הדור והאפיון של תאי T ספציפיים סרטניים באמצעות עכבריים מתואר כאן. רקמה הרתי אדם ותאי גזע hematopoietic מהונדס גנטי אדם מושתלת לעכברי מדוכאי חיסון. התוצאה הוא הכינון מחדש של מערכת חיסון אנושית מהונדסת מאפשרת בבדיקת vivo של תגובות חיסוניות אנטי סרטניות.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
שימוש בעכבר האנושי של BLT כמודל לתאי גזע מבוסס Gene Therapy גידול
במאמר זה
סיכום
תקציר
מודלים של בעלי חיים קטנים כגון עכברים נעשו שימוש נרחב על מחלה אנושית ולפתח התערבויות טיפוליות חדשות. למרות השפע של מידע המתקבל ממחקרים אלה, המאפיינים הייחודיים של חסינות עכבר כמו גם את הספציפיות של מיני מחלות נגיפיות כמו נגיף כשל חיסוני אנושי (HIV) זיהום הובילו לפיתוח של מודלים עכבריים. הדגמים הקודמים כללו שימוש בג B 17 עכברים SCID / SCID וההשתלה של בלוטת התימוס האנושי עוברית וכבד עובריים מכונית / ליב (SCID-hu) 1, 2 או העברת המאמצת של לויקוציטים דם ההיקפי אדם (SCID-huPBL ) 3. שני הדגמים נוצלו בעיקר לצורך הלימוד של ההידבקות ב-HIV.
אחת המגבלות העיקריות של שני מודלים אלה היה חוסר יציבות הכינון מחדש של תאי מערכת חיסון אנושיים בפריפריה כדי להפוך אותם יותר מבחינה פיזיולוגית מודל רלוונטי על מחלת איידס. לשם כך, זמזום BLTמודל העכבר anized פותח. BLT עומד למח עצם / כבד / התימוס. במודל זה, 6-8 בן השבוע NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl / SzJ (NSG) עכברי מדוכאי חיסון יקבל את שתלך / ליב כמו במודל של עכברי SCID-hu רק כדי להיות אחרי השתלה שנית אדם גזע hematopoietic תא 4. היתרון של שיטה זו הוא הכינון מחדש המלא של מערכת החיסון האנושית בפריפריה. דגם זה נעשה שימוש כדי לחקור הדבקה ב-HIV והשהיה 5-8.
לנו שנוצרנו גרסה שונה של מודל זה שבו אנו משתמשים בשינוי גנטי בתאי גזע hematopoietic אדם (hHSC) כדי לבנות את שתלך / ליב אחרי ההזרקה של transduced עצמי 7 hHSC, 9. גישה זו גורמת לדור של שושלות מהונדסות גנטי. וחשוב יותר, התאמן במערכת זו כדי לבחון את הפוטנציאל של יצירת תאי T ציטוטוקסיים תפקודיים (CTL) מבטא רצפטור תא T ספציפי מלנומה. שימוש במודל זה היינו יכול להעריך את הפונקציונליות של CTL המהונדס ניצול חייה פליטת פוזיטרוני הדמית טומוגרפיה (PET) כדי לקבוע נסיגת גידול (9).
המטרה של פרוטוקול זה היא לתאר את תהליך יצירת העכברים הטרנסגניים הללו והערכה ביעילות vivo שימוש בבדיקה PET חי. בתור הערה, שכן אנו משתמשים רקמות אדם ווקטורי lentiviral, המתקנים שלנו תואמים את הנחיות ה-CDC NIH לרמת בטיחות ביולוגית 2 (BSL2) עם אמצעי זהירות מיוחד (BSL2 +). בנוסף, עכברי NSG הם immunocompromised קשות וכך, הדיור ואחזקתם חייב לעמוד בסטנדרטים הגבוהים ביותר לבריאות (http://jaxmice.jax.org/research/immunology/005557-housing.html).
פרוטוקול
דור א 'של עכברי BLT
הדור של עכברי BLT מחולק לשלושה (3) חלקים: (1) עיבוד של רקמה והכנת CD34 תאי גזע עוברי אנושיים hematopoietic, (2) השתלה של רקמה אנושית, ו (3) השתלה משנית. לכל הפרוטוקולים, אנו מספקים טבלה 1 עם מידע מגיב.
