כפי שעולה צבע). התהליך יכול לחזור לבדוק את זה משכפל: 1,2, 2,1 ו 2,2. זמן לשגות דוגמה תמונות על הזכות נתפסו 0.5, 2 ו -3.5 ימים לאחר חיסון. מעובד מתוך איור משלים 1 2. לחץ כאן כדי להציג דמות גדולה .

018/4018fig2.jpg "/>
איור 2. רובוט אחד, נתפס QFA עקומת גדילה. עקומת) QFA הצמיחה של זן השמרים גדל על אגר המכיל גלקטוז על 20 ° C. תמונות נתפסו רובוט בערך כל 2 שעות. שלב מעריכי בטמפרטורת זה היה להבחין במשך כ 1.5 ימים, עם צפיפות הגידול תרבות 1 הופך לגילוי כ 2 ימים לאחר חיסון. מודל לוגיסטי כללית כשיר את הנתונים שנצפו (עקומת אפור). פרמטרים דגם מצויד באופן אוטומטי על ידי חבילת QFA R מוצגים: K (כושר הנשיאה (AU)), R (שיעור הצמיחה (ד -1)), G (צפיפות הבידוד (AU)), V (סימטריה צמיחה). ב) לגבי לוח, קשר קשר עם צפיפות התאים בהיקף יומן. לחץ כאן כדי להציג דמות גדולה .

figure-protocol-2
איור 3. באופן אוטומטי גן עקומות גדילה המדורגים בשבי במקביל מהצלחת 384 פורמט אחד. כל לוח מראה צפיפות התאים הערכות (צלבים אדומים) והתאמה למודל (עקומות שחורים) עבור תרבויות עצמאיות שכותרתו בשם גן או ORF Y-מספר גדל בהליך QFA. צלחת זו למשל היתה צילמו ידי הרובוט גדל באינקובטור אוטומטי על 20 ° C. מטה ניסיוני נכללים באופן אוטומטי בכותרת דמות: שם צלחת, צלחת הטיפול, בינוני אגר ואת מספר לוחית הספרייה. מצויד פרמטר ערכים מודל גם מודפס באופן אוטומטי על כל לוח (ראה איור 2). תרבויות מתקדמות הופשטו מניתוח QFA, עוזב את 308 תרבויות בחלקה זו (ראה פרוטוקול QFA 5.4). מאז תרבויות מתקדמות לא מנותחים QFA, במקומות האלה תרבות מלאים בדרך כלל עם זנים בקרה ניטרלי (pGAL-HIS3 במקרה זה). הגירסה המקורית של נתון זה, התפוקה על ידי חבילת QFA R, הוא. בפורמט PDF ולכן הוא zoomable לאין שיעור על ידי שאילתות חיפוש טקסט.:/ / Www.jove.com/files/ftp_upload/4018/4018fig3.pdf "target =" _blank "> לחץ כאן כדי להציג דמות גדולה.

