מתואר כאן היא טכניקה שבה lipopolysaccharide מוזרקת לתוך בלוטת החלב המניק באמצעות עכבר הפטמה כדי לדמות דלקת בשד, מצב שנגרם בדרך כלל על ידי זיהום חיידקים. תוצאות הזרקה בLipopolysaccharide מוגברת גרעינית גורם kappa B (NF-κB) איתות, מדמיינים באמצעות הדמית bioluminescent של עכבר כתב לוציפראז NF-κB.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
הזרקת Intraductal של LPS כמודל עכבר של דלקת בשד: איתות מדמיינת דרך NF-κB כתב מהונדס
במאמר זה
סיכום
תקציר
מודלים בבעלי חיים למחלות אנושיות הם הכרחיים על מנת ללמוד בקפדנות שלבי התקדמות מחלה ומנגנונים נלווים, וסופו של דבר, כמודלים טרום קליניים כדי לבדוק התערבויות. בשיטות אלה, אנו מתארים טכניקה שבה lipopolysaccharide (LPS) מוזרקת לתוך בלוטת החלב המניק עכבר דרך הפטמה, ביעילות הדלקת בשד דוגמנות, או דלקת, של הבלוטה. תוצאות זיהום זה מדומה במוגבר גרעינית גורם kappa B (NF-κB) איתות, ראו בעיני רווחו באמצעות הדמית bioluminescent של עכבר כתב לוציפראז NF-κB 1.
המטרה שלנו בפיתוח שיטות אלה הייתה ללמוד הדלקת קשורה בדלקת בשד בבלוטת המניקות, אשר לעתים קרובות כוללת אדמומיות, נפיחות, וחדירה לתא חיסונית 2,3. לכן, היינו מודעים היטב לכך שחתך, או כל סוג של פציעה של העור, הפטמה, או בלוטה כדי להציג את יכל LPSלא להיות מנוצל בשיטות שלנו מאז שהגישה הזאת עשויה לבלבל את הקריאה מתוך של דלקת. אנחנו גם רצויים שיטה ישר קדימה, שלא הצריך pipettes נעשה במיוחד מצויר ביד או על השימוש בmicromanipulators להחזיק כלים מיוחדים האלה במקום. לפיכך, אנו נחושים להשתמש במזרק אינסולין זמין מסחרי ולהזריק לתוך סוכן צינור החלב של פטמה ללא פגע. שיטה זו הייתה מוצלחת ואפשרה לנו ללמוד הדלקת קשורה בהזרקת LPS ללא תופעות נוספות מעולפות על ידי התהליך של הזרקה. בנוסף, שיטה זו מנוצלת גם NF-κB לוציפראז כתב מהונדס עכבר וטכנולוגיית הדמית bioluminescent חזותי וכמותית להראות גדל NF-κB איתות בתוך הבלוטה LPS-4 המוזרקת.
שיטות אלה הן עניין לחוקרים מתחומים רבים המבקשים למחלת מודל בתוך בלוטת חלב מניקות, כסופו של דבר, הטכניקהמתואר כאן יכול להיות מנוצל עבור זריקה של מספר החומרים, ואינו מוגבל לLPS בלבד.
פרוטוקול
כל הניסויים בבעלי החיים אושרו על ידי הטיפול באוניברסיטה ונדרבילט המוסדי בעלי החיים ושימוש ועדה.
1. הכנת עכברים הטרנסגניים
- נקבות עכברים, חיוביים לNGL (N-F-κB-G FP-L uciferase) הכתב transgene (שתואר לעיל 1) משמשים להליך זה. כאשר נקבות לפחות 6 שבועות של גיל, חבר אותם עם זכר סוג פראי FVB. הרמון רבייה ניתן להשתמש (עד 4 נקבות בכלוב עם זכר 1). (לתשומת הלב: עכברי מתח FVB שמשו למחקר הנוכחי עכברי מתח כהים כגון C57Bl6 עשויים לשמש גם, אבל עכברים אלו חייבים להיות מגולחים לפני ההדמיה.).
