מאמר שיטה

זיהוי של מיקרו RNA ב microglia על ידי Real-time PCR ב CNS רגיל ובמהלך Neuroinflammation

18.8K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/4097

⸱

23 ביולי 2012

 ,  ,  , 
1Center for Neurologic Diseases, Brigham and Women's Hospital, Harvard Medical School

במאמר זה

סיכום

Microglia תושב מקרופאגים הם המספקים את השורה הראשונה של מעקב ההגנה החיסונית של מערכת העצבים המרכזית. מיקרו RNA הם מולקולות רגולטוריות כי לשחק תפקיד חשוב בתהליכים פיזיולוגיים רבים, כולל הפעלת והבחנה של מקרופאגים. במאמר זה נתאר את שיטת המדידה של מיקרו RNA ב microglia.

תקציר

Microglia הם תאים של שושלת מיאלואידית הנמצאים במערכת העצבים המרכזית (CNS) 1. תאים אלה ממלאים תפקיד חשוב פתולוגיות של מחלות רבות הקשורות neuroinflammation כמו טרשת נפוצה (MS) 2. Microglia בעוד כמה CNS רגילים להביע CD11b מקרופאג סמן ולהציג פנוטיפ מנוחה בהבעת רמות נמוכות של סמנים הפעלה כגון CD45. במהלך אירועים פתולוגיים מערכת העצבים המרכזית, microglia להיות מופעל כפי שנקבע על ידי upregulation של CD45 ו סמנים אחרים 3. הגורמים המשפיעים על הפנוטיפ microglia פונקציות מערכת העצבים המרכזית לא למד היטב. מיקרו RNA (miRNAs) משפחה הולך וגדל של מולקולות המשתמרים (~~~HEAD=NNS 22 נוקלאוטידים ארוך) כי הם מעורבים בתהליכים פיזיולוגיים רבים רגילים כגון צמיחת תאים והתמיינות 4 ו מחלות כגון דלקת 5. MiRNAs downregulate את הביטוי של גנים מסוימים היעד של רצפים משלימים מחייב שלIR mRNAs ולשחק תפקיד חשוב ההפעלה של תאים חיסוניים מולדים כולל מקרופאגים 6 ו מיקרוגליה 7. על מנת לחקור מירנה בתיווך מסלולים המגדירים את הפנוטיפ microglial, פונקציה ביולוגית, להבדיל microglia מסוגים אחרים של מקרופאגים, חשוב להעריך כמותית את הביטוי של מיקרו RNA מסוימות תת שונים של מערכת העצבים המרכזית microglia תושב. השיטות המקובלות למדידת ביטוי miRNAs מערכת העצבים המרכזית כולל PCR כמותי מן הרקמה העצבית כולה ב ההכלאה באתרה. עם זאת, PCR כמותי מן homogenate הרקמה כולה אינה מאפשרת הערכת הביטוי של מירנה ב microglia, אשר מייצגים רק 5-15% מכלל התאים של הרקמה העצבית. ההכלאה באתרם מאפשרת הערכת הביטוי של microRNA של סוגי תאים מסוימים בסעיפים רקמות, אך שיטה זו אינה כמותית לחלוטין. בדו"ח זה אנו מתארים כמותית sensשיטת itive לצורך זיהוי של מירנה על ידי בזמן אמת PCR ב microglia מבודד CNS רגילים או במהלך neuroinflammation באמצעות Encephalomyelitis אוטואימונית ניסויית (EAE), מודל העכבר על טרשת נפוצה. בשיטה המתוארת יהיה שימושי כדי למדוד את רמת הביטוי של מיקרו RNA ב microglia ב CNS רגילים או במהלך neuroinflammation קשור פתולוגיות שונות, כולל טרשת נפוצה, פגיעה שבץ, טראומה, מחלת אלצהיימר גידולים במוח.

פרוטוקול

1. הבידוד של microglia מ CNS רגיל

הבידוד של microglia מבוצעת כפי שתואר קודם לכן עם שינויים 3.