figure-protocol-3
באיור 4. השוואת fitnesses משני מסכי QFA להסיק אינטראקציה גנטית. העלילה זה מציג השוואה בין הכושר של מחיקות שמרים ניצני (yfgΔ) בשילוב עם מוטציה ura3Δ ניטרלי או הטמפרטורה רגיש cdc13-1 המוטציה גדל בטמפרטורת חצי מתירנית של cdc13- 1 (27 ° C). כושר חושב כתוצר של הכפלת שיעור מקסימלי הכפלת הפוטנציאל המקסימלי 1. זנים מחיקה רוב לצמוח גם כאשר הוא משולב עם מוטציה ura3Δ נייטרלי, כצפוי ויש להם כושר גבוה, אבל מחיקות בשילוב עם cdc13-1 יש מגוון רחב של fitnesses. הקווים הכחולים הבהירים לחצות את ההודעות דואר של מוטציה his3Δ נייטרלי, קו מוצק הוא מודל רגרסיה ליניארית העצמאות גנטית (כושר ציפה של cdc13-1 yfgΔ מוטציות שניתנו הכושר של ura3Δ yfgΔ מוטציות) ואת קו מקווקו הוא קו של כושר שווה. מחיקות בצבע ירוק לשפר באופן משמעותי את הפגם הכושר של cdc13-1 זנים. מחיקות בצבע אדום באופן משמעותי לדכא את הפגם אותו. המרחק האנכי של מוטציה כלשהי cdc13-1 yfgΔ מקו קבוע מציין את עוצמת אינטראקציה גנטית בין cdc13-1 ו yfgΔ בתנאים צלחת. שים לב כמה מדכאי החזקים ביותר של cdc13-1 מזוהים בעבר גנים המחסום, RAD17, DDC1 ו RAD24 ו nuclease EXO1 ליד הימנית העליונה. גנים, אשר מפחית את המחיקה כושר כוללים YKU80 (קידוד תיקון דנ"א הטלומרים מכסת החלבון Yku80) ליד הימנית התחתונה. כמו כן שים לב כמה קבוצות של גנים לתפקד יחד נוטים להיות שיתוף הממוקם על מגרש זה. שלושה אשכולות לדוגמה מודגשים SPE1 כחול, SPE2 ו SPE3: גנים spermidine סינתזה, RAD17, DDC1 ו RAD24 רכיבים קידוד של מהדק את המחסום הזזה מהדק מחסום מטעין, MRE11, RAD50 ו XRS2: MRX מורכבת, מעורבים DDR ו EST1 & EST3: גנים המעורבים בוויסות אורך הטלומרים. מעובד מתוך 1B משלים איור 1, הנתונים הגולמיים מהם זה היה המגרש שנוצר ניתן להוריד מכאן: http://research.ncl.ac.uk/colonyzer/AddinallQFA/ . לחץ כאן כדי להציג דמות גדולה .

"> קובץ מזהה סוג קובץ נבנה באופן ידני עדכן את תדירות תנאי מוקדם FT1 הצלחת צילום לא לכל צלחת & timepoint כן FT2 תיאור הניסוי כן לפי הניסוי כן FT3 ספריית תיאור כן לכל ספרייה כן FT4 ין שמות סטנדרטיים כן לכל ספרייה לא FT5 Colonyzer Ouput לא לפי timepoint לכל צלחת כן FT6 QFA נתונים גולמיים לא לפי הניסוי - FT7 לא לפי הניסוי - FT8 QFA סיכום כושר לא לפי הניסוי - FT9 QFA Hitlist אינטראקציה גנטית לא לפי המחקר GIS (2 expts.) -

טבלה 1. אלקטרוניים קבצים QFA. כל הקבצים רשומים (למעט FT1) הם מופרד באמצעות טאבים קבצי טקסט ניתן לבנות או לקרוא באמצעות כל עורך טקסט או תוכנת גיליון אלקטרוני. לפרטים נוספים על בניית קבצים QFA מטה ועל פרשנות מדויקת של התפוקה QFA עיין בתיעוד R QFA חבילת 7 ו בתיעוד התוכנה Colonyzer 3.

figure-protocol-4
טבלה 2. שיטות להערכת כושר התרבות. סיכום של התכונות ודורשיםמפעלים של מספר שיטות להערכת כושר התרבות של חיידקים. סקירה על ידי Blomberg 8 מכילה השוואה מפורטת יותר של כמה מאלה. לחץ כאן כדי להציג דמות גדולה .

