Method Article

כלי אנליטי שמכמת שינויי מורפולוגיה תאיים מתמונות פלואורסצנציה תלת ממדים

DOI:

10.3791/4233

⸱

August 31st, 2012

 ,  , 
1Medications Development, Ernest Gallo Clinic and Research Center, University of California, San Francisco , 2Clinical Pharmacology and Experimental Therapeutics, University of California, San Francisco , 3Translational Research Institute and the Institute for Health and Biomedical Innovation, Queensland University of Technology, Brisbane, Australia

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פתחנו פלטפורמת תוכנה שמנצלת Imaris Neuroscience, ImarisXT וMATLAB כדי למדוד את השינויים במורפולוגיה של צורה מוגדרת נלקחה מפלואורסצנטי confocal תלת ממדי של תאים בודדים. זו גישה חדשנית יכולה לשמש כדי לכמת את השינויים בצורת התא בא הפעלה קולטנית ולכן מייצגת כלי נוסף אפשרי לגילוי סמים.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כלי ניתוח התוכנה הנפוצים ביותר הזמינים למדידת תמונות פלואורסצנטיות הם עבור נתונים דו-ממדיים (2D) המסתמכים על הגדרות ידניות להכללה ואי-הכללה של נקודות נתונים, וזיהוי דפוסים בעזרת מחשב כדי לתמוך בפרשנות ובממצאי הניתוח. חשוב יותר ויותר להיות מסוגל למדוד תמונות פלואורסצנטיות הבנויות ממערכי נתונים תלת מימדיים (תלת מימדיים) על מנת להיות מסוגל ללכוד את המורכבות של הדינמיקה התאית ולהבין את הבסיס לפלסטיות התאית בתוך מערכות ביולוגיות. מכשירי מיקרוסקופיה מתוחכמים אפשרו הדמיה של תמונות פלואורסצנטיות תלת מימדיות באמצעות רכישת תמונות פלואורסצנטיות מולטי-ספקטרליות ותוכנה אנליטית רבת עוצמה המשחזרת את התמונות מערימות קונפוקליות המספקות ייצוג תלת מימדי של התמונות הדו-ממדיות שנאספו. שיטות סטריאולוגיה מתקדמות מבוססות עיצוב התקדמו מהקירוב וההנחות של הסטריאולוגיה מבוססת המודל המקורי1 אפילו בקטעי רקמה מורכבים2. למרות ההתקדמות המדעית הללו במיקרוסקופיה, נותר צורך בשיטה אנליטית אוטומטית המנצלת באופן מלא את נתוני התלת מימד הפנימיים כדי לאפשר ניתוח וכימות של השינויים המורכבים במורפולוגיה של התא, לוקליזציה של חלבונים וסחר בקולטנים.

הטכניקות הנוכחיות הזמינות לכימות תמונות פלואורסצנטיות כוללות Meta-Morph (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) ו-Image J (NIH) המספקות ניתוח ידני. תוכנת Imaris (Andor Technology, Belfast, Northern Ireland) מספקת את התכונה MeasurementPro, המאפשרת יצירה ידנית של נקודות מדידה שניתן למקם בתמונת נפח או לצייר על סדרה של פרוסות דו-ממדיות ליצירת אובייקט תלת מימדי. שיטה זו שימושית למדידות נקודות בלחיצה אחת כדי למדוד מרחק קו בין שני אובייקטים או ליצירת מצולע התוחם אזור עניין, אך קשה ליישם אותה על מבני רשת סלולרית מורכבים. עוקב נימה (אנדור) מאפשר זיהוי אוטומטי של נימה עצבית תלת מימדית עם זאת, מודול זה פותח למדידת מבנים מוגדרים כגון נוירונים, המורכבים מדנדריטים, אקסונים וקוצים (מבנה דמוי עץ). מודול זה שימש באופן גאוני לביצוע מדידות מורפולוגיות לתאים שאינם עצביים3, עם זאת, נתוני הפלט מספקים מידע על רשת סלולרית מורחבת על ידי שימוש בתוכנה התלויה בצורת תא מוגדרת במקום להיות מודל סלולרי בצורת אמורפי. כדי להתגבר על הבעיה של ניתוח תאים בצורת אמורפיים והפיכת התוכנה למתאימה יותר ליישום ביולוגי, אימאריס פיתחה את Imaris Cell. זה היה פרויקט מדעי עם Eidgenössische Technische Hochschule, שפותח כדי לחשב את הקשר בין תאים לאברונים. בעוד שהתוכנה מאפשרת זיהוי של אילוצים ביולוגיים, על ידי אילוץ גרעין אחד לכל תא ושימוש בקרומי תאים כדי לפלח תאים, לא ניתן להשתמש בה כדי לנתח נתוני פלואורסצנטיות שאינם רציפים מכיוון שבאופן אידיאלי היא בונה את פני התא ללא חללים ריקים. למיטב ידיעתנו, נכון לעכשיו לא פותחה גישה אוטומטית הניתנת לשינוי על ידי המשתמש המספקת מידע מורפומטרי מתמונות פלואורסצנטיות תלת-ממדיות המשיג מידע מרחבי תאי בעל צורה לא מוגדרת (איור 1).