  1. הכינו מכשירים לנתיחה ו זלוף: מספריים, מלקחיים, 10 מ"ל מזרק עם מחט 27g, 15 מ"ל Dounce homogenizer (טפלון / זכוכית), ניילון 40 מיקרומטר מסננת תא, 40% ו 70% פתרונות Percoll, 1X PBS.
  2. להרדים עכברים בחנק מהירה (שלילת חמצן) בדלתיים סגורות 2 CO ומיד להעביר אותם לספסל מעבדה מניפולציות כירורגית זלוף.
  3. לבצע מניפולציות כירורגיות (מספריים שימוש ו מלקחיים ואתנול 70% כמו חיטוי): חלל הצפק פתוח, לחתוך, הסרעפת החזה חלל פתוח ולא לגזוז אטריום הזכות במספריים.
  4. ביצוע כל גוף זלוף intracardial על ידי הזרקת 10 מ"ל מזרק לתוך החדר השמאלי לבין הפעלת לחץ. לעבור 8-10 מ"ל של 1X PBS דרך מחזור הדם אל הרשות איטית ויציבהלספירה.
  5. חזור על שלבים 1.2-1.4 עבור כל העכברים בקבוצת עכברים (בדרך כלל 5-10). לאחר זלוף לשמור על העכבר על קרח עד שכל העכברים הם perfused.
  6. אחרי טפטוף של כל העכברים, לנתח מוחות וחוטי השדרה. (אופציונלי: ללמוד ביטוי miRNAs באזורים שונים של המוח, לנתח אלה אזורים ספציפיים כמו המוח הקטן, וכו 'היפוקמפוס לקבוצה של עכברים 5-10 ובריכת אותם יחד homogenization).
  7. Homogenize המוחות וחוטי השדרה באמצעות 15 מ"ל Dounce homogenizer. במקום אחד המוח וחוט השדרה ב 1 homogenizer ולהוסיף 5 מ"ל של 1X PBS. לבצע 10-20 שביתות עדין: homogenate לעבור דרך מסננת לתוך התא צינור ML-50 חרוטי ותעודת ב 2000 סל"ד על כמה דקות צנטריפוגות גדולים 5-7.
  8. מחק המוח supernatant, resuspend / homogenate חוט השדרה של 2-3 עכברים מ"ל 5-7 Percoll של 70% ו כיסוי 7 מ"ל של Percoll 40%. להסתובב בסל"ד 2000 (לא בלם!) במשך 30 דקות.
  9. מחק תאים פגומים / פסולת המיאלין על גבי של 70% ולאסוף מונותאים גרעיניים על הממשק / 40% 70%. לדלל תאים שנאספו לפחות ב 01:01 עם 1X PBS ואת הספין של 2,000 סל"ד 5-7 דקות. Resuspend תאים של 0.5 מ"ל PBS ולהעביר אותם לתוך צינור 1.7 ependorf מ"ל. תשואה אופיינית היא ~ 500 x 10 3 תאים mononuclear לכל עכבר, מה שיותיר את מספר התאים microglial ~ 1x10 6 ב 0.5 מ"ל להכנת תאים מן המוחות וחוטי השדרה של 2-3 עכברים.

2. פיקוח על טוהר microglia ידי cytometry זרימה

מכתים עם נוגדנים מבוצעת כפי שתואר קודם עם שינויים 7,8.

  1. הכן FACS חיץ (1X PBS עם FBS 2%), FCR נוגדנים החוסמים, אנטי CD11b - PE, אנטי CD45-APC-Cy7 נוגדנים, paraformaldehyde 1% ב PBS.
  2. קח 50 μl של תאים משלב 1.9 ולהעבירם צינור חדש Eppendorf 1.7 מ"ל ולהוסיף 350 μl של חיץ FACS.
  3. הוסף μl 5-10 נגד FCR נוגדנים דגירה 10-15דקות על הקרח.
  4. פיצול תאים לשני צינורות Eppendorf. הוסף צינור 1 1 μl נגד CD11b - PE ו 2 μl נגד CD45-APC-Cy7 נוגדנים דגירה 10-15 דקות על קרח. הצינור השני ישמש שליטה שלילי מכתים נוגדנים. לאחר הדגרה עם נוגדנים להוסיף 1 מ"ל של חיץ FACS לשני צינורות ספין של צנטריפוגה קטנה בסל"ד 5400 דקות 5. אחרי ספינינג לתקן את התאים על ידי resuspending אותם μl 400 paraformaldehyde של 1% ב PBS ו vortexing.
  5. בצע ניתוח תזרים cytometry על cytometer הזרימה (LSR השנייה, BD Biosciences) באמצעות compubeads BD (BD Biosciences) עבור פקדי פיצויים כפי שתואר 8. דוגמאות של תכשירים טובים ורעים מוצגים בתרשים. 1 א, ב.