1. עיבוד רקמות ובידוד של CD34 תאי גזע hematopoietic אדם
רקמה טריה או רקמה עוברית נשלחת לילה על קרח מסוכנויות רכש איברים שונות ניתן להשתמש. לעתים רקמה עוברית היא לא סטרילי, כפי שמעיד ייצור של....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
תרשים זרימה של תהליך ההשתלה מוצג באיור 1 א. תמונה של שתלך / ליב מוצגת בתרשים 1B. הרקמה הרתי מתפתחת בדרך כלל ויש לו הפצה פיזיולוגית של אדם וCD4 CD8 תאי T. בעקבות כינון מחדש, החיות לשאת מערכת חיסון אנושית עם התפלגות נורמלית של CD4, CD8 תאי T ושושלות תאים אחרות של מערכת חיסון.
הפער בין גודל גידול ורקמת חיה מוצג באיור 2. בעוד בדיקת CT (אזור האפור) ציינה את צמיחת גידו.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
המודל השונה BLT אנושי העכבר בשילוב עם in vivo PET ההדמיה הם כלים רבים עצמה כדי לחקור מחלות אנושיות כרוניות. מערכת זו לוקחת את מודל עכבר BLT והתקדמותה אל מעבר להיקף המוגבל למחקר איידס. בנוסף, מדובר במערכת גדולה שבה אנו יכולים לבחון פרוטוקולים שונים ריפוי גנטיים, כמו גם טכניקות אבחון לפני שהם יכולים להגיע להגדרה הקלינית. האחרון בשילוב עם העלות הנמוכה של שימוש בעכברים לעומת קופים הופך מודל זה מאוד שימושי.
ט.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
אין ניגודי האינטרסים הכריזו.
תודות
ברצוננו להודות לאלווין וולש ולארי פאנג לסיוע הטכני שלהם. עבודה זו מומנה בחלקו על ידי המכון הלאומי לבריאות (NIH) בפרס P50 CA086306, קליפורניה המכון לרפואת הרגנרציה (CIRM) מענקי RC1-00149-1 וRS1-00203-1; פקולטת הפרס החדש CIRM RN2-00902-1 , מרכז קלטק-UCLA המשותף לTranslational רפואה, אוניברסיטת קליפורניה במרכז לחקר מחלת איידס (CFAR) NIH / NIAID AI028697, אוניברסיטת UCLA איידס המכון, כלי CIRM ופרס הטכנולוגיה RT1-01126, ותכנית מחקר Multicampus UC והיוזמות מקליפורניה מרכז לגילוי תרופות אנטי (המספר MRPI-143226).
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| שם המגיב | חברה | מספר קטלוגים | תגובות (אופציונלי) |
| PBS | Invitrogen | 10010049 | |
| RPMI 1640 | A1049101 | ||
| Iscove של | 12440061 | ||
| עוברי עגל בסרום | 16000085 | ||
| Collagenase הסוג הרביעי | סיגמה אולדריץ | C5138 | |
| Hyaluronidase | H3506 | ||
| אני DNAse | אבחון רוש | 10104159001 | |
| Piptazo (Zosyn) | פייזר | שילוב Piperacillin / tazobactam | |
| Ficoll (Ficoll-Paque פלוס) | GE Healthcare מדעי חיים | 17-1440-02 | |
| MACS המאגר | Miltenyi יוטק | ראה הערות | חיץ MACS: PBS בתוספת 0.5% בסרום שור עוברי וmM ציטראט דקסטרוז 2 נוסחה |
| CD34 Microbead קיט | 130-046-702 | ||
| עמודות LS | 130-042-401 | ||
| Retronectin | TAKARA | T100A | |
| Matrigel | BD Biosciences | 354263 | |
| Isofluorane | בקסטר | http://www.baxter.com/healthcare_professionals/products/forane.html | |
| Carprofen (Rimadyl) | פייזר בריאות בעלי חיים | https://www.rimadyl.com/default.aspx |
מקורות
- McCune, J. M., Namikawa, R., Kaneshima, H., Shultz, L. D., Lieberman, M., Weissman, I. L. The SCID-hu mouse: murine model for the analysis of human hematolymphoid differentiation and function. Science. 241 (4873), 1632-1639 (1988).
- Bristol, G. C., Gao, L. Y., Zack, J. A.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
