הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

Immunohistochemical המכתים של B7-H1 (PD-L1) בפרפין מוטבע-שקופיות של רקמת לבלב אדנוקרצינומה

22.6K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/4059

⸱

3 בינואר 2013

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1The Sidney Kimmel Comprehensive Cancer Center, The Johns Hopkins University School of Medicine, 2Department of Oncology, The Johns Hopkins University School of Medicine, 3Department of Dermatology, The Johns Hopkins University School of Medicine, 4Department of Surgery, Johns Hopkins University School of Medicine, 5The Sol Goldman Pancreatic Cancer Center, The Johns Hopkins University School of Medicine, 6Yale Cancer Center, Yale School of Medicine, 7The Skip Viragh Center for Pancreatic Cancer, The Johns Hopkins University School of Medicine, 8Department of Pathology, The Johns Hopkins University School of Medicine

במאמר זה

סיכום

B7-H1 (PD-L1) ומחייבה לPD-1 יהווה איתות משמעותית לדיכוי מערכת חיסונית גידול מושרה בmicroenvironment של הגידול. טכניקת immunohistochemical מכתים לאפיין הביטוי והלוקליזציה של B7-H1 באדנוקרצינומה לבלב מתוארת כאן.

תקציר

B7-H1/PD-L1, חבר של המשפחה של חלבונים חיסוניים B7-רגולטוריות על פני קרום תא, ממלא תפקיד חשוב בוויסות השלילית של תגובות חיסוניות מתווכות תאים באמצעות יחסי הגומלין עם הקולטן שלו, מוות מתוכן-1 (פ"ד -1) 1,2. ביטוי יתר של B7-H1 על ידי תאים סרטניים כבר ציין במספר סוגי הסרטן אנושי, כולל מלנומה, גליובלסטומה, וקרצינומה של ריאות, שד, המעי הגס, שחלה, ותאי כליה, והוכח לפגוע אנטי סרטני T- חסינות תא 3-8.

לאחרונה, ביטוי B7-H1 ידי רקמות לבלב אדנוקרצינומה זוהה כסמן פרוגנוסטי פוטנציאל 9,10. בנוסף, מצור של B7-H1 במודל עכבר של סרטן הלבלב הוכח לייצר תגובה נגד גידול 11. נתונים אלה מצביעים על החשיבות של B7-H1 כמטרה טיפולית פוטנציאלית. נוגדנים נגד מצור B7-H1 ולכן הם נבדקים במחקרים קליניים למולאטיגידולי טייפל אדם מוצק, כולל מלנומה וסרטן ריאות, מעי גס, כליות, קיבה והלבלב 12.

בסופו של דבר על מנת שתוכל לזהות את החולים שייהנו מB7-H1 מיקוד טיפולים, הוא קריטי כדי לחקור את הקשר בין ביטוי ולוקליזציה של B7-H1 ותגובת חולה לטיפול בנוגדני מצור B7-H1. בחינת הביטוי של B7-H1 ברקמות לבלב אדנוקרצינומה אדם באמצעות אימונוהיסטוכימיה תיתן הבנה טובה יותר כיצד מולקולת איתות שיתוף מעכב זה תורמת לדיכוי של חסינות antitumor בmicroenvironment של הגידול. הנוגדן חד השבטי אנטי B7-H1 (שיבוט 5H1) שפותח על ידי חן ועמיתים הוכח כדי להפיק תוצאות אמינות צביעה בcryosections של סוגים שונים של רקמות אנושיות neoplastic 4,8, אבל כתמים על שקופיות פרפין מוטבעים היה אתגר עד לאחרונה 13-18. יש לנו devברח הפרוטוקול המכתים B7-H1 לשקופיות פרפין מוטבע-של רקמות לבלב אדנוקרצינומה. הפרוטוקול המכתים B7-H1 המתואר כאן מייצר כתמים קרומיים וcytoplasmic עקביים של B7-H1 עם קצת רקע.

פרוטוקול

B7-H1/PD-L1, חבר של המשפחה של חלבונים חיסוניים B7-רגולטוריות על פני קרום תא, ממלא תפקיד חשוב בוויסות השלילית של תגובות חיסוניות מתווכות תאים באמצעות יחסי הגומלין עם הקולטן שלו, מוות מתוכן-1 (פ"ד -1) 1,2. ביטוי יתר של B7-H1 על ידי תאים סרטניים כבר ציין במספר סוגי הסרטן אנושי, כולל מלנומה, גליובלסטומה, וקרצינומה של ריאות, שד, המעי הגס, שחלה, ותאי כליה, והוכח לפגוע אנטי סרטני T- חסינות תא 3-8.