3. הבידוד של microglia ומקרופגים היקפיים מ CNS דלקת במודל של עכבר Neuroinflammation

דלקת קרום המוח אוטואימונית ניסויית (EAE) מושרה כפי שתואר קודם לכןבעיתון שלנו 7, מיון FACS מבוצע באופן דומה הפרוטוקול שפורסם 8.

  1. לגרום EAE ידי חיסון תת עורית עם 150 מ"ג ש"א 35-55 פפטיד ב 4 מ"ג / מ"ל משלים מלא של פרוינד (CFA) של קבוצה של 5-10 של C57BL 8-12 שבועות בן / 6 עכברים. הרעלן שעלת יש לתת IP (150 ng / עכבר) בימים אפס ביום שני, לאחר חיסון. עכברים הם נצפו סימנים של המחלה, החל ביום 10 לאחר חיסון, וחומרת המחלה הבקיע בסולם מספרי 0-5 כדלקמן: 0) לא מחלה; 1) זנב חלש או הליכה רעוע; 2) paresis איבר האחורית; 3) שיתוק הגפיים האחוריות, 4) שיתוק אחורית ו forelimb, ו 5) מוות או המתת חסד בשל סיבות אנושיות. עכברים בשיא של המחלה (d21 לאחר חיסון) משמשים לצורך הניסוי עם ציון המחלה אופיינית החל 1.5-2.5.
  2. לבודד תאים mononuclear מתוך מערכת העצבים המרכזית של קבוצת עכברים 5-10 כמו בשלבים 1.1-1.4 ו להכתים את התאים עם נוגדנים נגד CD11b ואנטי CD45 כמו בשלבים 2.1-2.4.בשלב 2.4 לא לתקן תאים, במקום resuspend אותם μl 400 של 1X PBS במקום paraformaldehyde 1%.
  3. מיון התא מתבצעת על ידי FACSAria לאוכלוסיות של CD11b + CD45 מיקרוגליה נמוך CD11b + CD45 בתאי היי (~ 80% מהם הם מקרופאגים פריפריה ~ 20% מהם מופעלים microglia 3; בעתיד נתייחס תאים אלה בשם " מקרופאגים "). השתמש 1.7-מ"ל ependorf צינורות לאיסוף הדגימות. 300 μl של 1X PBS עם 10% FBS יש להוסיף את צינורות לאיסוף כדי למנוע נזק של תאים ממוינים. דוגמאות של שלוש אוכלוסיות של microglia, מקרופאגים, לימפוציטים וכן מוצגים בתרשים. 2 א 'עם שער ההגדרות המתאימות מיון באיור. 2 ב. Purities מיון אופייניות היו 98-100% כפי שנקבע על ידי reanalyzing אוכלוסיות מיון של microglia (איור 2 ג) ומקרופגים (איור 2). התשואה הטיפוסי הוא 20-50 x10 3 עבור microglia ו50-100 x10 3 עבור מקרופאגים מבודד קבוצה של חמישה עכברים.

4. הבידוד של RNA

RNA יהיה מבודד באמצעות ערכת mirVana לפי הוראות היצרן עם שינויים.