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

QFA הוא במובנים רבים ישירה צאצא של שלושה הספסל בקנה מידה שנקבעו טכניקות מיקרוביולוגיות: דילול תרבות ספוט סדרת בדיקות 9, עקומת גדילה נחישות תרבויות נוזל סודה 9 ו 13 ציפוי העתק. שלוש שיטות אלו מסוכמים ולעומת QFA אחרים תפוקה גבוהה טכניקות בטבלה 2. בעוד סדרת בדיקות דילול ספוט להגדיר הכושר של זן כפי יכולתו ליצור מושבות בסדרה של התרבויות שצמחו מתוך מגוון רחב של דילולים הבידוד, QFA אמצעים כושר זן ידי תצפיות חוזרות ונשנות של תרבות אחת על מנת לבנות עקומת גדילה. לכימות כושר מתרבויות יחיד מאפשר זנים רבים יותר כדי לבחון בעת ​​ובעונה אחת, בתנאים זהים. מערכים משכפלים של תרבויות מאפשר בדיקות חוזרות ונשנות של אוספים מתח, המועילה ביותר כאשר בודקים כושר הבדלים תרבות בסביבות שונות או רקע גנטי. פרוטוקול QFA הציגכאן משתמשת בציוד רובוטי יקר לשכפל, מחסן, לדגור צלחות אגר התמונה, המתאים לצפייה הצמיחה של אלפי תרבויות עצמאיות (QFA רובוטית, לוח 2). עם זאת, מאז QFA מבוסס על טכניקות מסורתיות מבוססות המעבדה, זה גם יכול להתבצע הרבה יותר בזול על ידי החלפת סיוע רובוט בצעדים ידנית (ידנית QFA, טבלה 2). מדריך QFA כרוך שכפול חיסון של תרבויות על גבי צלחות אגר באמצעות כלי סיכה ידני העברת ידנית של צלחות וממנה חממה לצילום. העבודה באותו ניתוח חישובית ניתן ליישם כדי ליצור עקומות גדילה של עיצוב או ניסיוני.

QFA הערכות כושר נראה מדויק יחסית. באיור 4, fitnesses הממוצע של ארבעה אשכולות לדוגמה תפקודית של מחיקות גנים הקשורים מודגשים. בסמיכות של בני המעמד גן פונקציונלי כל הקשור independ 2אף אוזן גרון רקע גנטי (ura3Δ ו cdc13-1) מציין את שחזור של הערכות QFA כושר. למשל, רק 3 מחיקות גנים (מתוך 4300 אפשרי) להפריד בין שלושה מבני מורכב MRX משומר.

תפוקה גבוהה חלופות QFA לבדיקת מאפייני הגידול של זני חיידקים כוללים SGA 5,6, מסכי התחרות בספריות המינימרקטים 11,12 ומסכי לכידת קינטיקה צפיפות אופטית של הקוראים צלחת spectrophotometric 10 אשר סיכם בטבלה 2 ותיאר באופן מלא יותר במקום אחר 8 . QFA וצלחות SGA, שבו תרבויות הגדלים על משטחים מוצקים אגר (שיטות המבוססות על אגר, טבלה 2) ניתן לטפל בקלות ובמהירות על ידי רובוט. מוצקים פני תרבויות אגר הם מאוורר היטב ברחבי צמיחה התאים יכולים לגדול בתרבויות קבועים, ומאפשר חיידקים חברותיים לגדול בקהילה 14. נותר בשלמותו, קהילות מיקרוביאלי כמהffect שלהם מיקרו סביבות הפרשת רעלים, כמו אתנול, ואולי איתות בין תאים. עם זאת, ערבוב רציף של תרבויות נוזלי, הדרושים כדי להשיג אוורור הולם, משבש באופן מלאכותי קהילות מיקרוביאלי וסביבות מיקרו שלהם אשר עשוי להשפיע על מצבי שלהם של צמיחה. חוצה זיהום הוא פחות דאגה בשיטות אגר מוצק שכן יש פחות הזדמנויות עבור כתמים נוזליים שנשאו תאים בין תרבויות. אם הזיהום מתרחש בדרך האוויר שמקורן בחיידקים זרים מבחני אגר מוצק, היא לעתים קרובות ניתן להבחין באמצעות בדיקה ויזואלית של צלחות אגר מוצק היוו או להסירו.