- החל מ 15 ימים לאחר הזדווגות, בדוק את הנשים באופן קבוע לסימנים של הריון (היקף גדול בולט). כל נקבה יש להפריד לאחר ההריון והזכר הוסר מהכלוב הפעם הנקבה האחרונה להריון.
- צפו הנקבות המופרדותד לשים לב לתאריך לידה, כאשר המלטה מופיעה. המלטה של לפחות 6 גורים נדרשת להנקה מספקת. שמונה ימים לאחר לידתו של ההמלטה, להמשיך בפרוטוקול (ראה איור 1 עבור סכמטי ציר זמן).
2. הכנה להזרקה
- ממס את ה LPS coli בPBS לריכוז סופי של 0.1 מיקרוגרם / μl. 50 μl של פתרון זה, או סך של 5 מיקרוגרם, יהיה ניתן להזריק לתוך בלוטת החלב. הכן את המבחנה שנייה של PBS לבד לשמש להזרקת שליטה.
- הגדרת ביתור וציוד הרדמה isoflurane. מנגנון אף מחודד צריך להיות מאובטח לשלב של הביתור שבו הניח את העכבר. מקור אור טוב, בין אם מההיקף עצמו או מפנסי תאורה נוספים צריך גם להיות מוכן.
- ברגע שההגדרה היא מוחלטת, להפעיל את מכונת isoflurane וזרימת אוויר.
3. הזרקת Intraductal של LPS
- טען את מזרק מחט הקצרה עם 50 μl של פתרון LPS. להגדיר את זה בצד.
- הרדם את העכבר להיות מוזרק על ידי הנחת הראשון הנקבה לתוך קופסה מלאה isoflurane ואז ברגע נשימה מואטת, להעביר אותה לבמה ומניח את אפה בתוך האף המחודד. השתמש קמצוץ בוהן כדי לאשר את העכבר הוא מורדם באופן מלא. לפקח הנשימה של העכבר לאורך התהליך ולהתאים את רמת isoflurane בהתאם. הכלוב ובו של הגורים שהנקבה כבר נלקחה מיש להפריש בזהירות עד שניתן יהיה להחזיר את הסכר לאחר ההליך.
- השתמש בטיפה קטנה של אתנול 70% כדי להפוך את המעייל שכב ולעזור לדמיין הפטמה המחוברת לבלוטת חלב # 4 מפשעתי ממש על הבטן התחתונה של העכבר.
- התמקד הביתור לתצוגה מיטבית של הפטמה. זהירות להשתמש בערכה של מלקחיים עדינים יותר כדי למשוך את הפטמה מהעור, אך אין לנקב או לפצוע את הפטמה בצורה כלשהי.מלקחיים לא צריכים להיות שלובים בכוח כאשר מניפולצית הרקמה, אבל שימוש עם אחיזה קלה הדורשת את הכמות המינימאלית של לחץ על הפטמה.
- השתמש במלקחיים ביד השמאל בעדינות להחזיק את הפטמה במקום. לאט לאט תביא את מזרק preloaded לתוך שדה ראייה של שימוש ביד ימין. המזרק צריך להיות מוחזק כך שאף מיקום מחדש צריך להתרחש כדי להזריק את התוכן.
- ברגע שהמזרק נמצא בתצוגה, מטרה בזהירות בפתיחת ductal הקטנה בתוך מרכז הפטמה, ולהכניס את המזרק.
- מבלי למקם מחדש את היד, להזרים את תכולת המזרק ולהוציא את המחט מהפטמה.
- טען מזרק שני עם 50 μl של PBS להזרקת השליטה. למקם את העכבר על במה ולתצוגה הטובה ביותר של הפטמה השמאלית # 4 מפשעתי חלב הבלוטה בצד השני של הבטן התחתונה של העכבר. חזור על שלבים 3.4-3.7 באמצעות מזרק PBS הטעון.