  1. ספין microglia של מערכת העצבים המרכזית רגילים משלב 1.9 או תת מיון של microglia ומקרופגים משלב 3.3 ב 1.7-מ"ל צינורות Eppendorf בסל"ד 5400 5-7 דקות ב צנטריפוגה קטנה, בזהירות למחוק supernatant ולהקפיא את כדורי סלולריים על קרח יבש. עבור לשלב 4.2 או להעביר כדורי סלולריים קפואים -70 C, שם הוא יכול להיות מאוחסן במשך 2-3 חודשים.
  2. להעביר כדורי תאים קפואים כקרח קבוע הפשרה. הוסף 300 μl של מאגר תמוגה מתיק mirVana בעדינות מערבבים ידי pipeting 5-7 פעמים.
  3. הוסף 30 μl של תוסף Homogenate מ mirVana קיט, המערבולת 30 שניות לערבב, לשמור על קרח למשך 10 דקות
  4. הוסף 300 μl של Acid-Pehnol: כלורופורם מ mirVana קיט, המערבולת 30 שניות, ספין של 5 מ 'ב 10,000 סל"ד על צנטריפוגה קטנה.
  5. בזהירות את השלב מימית העליון (300 μl) ולהעביר למקום אחר צינור 1.7 Eppendorf מ"ל, לערבב עם 375 μl של אתנול 100%, להעביר לסנן המחסנית מתוך mirVana ערכת ספין דקות 1 בסל"ד 10,000.
  6. מחק זרימה דרך חיץ, הוסף 700 μl של פתרון Wash אני מ mirVana קיט, ואת הספין דקות 1 10,000 סל"ד.
  7. לשטוף פעמיים נוספות עם 500 μl של שטפי הפתרון השני מ mirVana הערכה ולבסוף elute RNA ממחסנית עם 60 μl מים nuclease ללא מחומם מראש.
  8. הכמות והאיכות של RNA נבחנת באמצעות ספקטרופוטומטר Nanodrop. ריכוז של RNA צריך להיות 5-20 ng / ml ו OD λ260 / λ280 יחס בטווח 1.7-2.0. אם ריכוז של רנ"א נמוכה 3 ng / ml ו OD 260λ/280λ נמוך 1.6, הדגימות מבוטלים. דגימות רנ"א ניתן לאחסן ב -70 מעלות צלזיוס למשך 6-12 חודשים.
  9. המאפשרת אמידה נוספת של איכות RNA, AR דגימותדואר נותחו באמצעות אלקטרופורזה ג'ל ג'ל TBE-דשן 15% (החיים טכנולוגיות). דוגמאות אופייניות של איכות טוב ורע ההכנות רנ"א מוצגים בתרשים. 3 א ו Fig.3b, בהתאמה.

5. זיהוי של מירנה ב microglia ומקרופגים

לצורך ניתוח הביטוי מירנה, בזמן אמת כמותי הפוך transcriptase PCR (qRT-PCR) ניתוח מתבצע באמצעות מבחני TaqMan עם primers ו בדיקות ניאון עבור microRNA מסוים של עניין ואחד RNAs קצרים לידי ביטוי בכל מקום בגוף (למשל snoRNA-55, snoRNA -135 או U6) לנורמליזציה. Primers ו בדיקות ניאון עבור קבוצות מיוחדות של מירנה אדם או העכבר ניתן לרכוש החיים טכנולוגיות בע"מ הנה נשתמש miR-124 כדוגמא עבור מירנה עניין snoRNA-55 כדוגמה לנורמליזציה.

  1. בצע להפוך התגובה transcriptase לעשות cDNA מ דגימות רנ"א באמצעות ערכת TaqMan שעתוק לאחור:
פריט נפח (μl) לדגימה
פריימר 5x RT 1.00
RNA מדגם 1.67
RT Mix אנזים
25 מ"מ כל אחד (סה"כ 100 mM) dNTPs 0.050
MultiScribe transcriptase הפוכה) 0.333
מאגר 10X RT 0.500
א.ב. RNase אינהיביטור 0.063
Nuclease ללא מים 1.388
סך הכל 5.00

לדלל RNA דגימות ריכוז ng 3 / μl. להכין תערובת אנזימים RT ולשים 3.33 μL לצינורות ה-PCR מוסיפים 1.67 μl של מדגם RNA. דגירה של מכשיר ה-PCR (BioRad) בשעה 16 ° Cבמשך 30 דקות, 42 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות, 85 ° C במשך 5 דקות, ולהגדיר ב 4 ° C בהמתנה.

  1. ביצוע בזמן אמת תגובת PCR באמצעות שילוב TaqMan PCR:
פריט נפח (μl) לדגימה
RT המוצר 1.0
2X TaqMan מיקס מאסטר 5.0
5X Probe 2.0
Nuclease ללא מים 2.0
סך הכל 10.0

השתמש צלחת 384 גם ברור התגובה אופטי (החיים טכנולוגיות) עבור התגובה של כל בזמן אמת PCR מכשיר AB 7900 HT. תנאי רכיבה על אופניים: 95 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות, [95 מעלות צלזיוס למשך 5 שניות, 60 מעלות צלזיוס למשך 60 שניות] x 40 מחזורים.