לאחרונה, ביטוי B7-H1 ידי רקמות לבלב אדנוקרצינומה זוהה כסמן פרוגנוסטי פוטנציאל 9,10. בנוסף, מצור של B7-H1 במודל עכבר של סרטן הלבלב הוכח לייצר תגובה נגד גידול 11. נתונים אלה מצביעים על החשיבות של B7-H1 כמטרה טיפולית פוטנציאלית. נוגדנים נגד מצור B7-H1 ולכן הם נבדקים במחקרים קליניים לאדם מרובהגידולים מוצקים, כולל מלנומה וסרטן ריאות, מעי גס, כליות, קיבה והלבלב 12.

בסופו של דבר על מנת שתוכל לזהות את החולים שייהנו מB7-H1 מיקוד טיפולים, הוא קריטי כדי לחקור את הקשר בין ביטוי ולוקליזציה של B7-H1 ותגובת חולה לטיפול בנוגדני מצור B7-H1. בחינת הביטוי של B7-H1 ברקמות לבלב אדנוקרצינומה אדם באמצעות אימונוהיסטוכימיה תיתן הבנה טובה יותר כיצד מולקולת איתות שיתוף מעכב זה תורמת לדיכוי של חסינות antitumor בmicroenvironment של הגידול. הנוגדן חד השבטי אנטי B7-H1 (שיבוט 5H1) שפותח על ידי חן ועמיתים הוכח כדי להפיק תוצאות אמינות צביעה בcryosections של סוגים שונים של רקמות אנושיות neoplastic 4,8, אבל כתמים על שקופיות פרפין מוטבעים היה אתגר עד לאחרונה 13-18. פתחנו B7-H1 stainiפרוטוקול ננוגרם לשקופיות פרפין מוטבע-של רקמות לבלב אדנוקרצינומה. הפרוטוקול המכתים B7-H1 המתואר כאן מייצר כתמים קרומיים וcytoplasmic עקביים של B7-H1 עם קצת רקע.

1. De-parafinization

  1. אופה מחליק ב 55 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.
  2. במכסת מנוע כימי, לטבול שקופיות בקסילן למשך 10 דקות.
  3. שקופיות לטבול בקסילן הטרי למשך 10 דקות.
  4. לטבול מחליק באתנול 100% למשך 5 דקות.
  5. לטבול מחליק באתנול 100% טריים למשך 5 דקות.
  6. לטבול מחליק באתנול 95% למשך 5 דקות.
  7. לטבול מחליק באתנול 80% למשך 5 דקות.
  8. לטבול במים מחליק deionized למשך 5 דקות.

2. אחזור אנטיגן

  1. שקופיות לטבול בטריס-EDTA חיץ (pH 9.0) וחום בסיר לחץ עד 125 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, ולאחר מכן 90 מעלות צלזיוס למשך 10 שניות.
  2. בואו שקופיות מגניבות עבור 60 דקות.
  3. שקופיות לטבול בTBST למשך 5 דקות; repeבה פעמים.

