Mutagenesis bisulfite הוא תקן הזהב לניתוח מתילציה בדנ"א. פרוטוקול שונה שלנו מאפשרת ניתוח מתילציה דנ"א ברמת מתחיל מתא בודד ותוכנן במיוחד עבור ביציות נפרדות. זה יכול לשמש גם המחשוף בשלב עוברי.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
במאמר זה
סיכום
תקציר
אפיגנטיקה מקיפה את כל תורשתי ושינויים הפיך כדי הכרומטין כי הנגישות אלתר הגן, וכך הם המנגנונים העיקריים בוויסות שעתוק הגנים 1. מתילציה DNA הוא שינוי epigenetic שפועל בעיקר כסימן הדיכוי. באמצעות תוספת קוולנטי של קבוצת מתיל על cytosines ב dinucleotides CPG, הוא יכול לגייס חלבונים דיכוי נוספים ושינויים היסטון ליזום תהליכים המעורבים עיבוי הכרומטין השתקת גנים 2. מתילציה דנ"א חיוני להתפתחות נורמלית כפי שהיא משחקת תפקיד קריטי תכנות התפתחותי, התמיינות תאים, הדיכוי של אלמנטים retroviral, כרומוזום ה-X איון ו החתמה גנומית.
אחת השיטות החזקות ביותר לניתוח מתילציה בדנ"א הוא mutagenesis bisulfite. Bisulfite נתרן הוא mutagen דנ"א deaminates cytosines אל uracils. בעקבות הגברה seque PCR ו ncing, אירועים אלה המרה מזוהים כמו thymines. Cytosines מפוגל מוגנים מפני deamination ובכך להישאר cytosines, המאפשר זיהוי של מתילציה בדנ"א ברמת נוקלאוטיד יחיד 3. פיתוח assay mutagenesis bisulfite התקדמה מאלה דווח במקור 4-6 כלפי אלה הרגישים יותר לשחזור 7. אחד היה המפתח להתקדמות הטמעת כמויות קטנות יותר של דנ"א חרוז agarose, ובכך להגן על ה-DNA מטיפול bisulfite הקשה 8. ניתוח זה מתילציה מופעל להתבצע על בריכות של ביציות ו בשלב הבלסטוציסט ועוברים 9. Mutagenesis המתוחכמת ביותר bisulfite פרוטוקול עד כה היא בשלב הבלסטוציסט עוברים בודדים 10. עם זאת, מאז blastocysts יש על 64 תאים הממוצע (המכיל 120-720 PG של הדנ"א הגנומי), שיטה זו אינה יעילה ללימודי מתילציה על ביציות בודדים או מחשוף בשלב עוברים. אוהל "> לוקח רמזים מן הטבעה agarose כמויות הדנ"א דקות כולל 11 ביציות, כאן אנו מציגים שיטה לפיה ביציות מוטבעים ישירות agarose ו תמוגה פתרון חרוז אחזור מיד לאחר והסרה של pellucida Zona מן הביצית. זה מאפשר לנו לעקוף את שני האתגרים העיקריים של mutagenesis ביצית אחת: bisulfite. המגנים על כמות זעירה של דנ"א, השפלה ואובדן הבאים במהלך השלבים פרוטוקול רבים חשוב לציין, כאשר הנתונים מתקבלים ביציות בודדות, סוגיית ההטיה PCR בתוך בריכות מסולק יתר על כן. , זיהום מכוונת התא תלולית ניתן לזהות על ידי שיטה זו שכן כל המדגם עם דגם אחד או יותר של מתילציה ניתן נכללו בניתוח 12. פרוטוקול זה מספק שיטה משופרת עבור ניתוחים מוצלחים לשעתקו של מתילציה בדנ"א ברמת מתחיל מתא בודד והוא אידיאלי עבור ביציות נפרדות, כמו גם מחשוף בשלב עוברים.
פרוטוקול
יום 1
הכן את הפתרונות הבאים טריים ביום של איסוף הביצית עם מים, סטרילי כמו מים מזוקקים GIBCO. כדי להקטין את הסיכוי לזיהום ה-DNA, לשנות לעיתים קרובות ולהשתמש בכפפות טיפים הסינון. לשמור על צינורות בזווית משם, כאשר פתח את לסכם את כל צינורות כאשר אינו בשימוש. אנו ממליצים פתרונות מורכבים כמו N +1.