  1. עקומות אופיינית עבור סכום של fluoשכותרתו rescently ספציפיים מוצרי ה-PCR (Y למוצרי צירים) עבור snoRNA-55 ו miR-124 עבור דגימות רנ"א (מדגם זה הוא כפילויות) שבודדו microglia ו מח עצם מקרופאגים הנגזרים (BMDMs) לעומת מספר מחזורי (צילומי צירים) הם באיור. 4 א, ב.

6. נורמליזציה ניתוח נתונים

רמות הביטוי היחסי של מירנה עניין (miR-124) מחושבים באמצעות השיטה ΔΔCT כפי שתואר קודם 7,9 באמצעות snoRNA-55 לנורמליזציה של הסכום הראשוני של רנ"א.

  1. דוגמה של חישוב רמת היחסי של הביטוי miR-124 עבור microglia ו BMDMs מוצג לוח.
  2. כצעד ראשון, ערכי ה-CT של snoRNA-55 ו miR-124 נקבעים על microglia ו BMDMs מ qRT-PCR עקומות (Fig.4, לוח, עמודות: snoRNA-55 ו miR-124).
  3. כשלב שני, ערכים ΔCtמחושבים עבור כל עותק של מדגם זה על ידי חיסור של CT עבור snoRNA-55 (נורמליזציה) מ Ct עבור miR-124 (ניסוי) (לוח א, עמודות: CT (נורם), CT (EXP), ו ΔCt).
  4. כצעד שלישי. ערכים ΔΔCt מתקבלים לאחר ניכוי ΔCt המדגם הפניה (ΔCt (נ"צ)) מערכים ΔCt של דגימות אחרות (לוח א, עמודה: ΔΔCt). דגימה אחת מוגדרת כנקודת התייחסות, רמת היחסי של מירנה ביטוי למדגם זה יוגדר 1.0. דגימות כל שאר נשווה את המדגם הפניה זו. במקרה שלנו, אנו מגדירים את רמת miR-124 במדגם הראשון microglia כמו 1.0, ולכן ΔCt (נ"צ) = 0.49 (לוח א, שורה 1, מסומנים באדום).
  5. לבסוף, הרמה היחסית של הביטוי מחושב 2-ΔΔCt (לוח א, עמודה: miR-124 expression).
  6. כל qRT למוצרי PCRs מבוצעות triplicates או כפילויות, ורמת היחסית של הביטוי מוצג ממוצע ± סטיות תקן (SD) עבור triplicates (איור 5 א, ב) או בצד הן כפילויות על ידי הצד כפי שמוצג באיור. 5 ג.

7. נציג תוצאות

עקומות אופייניות בזמן אמת PCR וערכי ה-CT של miR-124 (microRNA של ריבית) וכן snoRNA-55 (נורמליזציה), כמו גם רמות יחסית של ביטוי miR-124 מוצגים באיור. 4 ולוח אני. בניסויים שלנו השתמשנו snoRNA-55 כביקורת לנורמליזציה. כפי שהזכרנו לעיל, RNAs בכל מקום אחר ניתן להשתמש גם לנורמליזציה כגון snoRNA-135 ו U6.

דוגמאות של הביטוי של miR-124 בוגרים ב מיקרוגליה לעומת מח עצם מקרופאגים הנגזרים (BMDMs) מוצגים בתרשים. 5 א (BMDMs גדלו presencהדואר של M-CSF כמתואר 7). באיור. 5 ב ', השווינו את הביטוי של miR-124 באוכלוסיות מיון של CD45 microglia נמוך לעומת CD45 מקרופאגים היי. בשני ניסויים אלה הראינו כי microglia שונים מקרופאגים אחרות של ביטוי רמות גבוהות יותר של miR-124. ניסויים דומים ניתן לבצע בעתיד על קינטיקה של הפעלת microglia in vivo או במבחנה.