- לאחר שתי הזריקות Complete, להפסיק הרדמה ולהזיז את העכבר לכלוב התאוששות. לפקח על הנקבה כדי להבטיח שהיא הופכת ניידת בתוך 5 דקות. אפשר העכבר כדי להישאר בכלוב ההתאוששות לשעה 1. לאחר 1 שעה של התאוששות, הנח את הגב הנשי לכלוב עם גוריה של גורים. עכברים צריכים להיות במעקב תקופתי להזרקת 6 שעתי הודעה לפני שימשיכו להדמיה. מניסיוננו, השלכות שליליות נרשמו באו נקבה או את הגורים במהלך התקופה שבין הזרקה והדמיה. עם זאת, אם סימני המצוקה הם נצפו בנקבה (למשל היציבה הכפופה, נושכים או שמירה על מקום ההזרקה, עייפות כללית) או את הגורים (אין תנועה, צבע כחלחל של עור) הניסוי יש להפסיק.
4. Bioluminescent הדמיה למדמיינת פעילות NF-κB
- ברגע שעכברים כבר הועברו למתקן ההדמיה, תתחיל לבצע את הליך ההדמיה על ידי פתיחת התוכנה ומאתחל את המחשב. הפעל הואמכונת oflurane וזרימת אוויר, ולהבטיח כי ההרדמה זורמת לשניהם תיבה וחדר ההדמיה.
- הנח את העכבר תחת הרדמת isoflurane בתיבת ההרדמה הברורה. ברגע שיש האטת נשימה, השתמש קמצוץ בוהן כדי לאשר את העכבר הוא מורדם באופן מלא. ואז, להזרים 100 μl של מצע luciferin לעכבר בזריקה רטרו מסלולית 5 שימוש במזרק סטרילי.
- מייד להעביר את העכבר לחדר ההדמיה ולהציב את אפה תחת אף קונוס isoflurane ממוקם שם. העכבר צריך להיות פרקדן. לאבטח כל רגל לבמה עם קלטת.
- הקלט את ההגדרות המתאימות לתוכנת IVIS לקחת גם תמונה לבנה אור צילום ותמונה של פעילות bioluminescent. זמן החשיפה צריך להיות 10 שניות. לרכוש את התמונה.
- ברגע שתמונות שרכשו, מאפשר עכבר כדי להתאושש ואז למקם אותה בכלוב עם גוריה ולעקוב מעת לעת.
- צילום וזורחתמונות הם כיסו באופן אוטומטי ומוצגות על המסך, כמו באיור 2. לנתח את התמונות שנרכשו על ידי צבת האזור של עניין או חוגים "החזר על השקעה" של גודל שווה על כל צד של הבטן התחתונה של העכבר (אחד מעל בלוטת PBS הזריק ואחת מעל בלוטת LPS הזריק-). הגדר את הקריאה לפוטונים. מספר צריך להיות מוצג מצביע הארה זוהתה בתוך כל החזר על השקעה (ראה איור 2B). השתמש במספר זה בניתוח סטטיסטי.
- כדי להציג את התמונה האופטימלית, בהמשך להתאים את הסף של האות המוצגת. זה לא ישנה את ההארה המוחלטת קריאה החוצה אבל יאפשר לך להסיר את אות רקע ולהמחיש את ההבדלים בין השליטה ובלוטת LPS-טופל. להקטין את כמות ההארה הראתה עד בלוטת PBS הזריק הוא ללא אות רקע. זה צריך לעזוב את האותות המוגברים בבלוטה עדיין ניכרת בתמונה, כפי שניתן לראות באיור 2 LPS-טופלה.
- Additionaניתוח הליטר, כולל מבחני RNA חלבון ו, ניתן להשלים עם רקמת שד הנשי שנגבתה מנתיחה שלאחר המוות 6.