התפוקה QFA גבוה באופן משמעותי מזה של שיטות נוזלי מקבילים בשתי דרכים. קודם כל, על QFA (ו SGA) צלחות, תרבויות מחוסן ארוזים יחד יותר בצפיפות, נותן תרבויות עצמאיות יותר בכל צלחת. ב QFA יש בדרך כלל 308 תרבויות, לא כולל הלא ניסיוניים תרבויות מתקדמות (איור 1) comבשורה התחתונה, שטיין במקביל בתרבויות נוזלי עם 96 או 100 תרבויות בכל צלחת. שנית, ניסויים QFA וניתן לשנותם למספר הרבה יותר גדול של צלחות. בעוד מספר הצלחות ניתח בניסוי QFA אחת מוגבל רק על ידי השטח הזמין בחדר חממה או חם, לכידת המינימום המותר בתדירות התמונה בתדירות מקסימלית לכידת השגה, מספר הצלחות בניסוי גידול נוזלי הוא מוגבל מאוד לפי נפח את הקורא הצלחת (בדרך כלל אחת או שתיים הצלחות), או של מערם מחובר הקורא את הצלחת (בדרך כלל 25-50 לוחיות). ביצענו לאחרונה את הניסוי אוטומטי לחלוטין QFA על 123 צלחות, כל אחד עם 308 בתרבויות ניסיוניות, נותן 37,884 תרבויות בו זמנית. אנו מעריכים כי המספר המרבי של השגה תרבויות עצמאיות הגדלים נוזלי היא 96 (תרבויות / צלחת) x 50 (צלחות / מערם) = 4800, שזה בערך פי 10 פחות מאשר התפוקה QFA שלנו. אלטרנטיבי מסכי תרבות נוזלי הוא לנצל רבים אוטומטי Groמכשירים wth במקביל (טבלה 1 מביקורת על ידי Blomberg 8), כל אחד בעל קיבולת של אחד או 2 צלחות. בקרת הטמפרטורה במכשיר זה הוא עצמאי, ולכן התנאים אינם זהים, אבל בהנחה שהם, זרימת עבודה זו תדרוש לפחות 190 מכשירים כאלה כדי להתאים את התפוקה QFA (בהנחה 200 תרבויות נוזלי לכל מכשיר).

לסיכום, QFA היא עבודה באיכות גבוהה שניתן להחיל מועילה לאסוף פנוטיפים צמיחה כמותיים בשני ניסויים קטנים ממוקד לגודל תפוקה גבוהה מסכים. היא גמישה מספיק כדי ליישם ביעילות עם דרישות שונות עבור ציוד רובוטי. מרכיב חישובית של זרימת העבודה QFA מבוסס על הקוד, זמין בחינם קוד פתוח.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אין ניגוד עניינים הצהיר.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו בתודה להכיר את כל חברי המעבדה שלנו המרכז לביולוגיה מערכת משולבת של הזדקנות ותזונה (CISBAN) עבור תמיכה דיונים מועילים. מחקר זה נתמך על ידי ביוטכנולוגיה ו מחקר מדעי הביולוגיה המועצה (BBSRC) (BB/C008200/1) ואת האמון Wellcome (075294, 093088).

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
שם מגיב / ציוד חברה מספר קטלוגי תגובות
העתק Plater סיגמא R-2508 96 פינים ידנית pintool עם 1/8 "בקוטר סיכות
מערבבים Mate Eppendorf 5353 000.014
Biomek FX Beckman A31842
Teleshake Thermo Scientific 50095890 מותקן Biomek FX
BM3-SC S & P רובוטיקה בע"מ BM3-SC 192 קרוסלה מסתובבת המדף
spImager S & P רובוטיקה בע"מ spImager הדמיה ברזולוציה גבוהה ידנית
spImager עם Cytomליד S & P רובוטיקה בע"מ מנהג טמפרטורה מבוקרת ברזולוציה גבוהה הדמיה אוטומטית
Cytomat 6001 עם מחליף חום Thermo Scientific 51022222 מצורף spImager
Ecoline RE207 יתירה מאונ RE207 מצורף Cytomat
spImager עם קרוסלה S & P רובוטיקה בע"מ מנהג אוטומטי ברזולוציה גבוהה הדמיה
כלי רובוט PIN אביזר עבור FP12pins V & P מדעי AFIX96FP12 N / A
96 x FP12 סיכות V & P מדעי FP12 50.4 מ"מ אורך, 17 מ"מ אורך חשיפה סיכה
תחנת עגינה עבור כלי פין V & P מדעי VP425 בסיס תחנת עגינה להסיר כדי לאפשר ייבוש המאוורר של סיכות
הצמד מברשת ניקוי V & P מדעי VP425 N / A
העתק Plater סיגמא R-2508 סיכה ידני כלי
Nunc OmniTray עם מכסה Nunc 734-0490 N / A
96 לוחות קלקר סטריליים גם גריינר BioOne 655161 N / A
96 פוליסטירן סטריליים מכסים היטב גריינר BioOne 656171 N / A