הביטוי של miR-124 ב microglia מבודד מערכת העצבים המרכזית של C57BL / 6 עכברים בשלבים שונים של פיתוח מוצג איור. 5 ג. נתונים אלה מראים כי microglia בשלבים המוקדמים של הפיתוח אקספרס נמוך רמות של miR-124, אשר בקורלציה עם הפנוטיפ פעיל שלהם 7. ניתוח דומה ניתן לבצע על מנת ללמוד את הפונקציות של מערכת העצבים המרכזית microglia רגילים כגון השוואה בין הביטוי של miRNAs מסוימות microglia שבודדו באזורים שונים של מערכת העצבים המרכזית: המוח הקטן, שלכבל pinal וכו 'ההיפוקמפוס

figure-protocol-1

באיור 1. הדוגמאות של ההכנות הטובים והרעים של microglia כפי שנקבע על ידי cytometry הזרימה. במקרה של בידוד "טוב" של microglia מ CNS רגילים, 95-98% של התאים לייצג CD11b + CD45 microgla נמוכה עם 2-5% של CD11b + CD45 היי perivascular מקרופאגים. פחות מ 1% של CD11b - CD45 לימפוציטים או CD11b היי - CD45 - תאים astroglial או oligodendroglial או שברי התא צריך להיות נוכח (א). במקרה של הכנת "רע" מוצג כאן (ב) 18% של זיהום CD11b - CD45 - תאים קיים (ב, ברבע השמאלי התחתון) המצביע על הפרדה מספקת צבע Percoll. במקרה של הכנה טובה, 95-98% של התאים צריך לייצג CD11b + CD45נמוך microglia (רביע, השמאלית העליונה), 2-5% של כל התאים צריכה לייצג CD11b + CD45 מקרופאגים היי perivascular (רביע, הימנית העליונה), ופחות מ 1% של כל התאים צריכה לייצג CD11b תאים מזהמים שליליים (, להוריד ברבע משמאל). במקרה של "הכנה רע", זיהום משמעותי של CD11b - CD45 - תאים או שברי תאים (astroglia, חלקיקים המיאלין וכו ') נמצאים (ב, ברבע השמאלי התחתון), מה שהופך את ההכנה של תאים מתאים בידוד RNA ועוד ניתוח. בנוסף, CD11b - CD45 בתאי היי יכול להיות נוכחת גם במקרה של "הכנה רע" (ב, ברבע הימני התחתון) המציין זיהום על ידי לימפוציטים דם עקב זלוף מספיק.

figure-protocol-2
איור 2. תזרים cytometry analysiשל ומיון אוכלוסיות של microglia ומקרופגים היקפי מ CNS חולים (א) במהלך neuroinflammation שלוש אוכלוסיות של התאים נמצאים מערכת העצבים המרכזית: CD11b + CD45 נמוכה (microglia), CD11b + CD45 היי (מקרופאגים), ו CD11b - CD45. היי (לימפוציטים), כפי שמוצג הימנית העליונה, השמאלית העליונה הרביעים הימנית התחתונה, בהתאמה. גייטס למיון אוכלוסיות של CD11b + CD45 נמוכה microglia ו CD11b + CD45 מקרופאגים היי מוצגים (ב) ואת purities של אוכלוסיות reanalyzed מיון מוצגים (ג, ד). Gating ראשוני על תאים קיימא המבוסס על FSC / SSC פרמטרים יושמה.

figure-protocol-3
איור 3. דוגמאות qualit "טוב" או "רע"IES של RNAs מבודד microglia ונותחו על ידי ג'ל אלקטרופורזה. במקרה של איכות טובה, סולם RNA ו-RNA ריבוזומלי ניכר (א). במקרה של איכות מריחה רע, ו 'נמוכה' מולקולריים השפלה מוצרים משקל ניכרים (ב).

figure-protocol-4
באיור 4. בזמן אמת qRT-PCR עקומות עבור שכותרתו fluorescently miR-124 ו-snoRNA 55 מוצרי ה-PCR. Curves עבור snoRNA-55 (א) ו miR-124 (ב) מוצגים microglia ו מח עצם מקרופאגים הנגזרים (BMDMs). הניסוי בוצע ב כפילויות. ערכי ה-CT נקבעו על ידי הצטלבות של קו הבסיס עם החלק התחתון של תחום ליניארי של qRT-PCR מתעקל כפי שמוצג (ב). לחץ כאן כדי להציג דמות גדולה .