5. נציג תוצאות
כדי להשיג תוצאות לפרש מהשיטות הללו, LPS (או PBS) חייב להיות חדור רק לצינוריות החלב, ומשאיר את הרקמות הסמוכות באין מפריע. הזרקה לתוך הרקמה התת עורית מסביב לפטמה תגרום דלקת עקב פציעה ולא הזיהום המדומה. ההזרקה של trypan הכחול צבע המדוללת ב PBS היא מועילה כאשר לומדים את הטכניקה. 3A האיור מראה בלוטה הוזרקה בהצלחה רוויה עם 100 μl של trypan כחול ב PBS. כפי שניתן לראות, רק עץ ductal צריך להיות מלא בפתרון המוזרק, ולא אמור להיות בולוס באזור ההזרקה. "בולוס" בהקשר זה הוא ההצטברות של הנוזל שהוזרק בפטמה או ברקמות המקיפות את הפטמה בלי עירוי לתוך עץ ductal. זה shלבד באיור 3B. שים לב כי הזריקות בפועל מוצגות באיור 3 הושלמו בנקבה ביום 21 להנקה. בזמן השיא של הנקה (יום 8-10, בשלב שבי LPS מוזרק באמצעות הפרוטוקול הנוכחי), חלב בשפע, וקשה לדמיין את הצינוריות ולקבוע אם הזריקה הושלמה כהלכה. לכן, כעבור זמן נקודות בהנקה הן טובות יותר לזריקות בפועל.
זריקה מוצלחת של LPS לתוצאות צינוריות החלב בפעילות מוגברת NF-κB בתוך הבלוטה. זה צריך להיות ברור בעכבר על כתב IVIS הדמיה, ובלוטת LPS הזריק צריכה לוציפראז פעילות גבוהה באופן משמעותי (שנמדד על ידי פוטון ספירה) מבלוטת PBS-המוזרקת, כפי שמוצג באיור 2 (בממוצע, בלוטת LPS קוראה 200% של אות שליטת PBS). עלייה משמעותית מבחינה סטטיסטית בהארה בתוך בלוטות LPS-טופלה כcompared לשליטה הנגדית הושג למרות השלמת קבוצה של 4 עכברים 4. מחקר נוסף אפשר גם נצל הזרקת החלב intraductal של או E. חיידק או LPS לNF-κB כתב הטרנסגניים. דומה לעבודה שלנו, מחברים אלה ראו גידול משמעותי ב6 שעתי פעילות כתב לאחר ה coli הזרקה 2.
שימו לב, עקב פעילות מכוננת NF-κB במוח ובאברי בטן אחרים, הראשים והבטן של עכברי כתבתנו מראים בעקביות אות כאשר צלמו, אפילו בתחילת מחקר לפני כל מניפולציה. לפיכך, האות הזה יש להתעלם בנוגע לניסוי זה. אות ברורה צריכה להישאר בבלוטת החלב LPS הזריק אחרי התמונה לקריאה מתוך מותאמת ללמזער הארת רקע בבלוטת PBS. תרשים 2 מציג תמונות עם הרקע מופחת.
זריקה לא מוצלחת של הבלוטה תהיהתוצאה ככל הנראה ניזק לפטמה. זה יגרום הצביע דלקת, עור ברמה שתהיה ברור על הדמיה. סוג זה של פציעת אות יהיה חזק מאוד ומוגבל לאזור הפטמה שבו הניזק התרחש, אינו בוקע בכל הבלוטה, כפי שראה לאחר זריקה מוצלחת LPS לתוך הצינורות.
איור 1. סכמטי של הליך.
איור 2. תוצאות מייצגות מן IVIS bioluminescent ההדמיה. () נרכשות תמונה עם רקע מופחת, חושפות פעילות לוציפראז גדל בבלוטת LPS-המוזרקת. (ב) תמונה מתוך באזור quantifications ריבית נוספת. לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.
איור 3 הזרקת עיסוק:.. בלוטת חלב מוזרקת עם צבע באמצעות הזרקת intraductal כדי לבדוק את הדיוק של משלוח דרך הפטמה, עכבר ב 21 יום של הנקה היה מוזרק עם 100 μl של הצבע הכחול trypan המדולל ב PBS. בעקבות קרבה, הבלוטה נחשפה להדמיה. () זריקה מוצלחת ו( B) בולוס של צבע בפטמה.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
כאן אנו מנצלים עכבר מהונדס NF-κB כתב וטכניקת הזרקה מותאמת לדלקת בשד מודל, דלקת ברקמת השד נגרמת לרוב על ידי זיהום חיידקים. השלב הקריטי ביותר בהליך זה הוא הזרקת intraductal עצמו.