3. הכתמה

  1. נגב את הפתרונים סביב הרקמה בשקופיות. סמן עיגול סביב הרקמות עם עט הידרופובי.
  2. הנח את השקופיות בתא לחות ולמנוע ההתייבשות של הרקמות בשקופית לאורך כל תהליך הצביעה כולו. טיפת מקום אחד (כ 200 μl או יותר כדי לכסות את אזור הרקמה לחלוטין) של בלוק peroxidase בתוך המעגל הידרופובי בשקופית ושקופיות אינקובטורים בבלוק peroxidase למשך 5 דקות.
  3. יש לשטוף את שקופיות עם TBST, אז מקום בTBST למשך 5 דקות.
  4. ירידה של מקום אחד BLOCK ACE חסימת חיץ בכל שקופית ודגירה במשך 15 דקות.
  5. יש לשטוף את שקופיות עם TBST, אז מקום בTBST למשך 5 דקות.
  6. מקום טיפה אחת של פתרון Avidin בכל שקופית ודגירה במשך 15 דקות.
  7. יש לשטוף את שקופיות עם TBST, אז מקום בTBST למשך 5 דקות.
  8. מקום טיפה אחת של פתרון ביוטין בכל שקופית ודגירה במשך 15 דקות.
  9. שטוף SLIדה עם TBST, אז המקום בTBST למשך 5 דקות.
  10. דגירת שקופיות עם 1:1,000 דילול של נוגדנים חד שבטיים אנטי B7-H1 עכבר (שיבוט 5H1) או עכבר IgG1 κ שליטת אלוטיפ בTBST μl 200 ב 4 ° C למשך לילה 22 שעות + / - 1 שעה. ריכוז הנוגדן הסופי בTBST הוא 2.57 מיקרוגרם / מ"ל.
  11. יש לשטוף את שקופיות עם TBST, אז מקום בTBST למשך 5 דקות. חזור פעמים.
  12. דגירת שקופיות עם נוגדן ביוטין מצומדת חולדה אנטי עכבר IgG1 שני ב1:500 ריכוז (בתמיסת 200 μl 2% עזים בסרום) למשך 30 דקות.
  13. יש לשטוף את שקופיות עם TBST, אז מקום בTBST למשך 5 דקות. חזור פעמים.
  14. ירידה של מקום אחד streptavidin-יוטין מורכב (חייבת להיות מוכנה לפחות 30 דקות לפני שימוש) בכל שקופית ודגירה במשך 15 דקות.
  15. יש לשטוף את שקופיות עם TBST, אז מקום בTBST למשך 5 דקות. חזור פעמים.
  16. מקום טיפה אחת של מגיב הגברה (בדילול 02:01 עם TBST) בכל שקופית ודגירה במשך 4 דקות.
  17. יש לשטוף את שקופיות עם TBST, אז המקום בTBST למשך 5 דקות. חזור פעמים.
  18. מקום טיפה אחת של streptavidin-HRP בכל שקופית ודגירה במשך 15 דקות.
  19. יש לשטוף את שקופיות עם TBST, אז מקום בTBST למשך 5 דקות. חזור פעמים.
  20. הנח טיפה אחת של 3,3-Diaminobenzidine (DAB) מצע ואב צבע בכל שקופית ולפתח את הצבע עבור 2 דקות.
  21. מייד לאחר התפתחות הצבע, לשטוף שקופיות עם DDH 2 O עבור 1-2 דקות.
  22. דגירת שקופיות עם טיפה אחת של hematoxylin עבור 90 שניות.
  23. לשטוף עם DDH 2 O עבור 1-2 דקות.
  24. לשטוף במים ברז וסבון במשך 1-2 דקות.
  25. לשטוף עם DDH 2 O עבור 1-2 דקות.

4. התייבשות והרכבה

  1. לטבול את השקופיות באתנול 80% במשך 3 דקות.
  2. לטבול את השקופיות באתנול 95% עבור 3 דקות.
  3. לטבול את השקופיות באתנול 100% למשך 5 דקות. חזור.
  4. לטבול את השקופיות בקסילן למשך 5 דקות. חזור.
  5. הוסף טיפה אחת שלCytoseal 60 לשקופית ומקום coverslip.

טבלה 1 מפרטת את ריאגנטים המשמשים בהליכים שתוארו לעיל.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

Immunohistochemical מכתים מוצלחת של B7-H1 ידגים את הביטוי הטרוגני של B7-H1 (פיתוח צבע חום אותות DAB) באדנוקרצינומה לבלב. חלק מתאי לבלב אדנוקרצינומה יש ביטוי בעיקר קרומי של B7-H1 (איור 1 א) ואילו אחרים יש ביטוי גם בעיקר cytoplasmic של B7-H1 או ביטוי הקטן של B7-H1 (איורים 2 ו 3). אפיתל צינור לבלב רגיל מבטא B7-H1 קטן (איור 4). הכתמה עם עכבר κ נוגדן שליטת IgG1 אלוטיפ במקום הנוגדן אנטי-B7-H1 תערוכות מכתימות קצת רקע (1B איור).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

immunohistochemical מכתים של B7-H1 בcryosections דווח במחקרים קודמים עבור מגוון רחב של סוגי הסרטן 3,4. עם זאת, דגימות גידול קליניות בדרך כלל זמינות רק בצורה של בלוקי פרפין מוטבעים. הנוגדן חד השבטי 5H1 לאחרונה יושם בהצלחה להכתמה של רקמות גידול פרפין מוטבע כולל קרצינומה של תאי כליה, סרטן צוואר רחם, סרטן שלפוחית ​​שתן ומלנומה 13-18. מכתים B7-H1 בפרפין מוטבע 9,19 או cryostat 20 קטעים של רקמות לבלב אדנוקרצינומה עם נוגדנים חד שבטיים אחרים כבר ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