לוח 3. חומרים כימיים ספציפיים וציוד.

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Addinall, S. G., Holstein, E., Lawless, C., Yu, M., Chapman, K., et al. Quantitative Fitness Analysis shows that NMD proteins and many other protein complexes suppress or enhance distinct telomere cap defects. PLoS Genetics. 7 (4), e1001362(2011).
  2. Addinall, S. G., Downey, M., Yu, M., Zubko, M. K., Dewar, J., et al. A genomewide suppressor and enhancer analysis of cdc13-1 reveals varied cellular processes influencing telomere capping in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 180, 2251-2266 (2008).
  3. Lawless, C., Wilkinson, D., Young, A., Addinall, S., Lydall, D. Colonyzer: automated quantification of micro-organism growth characteristics on solid agar. BMC Bioinformatics. 11, 287-28 (2010).
  4. Colonyzer - Image analysis software [Internet]. , Newcastle University. Newcastle, UK. Available from: http://research.ncl.ac.uk/colonyzer/ (2012).
  5. Tong, A. H., Evangelista, M., Parsons, A. B., Xu, H., Bader, G. D., et al. Systematic genetic analysis with ordered arrays of yeast deletion mutants. Science. 294, 2364-2368 (2001).
  6. Costanzo, M., Baryshnikova, A., Bellay, J., Kim, Y., Spear, E. D., et al. The genetic landscape of a cell. Science. 327, 425-431 (2010).
  7. qfa - An R Package for Quantiative Fitness Analysis [Internet]. , University of Vienna. Vienna, Austria. Available from: http://qfa.r-forge.r-project.org/ (2012).
  8. Blomberg, A. Measuring growth rate in high-throughput growth phenotyping. Curr. Opin. Biotechnol. 22 (1), 94-102 (2011).
  9. Maringele, L., Lydall, D. EXO1-dependent single-stranded DNA at telomeres activates subsets of DNA damage and spindle checkpoint pathways in budding yeast yku70Δmutants. Genes and Dev. 16 (15), 1919-1933 (2002).
  10. Warringer, J., Blomberg, A. Automated screening in environmental arrays allows analysis of quantitative phenotypic profiles in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 20, 53-67 (2003).
  11. Hillenmeyer, M., Fung, E., Wildenhain, J., Pierce, S., Hoon, S., Lee, W., Proctor, M., St. Onge, R., Tyers, M., Koller, D., Altman, R., Davis, R., Nislow, C., Giaever, G. The chemical genomic portrait of yeast: uncovering a phenotype for all genes. Science. 320 (5874), 362-365 (2008).
  12. Smith, A. M., Durbic, T., Oh, J., Urbanus, M., Proctor, M., Heisler, L. E., Giaever, G., Nislow, C. Competitive Genomic Screens of Barcoded Yeast Libraries. J. Vis. Exp. (54), e2864(2011).
  13. Lederberg, J., Lederberg, E. M. Replica plating and indirect selection of bacterial mutants. J. Bacteriol. 63, 399-406 (1952).
  14. Queller, C. Behavioural ecology: The social side of wild yeast. Nature. 456, 589-590 (2008).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Quantitative Fitness AnalysisMicrobial Culture FitnessGrowth Curve AnalysisSolid Agar PlatesAutomated ImagingGenetic Interaction ScreeningYeast Deletion CollectionColonizer SoftwareLogistic Population ModelFitness Measurement

מאמרים קשורים