בפועל, זה בדרך כלל ברור אם הזרקת intraductal הייתה מוצלחת. ההזרקה של הסוכנים (LPS או PBS) צריכה להרגיש נוזל ולא אמורה להיות לא מעט התנגדות כמזרק מרוקן. המלכודת הנפוצה ביותר היא פגיעה בפטמה שמובילה למעבר חסום בבלוטה. זה יכול להיות דמיין ידי...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
אין ניגודי האינטרסים הכריזו.
תודות
עבודה זו מומנה על ידי מענק NIH CA113734 הוענק לF Yull והמחלקה לענייני יוצאי הצבא (TS לקוול).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| שם המגיב | חברה | מספר קטלוגים | תגובות |
| Lipopolysaccharide מחיידקי Escherichia (LPS) | סיגמא | L 2880 | סרוטיפ 055: B5 |
| PBS | Mediatech, Inc | 46-013-CM | |
| מזרק אינסולין מד 31 | הקיטון דיקינסון | 328438 | מחט קצרה |
| מצבטים | מכשירי Precision העולם | 15908 | |
| ביתור היקף | ליקה | M3Z | |
| טרל isoflurane, USP | MINRAD Inc עבור Rx עלית | NDC 66794-011-25 | |
| 200 מערכת IVIS הדמיה | קליפר (לשעבר Xenogen) | N / | |
| מזרק להזרקת luciferin | הקיטון דיקינסון | 309597 | 1cc; 26G5 / 8 |
| D-luciferin Firefly, monohydrate מלח נתרן (מצע luciferin) | כימיה וביולוגית ביוסינט | L-8240 | דלל עד 10 מ"ג / מ"ל |
מקורות
- Everhart, M. B., Han, W., Sherrill, T. P., Arutiunov, M., Polosukhin, V. V., Burke, J. R., Sadikot, R. T., Christman, J. W., Yull, F. E., Blackwell, T. S. Duration and intensity of NF-κB activity determine the severity of endotoxin-induced acute lung injury. The Journal of Immunology. 176, 4995-5005 (2006).
- Notebaert, S., Carlsen, H., Janssen, D., Vandenabeele, P., Blomhoff, R., Meyer, E. In vivo imaging of NF-κB activity during Escherichia coli-induced mammary gland infection. Cellular Microbiology. 10, 1249-1258 (2008).
- Elazar, S., Gonen, E., Livneh-Kol, A., Rosenshine, I., Shpigel, N. Y. Neutrophil recruitment in endotoxin-induced murine mastitis is strictly dependent on mammary alveolar macrophages. Veterinary Research. 41, 10(2010).
- Connelly, L., Barham, W., Pigg, R., Sait-Jean, L., Sherrill, T., Cheng, D. S., Chodosh, L. A., Blackwell, T. S., Yull, F. E. Activation of nuclear factor kappaB in mammary epithelium promotes milk loss during mammary development and infection. J. Cell. Physiol. 222, 73-81 (2010).
- Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. Retro-orbital injections in mice. Lab Animal. 40, 155-160 (2011).
- Plante, I., Stewart, M. K., Laird, D. W. Evaluation of mammary gland development and function in mouse models. J. Vis. Exp. (21), e2828(2011).
- Behbod, F., Kittrell, F. S., LaMarca, H., Edwards, D., Kerbawy, S., Heestand, J. C., Young, E., Mukhopadhyay, P., Yeh, H., Allred, D. C., Hu, M., Polyak, K., Rosen, J. M., Medina, D. An intraductal human-in-mouse transplantation model mimics the subtypes of ductal carcinoma in situ. Breast Cancer Research. 11, R66(2009).