snoRNA-55 miR-124 DCT = CT (Exp)-CT (נורם) DDCt = DCT-DCT (נ"צ) רמה יחסית הביטוי = 2-DDCt
CT (נורם) CT (EXP) DCT DDCt miR-124 הביטוי
Microglia של מערכת העצבים המרכזית רגילים 24.082 24.572 0.49 (נ"צ) 0 1.0
23.766 24.291 0.525 0.035 1.02
מח עצם (מקרופאגים הנגזרות BMDMs) 26.879 32.231 5.352 5.317 0.025
26.526 32.078 5.552 5.517 0.022

לוח ט חישוב הרמות היחסיות של הביטוי miR-124 ב מיקרוגליה לעומת מקרופאגים מח עצם הנגזרים על בסיס של ערכים ג'טי עבור miR-124 (microRNA של ריבית) וכן snoRNA-55 (שלט לנורמליזציה).

figure-protocol-5


איור 5. ניתוח של ביטוי miR-124 ב microglia ומקרופגים. השוואה בין הביטוי-124 מיר microglia מ CNS רגילים לעומת מח עצם ומקרופגים הנגזרים (BMDMs) מוצג (א). השוואת miR-124 ב microglia לעומת מקרופאגים הפריפריה מבודדים של מערכת העצבים המרכזית אצל עכברים עם neuroinflammation מוצג (ב). שינוייםרמת הביטוי של miR-124 ב microglia במהלך הפיתוח של עכברים של 1, 2, ו 4 שבועות בהשוואה לעכברים בוגרים (בגיל 8 שבועות) מוצג (ג). ב (a, b) את הניסוי בוצע בשלושה עותקים עם ממוצע ± סטיית תקן של שלוש תגובות נפרדות ה-PCR הראו. ב (ג) הניסוי נערך כפילויות כמצוין.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

לאחרונה עניין רב ניתנה microglia ומעורבות של תאים אלה מחלות רבות הקשורות neuroinflammation ו ניוון מוחיים. בנוסף, התפקיד של מיקרו RNA של התמיינות של תאים חיסוניים וסרטן גדל באופן דרמטי על 5,10 מספר השנים האחרונות. דיווחנו בעבר את התפקיד של miR-124 בשמירה על הפנוטיפ לא פעיל או מנוחה של microglia ב CNS רגילים -7, אבל את התפקיד של סוגים אחרים של מיקרו RNA של הפנוטיפ microglia ומדינה ההפעלה עדיין לא גילו. זה יחייב פיתוח שיטות חדשות למדידת ביטוי מירנה במיוחד micro...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

אין ניגוד עניינים הצהיר.

תודות

העבודה נתמכה על ידי R01 NIH NS071039-01A1 מענק מחקר.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
שם מגיב חברה מספר קטלוגי תגובות
1X PBS GIBCO 14190 אפשר להכין מכל המרכיבים היבשים pH מעבדה,: 7.2-7.4
10X PBS Thermo Scientific SH30258.02 אפשר להכין מכל המרכיבים היבשים pH מעבדה,: 7.2-7.4
DMEM, FBS GBCO 11965, 10438
miRVana ערכת Invitrogen AM1561
Percoll סיגמא P4937-500 מ"ל 100 מ"ל של Percoll 100% מוכן על ידי ערבוב 10 מ"ל של PBS 10X ו 90 מ"ל של Percoll מ Sigma.
50 מ"ל של Percoll 70% הואשהוכן על ידי ערבוב של 35 מ"ל של Percoll 100% ו 15 מ"ל של DMEM
50 מ"ל של Percoll 40% מכינים על ידי ערבוב של 20 מ"ל Percoll 100% ו - 30 מ"ל של 1X PBS
ש"א 35-55 פפטיד AnaSpec Inc 60130-5
CFA DIFCO 263810
שעלת רעלן סיגמא P7208
FCR חסימת נוגדנים BD Biosciences 553142 Clone 2.4G2
נגד CD11b - PE MAB BD Biosciences 553311 ניתן להשתמש fluorophores שונים (למשל AF488)
Anti-CD45-APC-Cy7 מבז Biolegend 103116 ניתן להשתמש fluorophores שונים (לדוגמא: APC)
Paraformaldehyde (16%) EMS Inc 15710 לדלל 1:15 ב 1X PBS
15% TBE-דשן ג'ל החיים טכנולוגיות בע"מ EC68855BOX
הפוך TaqMan MicroRNA תמלול Kit Life Technologies Inc 4366596
TaqMan יוניברסל PCR מיקס מאסטר Life Technologies Inc 4304437
TaqMan מבחני microRNA MMU-miR-124a Life Technologies Inc 4427975 מזהה 001182
TaqMan מבחני microRNA snoRNA-55 Life Technologies Inc 4427975 מזהה 001228
Nuclease ללא מים Life Technologies Inc AM9937 Nuclease ללא מים
384 גם ברור התגובה אופטי צלחת החיים טכנולוגיות בע"מ 4309849 ניתן להחליף עם לוחות אחרים (למשל 96 צלחת היטב) בזמן אמת מכשירים שונים ה-PCR
Dounce homogenizer (15 מ"ל) ויטון המדע מוצרים. 358044 טפלון / זכוכית
40 ניילון μ תא מסננת בז 352340
ביג צנטריפוגות Sorval RT 6000B רוטור בקוטר 18.5 ס"מ
קטן צנטריפוגות Eppendorf R 5415 רוטור בקוטר 6.5 ס"מ
בזמן אמת PCR Instrument החיים טכנולוגיות בע"מ AB 7900 HT ניתן להחליף עם מכשירים אחרים
תזרים cytometer BD Biosciencess LSR II ניתן להחליף עם מכשירים אחרים
FACS BD Biosciences FACSAria ניתן להחליף עם מכשירים אחרים
Nanodrop ספקטרופוטומטר Thermo Scientific Nanodrop 1000

