פרוטוקול פשוט לחילוץ Hemocytes מזחלי Wild

Summary

hemocytes חרקים למלא תפקידים חשובים רבים, הוא חיסון ושאינם מחוסנים, לאורך כל שלבי התפתחות חרקים. הידע הנוכחי שלנו של הסוגים והתפקוד hemocyte מגיע ממחקרים על מודלים גנטיים של חרקים. כאן, אנו מציגים שיטה לחילוץ, כימות והמחשת hemocytes מזחלים פרא.

Abstract

hemocytes חרקים (שווה ערך לתאי דם לבנים יונקים) משחק תפקיד חשוב בכמה תהליכים פיסיולוגיים לאורך כל מחזור החיים של חרק ^1. בשלבי זחל של חרקים השייכים לצווים של פרפרים (עשים ופרפרים) וDiptera (זבובים אמיתיים), hemocytes נוצרים מבלוטת הלימפה (hematopoietic איבר מיוחד) או התאים עובריים ויכולה להתבצע דרך לשלב הבגרות. hemocytes העוברי מעורב בנדידת תאים במהלך התפתחות הרגולציה וchemotaxis במהלך דלקת. הם גם ייקחו חלק באפופטוזיס תא והם חיוניים להתפתחות עוברת ^2. Hemocytes לתווך זרוע התאית של תגובת החיסון המולדת חרקים שכוללת מספר פונקציות, כגון תא, צבירה מתפשטת תא, היווצרות של גושים, phagocytosis ואנקפסולציה של פולשים זרים ^3. הם גם אחראים לניהול הגנה הומורלית חרקים מסוימות במהלך זיהום, כגון יחסי הציבורoduction מיקרוביאלית של פפטידים ומולקולות אחרות מפעיל ^{4, 5.} המורפולוגיה והתפקוד Hemocyte שנחקרו בעיקר במודלים של חרקים גנטיים או פיסיולוגיים, כוללים זבוב פרות, דרוזופילה melanogaster ^{6, 7,} יתושי Aedes aegypti ואנופלס gambiae ^{8, 9} והטבק hornworm, Manduca ^{10 סקסטה, 11.} עם זאת, מעט מידע קיים היום על הגיוון, סיווג, מורפולוגיה והתפקוד של hemocytes במינים שאינם מודל חרקים, במיוחד אלה שנאספו ^מ12 הפרועים.

כאן אנו מתארים פרוטוקול פשוט ויעיל לחילוץ hemocytes מזחלים פרא. אנו משתמשים instar Lithacodes fasciola הלפני האחרון (עש קליע צהוב כתפיים) (איור 1) וEuclea delphinii (קליע אלון קוצני) זחלים (פרפרים: Limacodidae) ומראים כי היקפים מספיקים של hemolymph (דם חרקים)יכול להיות מבודד ומספרי hemocyte נספרו מזחלי פרט. שיטה זו יכולה להיות מנוצלת ביעילות ללמוד סוגי hemocyte במינים אלה, כמו גם בזחלי lepidopteran נלווים אחרים שנקטפו מהשדה, או שזה יכול להיות בקלות בשילוב עם מבחנים אימונולוגיים שנועדו לחקור את תפקוד hemocyte בעקבות הידבקות בחיידקים או אורגניזמים טפילים ^13.

Protocol

1. הכנת חומר

1. הכן את המחטים (1-2 קצה מיקרומטר ולהתחדד מ"מ 3-4) באמצעות צינורות זכוכית נימי ורוסיליקט וחולץ micropipette. הגדרות מכשיר: רמפה: 561; מהירות: 20; חום: 560; עיכוב: 1; משיכה: 100; לחץ: 500.
2. הכן את פתרון האוסף: 60% מבינוניים של גרייס (GM) בתוספת 10% בסרום שור עוברי (FBS) ו 20% ממאגר נוגד קרישה (98 mM NaOH, 186 המ"מ NaCI, 1.7 mM EDTA וחומצת לימון 41 מ"מ, pH 4.5 ). הפתרון לעיל מוכן טרי בתנאים סטריליים ושמר על קרח בכל העת.
3. הכן את פתרון....

Results

הפרוטוקול המתואר כאן מאפשר גביית היקף מינימאלי של 10-20 μl של hemolymph חרקים מזחלים בודדים. Hemocytes שנאסף בשיטה זו היא ללא clumping תא, פגמי melanization, פסולת רקמה או מזהמים אחרים. לכן hemocytes ניתן להבחין בקלות וספר מתחת למיקרוסקופ, וכמה חרקים ניתן להבחין בתוך כמה Hosur. הבחנו כי רוב hemocytes בדגימות שלנו היה מורכב מplasmatocytes ³ ​​(hemocytes מתפשט סימטרי) (איור 4). בימים אלו אנו מאפיינים את הסוגים שונים נמצאו בhemocyte זחלים אלה בפירוט (Stoep.......

Discussion

שיטות לחילוץ hemocytes מחרקים רפואיים חשובים וחרקי מודל lepidopteran העבר דיווח ^{9, 14.} שיטות חילוץ Hemocyte מותאמות על פי מיני חרקים, השלב ההתפתחותי של החרק ותכונות המורפולוגיות שלה. לדוגמה, בידוד hemolymph מזחלי Manduca יכול להתבצע בקלות על ידי חיתוך הקרן המעוקלת סמוך לסוף הבטן ^15. בגלל זחלי קליע (Limacodidae) חסרי מבנה בטן זו, פתח פרוטוקול ברור להפקת hemolymph מזחלים קטנים בגודל השדה שנאספו-. שיטה זו מוכיחה יעילה לבידוד כרכי hemolymph מספיקים המכיל.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
שם המגיב	חברה	מספר קטלוגים	תגובות
Micropipette חולץ	סאטר מכשירים	P-1000
צינורות זכוכית ורוסיליקט	סאטר מכשירים	B100-50-10	OD: 1.0, מזהה: 0.50 מ"מ
הבינוני של גרייס	סיגמא	G8142
סרום שור עוברי	תרם הפישר סיינטיפיק	SH3007102	חום מומת
דומון # 5 מלקחיים	כלי המדע פיין	11252-40
נויבאואר hemocytometer	אוסר מדעי	3200
פלסטיק טוביםng	Tri-Tech	TT-3-32OD	OD: 3/32'', מזהה: 1/32 '
זכוכית רפואית מזרק	פורטונה אופטימה	D-97877	50 מיליליטר נפח
מחט קצה קהה	חלקים קטנים	NE-162PL-25	16 מד x 1 "אורך