- Zheng, J., Watson, A. D., Kerr, D. E. Genome-wide expression analysis of lipopolysaccharide-induced mastitis in a mouse model. Infection and Immunity. 74, 1907-1915 (2006).
- Nguyen, D., Beeman, N., Lewis, M., Schaack, J., Neville, M. C. Intraductal Injection into the Mouse Mammary Gland. Methods in Mammary Gland Biology and Breast Cancer Research. Ip, M. M., Asch, B. B. , Kluwer Academic/Plenum Publishers. 259-270 (2000).
- Lee, J. W., Paape, M. J., Zhao, X. Recombinant bovine soluble CD14 reduces severity of experimental Escherichia coli mastitis in mice. Veterinary Research. 34, 307-316 (2003).
- Elazar, S., Gonen, E., Livneh-Kol, A., Rosenshine, I., Shpigel, N. Y. Essential role of neutrophils but not mammary alveolar macrophages in a murine model of acute Escherichia coli mastitis. Veterinary Research. 41, 53(2010).
- Bannerman, D. D., Paape, M. J., Hare, W. R., Sohn, E. J. Increased levels of LPS-binding protein in bovine blood and milk following bacterial lipopolysaccharide challenge. Journal of Dairy Science. 86, 3128-3137 (2003).
- Gonen, E., Vallon-Eberhard, A., Elazar, S., Harmelin, A., Brenner, O., Rosenshine, I., Jung, S., Shpigel, N. Y. Toll-like receptor 4 is needed to restrict the invasion of Escherichia coli P4 into mammary gland epithelial cells in a murine model of acute mastitis. Cellular Microbiology. 9, 2826-2838 (2007).
- Notebaert, S., Demon, D., Vanden Berghe,, Vandenabeele, T., P,, Meyer, E. Inflammatory mediators in Escherichia coli-induced mastitis in mice. Comparative Immunology, Microbiology, and Infectious Diseases. 31, 551-565 (2008).
- Osterman, K. L., Rahm, V. A. Lactation mastitis: bacterial cultivation of breast milk symptoms, treatment, and outcome. Journal of Human Lactation. 16, 297-302 (2000).
- Sordillo, L. M., Streicher, K. L. Mammary Gland Immunity and Mastitis Susceptibility. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 7, 135-146 (2002).
- Blackwell, T. S., Yull, F. E., Chen, C. L., Venkatakrishnan, A., Blackwell, T. R., Hicks, D. J., Lancaster, L. H., Christman, J. W., Kerr, L. D. Use of genetically altered mice to investigate the role of nuclear factor-kappa B activation and cytokine gene expression in sepsis-induced ARDS. Chest. 116, 73S-74S (1999).
- Stathopoulos, G. T., Sherrill, T. P., Cheng, D. S., Scoggins, R. M., Han, W., Polosukhin, V. V., Connelly, L., Yull, F. E., Fingleton, B., Blackwell, T. S. Epithelial NF-kappaB activation promotes urethane-induced lung carcinogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104, 18514-18519 (2007).
- Blackwell, T. S., Hipps, A. N., Yamamoto, Y., Han, W., Barham, W. J., Ostrowski, M. C., Yull, F. E., Prince, L. P. NF-κB signaling in fetal lung macrophages disrupts airway morphogenesis. The Journal of Immunology. 187, 2740-2747 (2011).
- Chiang, S. H., Bazuine, M., Lumeng, C. N., Geletka, L. M., Mowers, J., White, N. M., Ma, J. T., Zhou, J., Qi, N., Westscott, D. The protein kinase IKKepsilon regulates energy balance in obese mice. Cell. 138, 961-975 (2009).
- Singh, M. V., Kapoun, A., Higgins, L., Kutschke, W., Thurman, J. M., Zhang, R., Singh, M., Yang, J., Guan, X., Lowe, J. S. Ca2+/calmodulin-dependent kinase II triggers cell membrane injury by inducing complement factor B gene expression in the mouse heart. The Journal of Clinical Investigation. 119, 986-996 (2009).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