מקורות

  1. Tremblay, M. E. The Role of Microglia in the Healthy Brain. J. Neurosci. 31, 16064-16069 (2011).
  2. Graeber, M. B., Li, W., Rodriguez, M. L. Role of microglia in CNS inflammation. FEBS Lett. , (2011).
  3. Ponomarev, E. D., Shriver, L. P., Maresz, K., Dittel, B. N. Microglial cell activation and proliferation precedes the onset of CNS autoimmunity. J. Neurosci. Res. 81, 374-389 (2005).
  4. Perruisseau-Carrier, C., Jurga, M., Forraz, N., McGuckin, C. P. miRNAs stem cell reprogramming for neuronal induction and differentiation. Mol. Neurobiol. 43, 215-227 (2011).
  5. McCoy, C. E. The role of miRNAs in cytokine signaling. Front Biosci. 17, 2161-2171 (2010).
  6. He, M., Xu, Z., Ding, T., Kuang, D. M., Zheng, L. MicroRNA-155 regulates inflammatory cytokine production in tumor-associated macrophages via targeting C/EBPbeta. Cell Mol. Immunol. 6, 343-352 (2009).
  7. Ponomarev, E. D., Veremeyko, T., Barteneva, N., Krichevsky, A. M., Weiner, H. L. MicroRNA-124 promotes microglia quiescence and suppresses EAE by deactivating macrophages via the C/EBP-alpha-PU.1 pathway. Nat. Med. 17, 64-70 (2011).
  8. Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS). J. Vis. Exp. (41), e1546-3791 (2010).
  9. Gabriely, G. MicroRNA 21 promotes glioma invasion by targeting matrix metalloproteinase regulators. Mol. Cell Biol. 28, 5369-5380 (2008).
  10. Caffarelli, E., Filetici, P. Epigenetic regulation in cancer development. Front Biosci. 17, 2682-2694 (2011).
  11. Cardona, A. E., Huang, D., Sasse, M. E., Ransohoff, R. M. Isolation of murine microglial cells for RNA analysis or flow cytometry. Nat. Protoc. 1, 1947-1951 (2006).
  12. Gordon, R. A simple magnetic separation method for high-yield isolation of pure primary microglia. J. Neurosci. Methods. 194, 287-296 (2011).
  13. Moltzahn, F., Hunkapiller, N., Mir, A. A., Imbar, T., Blelloch, R. High Throughput MicroRNA Profiling: Optimized Multiplex qRT-PCR at Nanoliter Scale on the Fluidigm Dynamic ArrayTM IFCs. J. Vis. Exp. (54), e2552(2011).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

RNARNACTCD11b CD45EAECNS

מאמרים קשורים