תודות

EB, KMB, וHX לתרום באופן שווה. מחקר זה נתמך על ידי נבג NCI בסרטן במערכת עיכול, P50 CA062924 NIH CA148964 K23, קרן לוסטגרטן, Viragh קרן, פרס חוקר צעיר ASCO, NIH 5T32 הדרכת CA0090701-28 גרנט, מרכז סרטן לבלב גולדמן סול, וקרן לבלב הלאומי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
שם המגיב חברה מספר קטלוגים תגובות
CSA מערכת Dako K1500 כולל את ריאגנטים הבאים שהוזכרו בפרוטוקול: לחסום peroxidase, מורכב streptavidin-ביוטין, מגיב הגברה, streptavidin-HRP ומצע ואב צבע DAB
Avidin / ביוטין חסימת קיט וקטור SP-2001
הבלוק ACE Serotec BUF029
ביוטין אנטי עכבר IgG1 BD 553441
עכבר IgG1 K אלוטיפ בקרה eBioscience 14-4714-85
TBS (טריס נאגר מלוח), 10X Cellgro 46-012-CM 10xTBS מכיל 80 גרם / L NaCl ו24.2 Tirs גר '/ ל';
דולל ל 1X עם ddH2O לכביסות;
20 Tween סיגמה אולדריץ P1379 1 מ"ל הוסיף 1 ליטר של 1X TBS לעשות TBST
יעד אחזור, 20x Celerus גל 014-3000-000 דולל ל 1x עם DDH 2 O
אלכוהול 190 הוכחה אתיל Pharmco-Aaper 111000190
אלכוהול 200 הוכחה אתיל Pharmo-Aaper 111000200
קסילן VWR 95057-827
Hematoxylin ריצ'רד אלן, מדעי 72804
Cytoseal 60 ריצ'רד אלן, מדעי 8310-4
Coverslips קורנינג 2940-245
תא לחות סיגמא H6644
טבלת 1. ריאגנטים וציוד.