3% LMP agarose
30 מ"ג נקודת התכה נמוכה (LMP) agarose
עד 1 מ"ל GIBCO H 2 O
לפזר @ 70 ° C
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
זה assay ביצית אחת מכיל שלבים רבים עם מספר כי הם קריטיים ודורשים טיפול מיוחד. הראשונה היא שטיפת הביצית. זה חשוב במיוחד כדי לשטוף כל הביצית מספר פעמים בינוני טרי טיפות לאחר הטיפול hyaluronidase כדי להסיר תאים קומולוס רבים ככל האפשר. יתר על כן, בעת העברת ביציות לפתרון חומצי של tyrode להסרת pellucida Zona לוודא סביב המדיום ברור של תאים קומולוס. הביצית דביק מאוד לאחר הסרת Zona, ואת כל התאים הסמוכים קומולוס יכול בקלות להיות דבוק הביצית. קשה מאוד להסיר תא תלולית כי הוא דבק הביצית Zona ח.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
החוקרים אין לי מה לחשוף.
תודות
עבודה זו נתמכה על ידי אוניברסיטת מערב אונטריו, החוג למיילדות וגינקולוגיה, ומענק ER06-02-188 מהמחקר Ministryof וחדשנות, פרס חוקר הקדומה. אכפת נתמך על ידי תוכנית אימון CIHR ב שכפול, בהתפתחות המוקדמת ואת ההשפעה על מלגה (REDIH) בוגר הבריאות.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
טבלה של חומרים כימיים מסוימים וציוד.
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| שם מגיב | חברה | מספר קטלוגי | תגובות |
| הביצית אוסף | |||
| Hyaluronidase | סיגמא | H4272 | |
| חומצי Tyrode | סיגמא | T1788 | |
| Proteinase K | סיגמא | P5568 | |
| 10% IGEPAL | Bioshop | NON999.500 | |
| תמוגה פתרון | |||
| טריס pH 7.5 | Bioshop | TRS001.5 | |
| LiCl | סיגמא | L9650 | & Nbsp; |
| EDTA-pH 8.0 | סיגמא | E5134 | |
| מכסים | Bioshop | LDS701.10 | |
| DTT | Invitrogen | P2325 | |
| SDS מאגר תמוגה | |||
| TE-pH 7.5 | Bioshop (טריס) סיגמא (EDTA) | TRS001.5 E5134 | |
| 10% SDS | Bioshop | SDS001.500 | |
| Bisulfite המרה | |||
| סודיום הידרוקסיד | סיגמא | S8045 | |
| Hydrogensulfite נתרן (סודיום bisulfite) | סיגמא | 243973 | ; |
| הידרוקינון | סיגמא | H9003 | |
| טמפ 'התכה נמוכה (LMP) agarose | סיגמא | A9414 | |
| שמן מינרלי | סיגמא | M8410 | |
| M2 בינוני | סיגמא | M7167 | |
| GIBCO מים מזוקקים | Invitrogen | 15230-196 | |
| Autoclaved כפול מזוקקים (DD) מים | |||
| PCR | |||
| Illustra מיקס חם התחל RTG | GE Healthcare | 28-9006-54 | |
| 240 ng / ml tRNA שמרים | Invitrogen | 15401-011 | |
| 5x מאגר גרין GoTaq תגובה | מקצועןמגה | M7911 | |
| Primers מקוננות הפנימיים והחיצוניים | סיגמא | ||
| קשירת | |||
| Promega pGEM-T קל וקטור | פישר סיינטיפיק | A1360 | |
| ת"א שיבוט | |||
| המוסמכות E.coli תאים | Zymo מחקר קורפ | T3009 | |
| ציוד | |||
| לנתח מיקרוסקופ | |||
| 70 מעלות צלזיוס ו 90 מעלות צלזיוס חום בלוקים | |||
| 37 ° C, 50 ° C Waterbaths (42 ° C עבור טרנספורמציות) | |||
| כסא נדנדה | |||
| מכונת ה-PCR |
מקורות
- Jaenisch, R., Bird, A. Epigenetic regulation of gene expression: how the genome integrates intrinsic and environmental signals. Nat. Genet. 33, 245-254 (2003).
- Rodenhiser, D., Mann, M. Epigenetics and human disease: translating basic bio....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