מקורות

  1. Flies, D. B., Chen, L. The new B7s: playing a pivotal role in tumor immunity. J. Immunother. 30, 251-260 (2007).
  2. Dong, H., Zhu, G., Tamada, K., Chen, L. B7-H1, a third member of the B7 family, co-stimulates T-cell proliferation and interleukin-10 secretion. Nat. Med. 5, 1365-1369 (1999).
  3. Curiel, T. J., Wei, S., Dong, H., Alvarez, X., Cheng, P., Mottram, P., Krzysiek, R., Knutson, K. L., et al. Blockade of B7-H1 improves myeloid dendritic cell-mediated antitumor immunity. Nat. Med. 9, 562-567 (2003).
  4. Dong, H., Strome, S. E., Salomao, D. R., Tamura, H., Hirano, F., Flies, D. B., Roche, P. C., Lu, J., Zhu, G. Tumor-associated B7-H1 promotes T-cell apoptosis: a potential mechanism of immune evasion. Nat. Med. 8, 793-800 (2002).
  5. Dong, H., Chen, L. B7-H1 pathway and its role in the evasion of tumor immunity. J. Mol. Med. (Berl). 81, 281-287 (2003).
  6. Strome, S. E., Dong, H., Tamura, H., Voss, S. G., Flies, D. B., Tamada, K., Salomao, D., Cheville, J., Hirano, F., Lin, W., Kasperbauer, J. L., Ballman, K. V., Chen, L. B7-H1 blockade augments adoptive T-cell immunotherapy for squamous cell carcinoma. Cancer Res. 63, 6501-6505 (2003).
  7. Hirano, F., Kaneko, K., Tamura, H., Dong, H., Wang, S., Ichikawa, M., Rietz, C., Flies, D. B., Lau, J. S., Zhu, G., Tamada, K., Chen, L. Blockade of B7-H1 and PD-1 by monoclonal antibodies potentiates cancer therapeutic immunity. Cancer Res. 65, 1089-1096 (2005).
  8. Thompson, R. H., Gillett, M. D., Cheville, J. C., Lohse, C. M., Dong, H., Webster, W. S., Krejci, K. G., Lobo, J. R., Sengupta, S., Chen, L., Zincke, H., Blute, M. L., Strome, S. E., Leibovich, B. C., Kwon, E. D. Costimulatory B7-H1 in renal cell carcinoma patients: Indicator of tumor aggressiveness and potential therapeutic target. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 17174-17179 (2004).
  9. Geng, L., Huang, D., Liu, J., Qian, Y., Deng, J., Li, D., Hu, Z., Zhang, J., Jiang, G., Zheng, S. B7-H1 up-regulated expression in human pancreatic carcinoma tissue associates with tumor progression. J. Cancer Res. Clin. Oncol. 134, 1021-1027 (2008).
  10. Loos, M., Giese, N. A., Kleeff, J., Giese, T., Gaida, M. M., Bergmann, F., Laschinger, M., WB, M., Friess, H. Clinical significance and regulation of the costimulatory molecule B7-H1 in pancreatic cancer. Cancer Lett. 268, 98-109 (2008).
  11. Okudaira, K., Hokari, R., Tsuzuki, Y., Okada, Y., Komoto, S., Watanabe, C., Kurihara, C., Kawaguchi, A., Nagao, S., Azuma, M., Yagita, H., Miura, S. Blockade of B7-H1 or B7-DC induces an anti-tumor effect in a mouse pancreatic cancer model. Int. J. Oncol. 35, 741-749 (2009).
  12. Wang, S., Chen, L. Immunobiology of cancer therapies targeting CD137 and B7-H1/PD-1 cosignal pathways. Curr. Top Microbiol. Immunol. 344, 245-267 (2011).
  13. Thompson, R. H., Webster, W. S., Cheville, J. C., Lohse, C. M., Dong, H., Leibovich, B. C., Kuntz, S. M., Sengupta, S., Kwon, E. D., Blute, M. L. B7-H1 glycoprotein blockade: a novel strategy to enhance immunotherapy in patients with renal cell carcinoma. Urology. 66, 10-14 (2005).
  14. Thompson, R. H., Kuntz, S. M., Leibovich, B. C., Dong, H., Lohse, C. M., Webster, W. S., Sengupta, S., Frank, I., Parker, A. S., Zincke, H., Blute, M. L., Sebo, T. J., Cheville, J. C., Kwon, E. D. Tumor B7-H1 is associated with poor prognosis in renal cell carcinoma patients with long-term follow-up. Cancer Res. 66, 3381-3385 (2006).
  15. Thompson, R. H., Dong, H., Kwon, E. D. Implications of B7-H1 expression in clear cell carcinoma of the kidney for prognostication and therapy. Clin. Cancer Res. 13, 709s-715s (2007).
  16. Karim, R., Jordanova, E. S., Piersma, S. J., Kenter, G. G., Chen, L., Boer, J. M., Melief, C. J., vander Burg, S. H. Tumor-expressed B7-H1 and B7-DC in relation to PD-1+ T-cell infiltration and survival of patients with cervical carcinoma. Clin. Cancer Res. 15, 6341-6347 (2009).
  17. Inman, B. A., Sebo, T. J., Frigola, X., Dong, H., Bergstralh, E. J., Frank, I., Fradet, Y., Lacombe, L., Kwon, E. D. PD-L1 (B7-H1) expression by urothelial carcinoma of the bladder and BCG-induced granulomata: associations with localized stage progression. Cancer. 109, 1499-1505 (2007).
  18. Brahmer, J. R., Drake, C. G., Wollner, I., Powderly, J. D., Picus, J., Sharfman, W. H., Stankevich, E., Pons, A., Salay, T. M., McMiller, T. L., Gilson, M. M., Wang, C., Selby, M., Taube, J. M., Anders, R., Chen, L., Korman, A. J., Pardoll, D. M., Lowy, I., Topalian, S. L. Phase I study of single-agent anti-programmed death-1 (MDX-1106) in refractory solid tumors: safety, clinical activity, pharmacodynamics, and immunologic correlates. J. Clin. Oncol. 28, 3167-3175 (2010).
  19. Wang, L., Ma, Q., Chen, X., Guo, K., Li, J., Zhang, M. Clinical significance of B7-H1 and B7-1 expressions in pancreatic carcinoma. World J. Surg. 34, 1059-1065 (2010).
  20. Nomi, T., Sho, M., Akahori, T., Hamada, K., Kubo, A., Kanehiro, H., Nakamura, S., Enomoto, K., Yagita, H., Azuma, M., Nakajima, Y. Clinical significance and therapeutic potential of the programmed death-1 ligand/programmed death-1 pathway in human pancreatic cancer. Clin. Cancer Res. 13, 2151-2157 (2007).
  21. Taube, J. M., Anders, R. A., Young, G. D., Xu, H., Sharma, R., McMiller, T. L., Chen, S., Klein, A. P., Pardoll, D. M., Topalian, S. L., Chen, L. Colocalization of inflammatory response with B7-h1 expression in human melanocytic lesions supports an adaptive resistance mechanism of immune escape. Sci. Transl. Med. 4, 127ra37(2012).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

DAB
Immunohistochemical המכתים של B7-H1 (PD-L1) בפרפין מוטבע-שקופיות של רקמת לבלב אדנוקרצינומה
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.