פיתחנו פלטפורמה אנליטית המשתמשת במודול תוכנת הליבה של Imaris ו-Imaris XT בממשק ל-MATLAB (Mat Works, Inc.). כלים אלה מאפשרים מדידה תלת מימדית של תאים ללא צורה מוגדרת מראש ועם רכיבי רשת פלואורסצנטיים לא עקביים. כמו כן, שיטה זו תאפשר לחוקרים בעלי מומחיות נרחבת במערכות ביולוגיות, אך ללא היכרות עם יישומי מחשב, לבצע כימות של שינויים מורפולוגיים בדינמיקה של התא.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. ניתוח מורפומטריות תלת ממדי של שינויים פנוטיפי תא בודד

  1. (HEK293) תאי כליה עובריים אנושיים היו transfected עם hemagglutinin (HA) מתויג-corticotropin משחרר factor receptor-2 (CRF-R2), הקולטן G-חלבון בשילוב (GPCR) כפי שתואר לעיל 4, 5.
  2. התאים היו מטופלת כראוי (ללא טיפול, NT), מגורה עם ליגנד CRF-R2 אנדוגני, גורם משחרר corticotropin, CRF (1 מיקרומטר, 30 דקות), או pretreated עם אנטגוניסט CRF-R2 סלקטיבית, 30 נגד sauvagine (AS -30, 1 מיקרומטר, 30 דקות) לפני טיפול אגוניסט.
  3. התאים אז היו נעוצים, permeabilized וטופלו באנטי HA. CRF-R2 היה דמיין באמצעות Alexa 594 ננומטר המצומד נגד עכבר (1 IgG) נוגדנים. DAPI שמש כדי להמחיש את השלב המיטוטי גרעינים.
  4. כדי להגביל את הסובייקטיביות הנסיין, את תנאי הניסוי לא היו ידועים עד לאחר התמונות נרכשו ונותחו.
  5. אנו רכשנו תמונהשל מHEK293 תאים קבועים באמצעות מיקרוסקופ Zeiss LSM 510 META confocal מטרת תכנית-apochromat 63x/1.4 שמן דסק"ש ומחובר למערכת קוהרנטית משולבת שני פוטוני ליזר המורכבת מורדים-V5 ליזר ומירה 900-F מערכת ליזר.
  6. במהלך תהליך רכישת הנתונים, התאים היו ממודרים הוא על ידי חתך multispectral, 488 ננומטר, ו790 ננומטר (ננומטר ~ Ex 350 2ph.) ומחיצות z (0.5 מרווחי מיקרומטר) כדי לכלול נתונים מקרום הגרעין לרצפטור התאי החיצוני גפיים.
  7. נתוני הקרינה עובדו ראשונים באמצעות Imaris, המאפשר הדמיה והפילוח של בסיס נתוני מיקרוסקופיה 3D, ומודל 3D המורכב מvoxels מעוקבים נוצר עבור ניתוח מורפומטריות.
    ואז, Imaris XT מודול נוצל לImaris ממשק עם שפת תוכנת מחשב MATLAB כדי לקבוע את נקודת ציון של רחבות GPCR.
    לקחת בחשבון השתנות סלולרית, השיג ונתחתי פלואורסצנטי תמונות takבדרכו מ22 תאים: ללא טיפול (NT) (n = 7), אגוניסט טיפול (CRF) (n = 8) וטיפול מראש עם יריב (AS-30) לפני טיפול אגוניסט (n = 7) (איור 2) .
    1. האזור של עניין (ROI) צריך לכלול תא אחד שהוא לא בשלב המיטוטי פעיל ולא לסגור לתאים אחרים. באופן זה, הניתוח יכלול תאים בעלי גרעין אחד בלבד ושלוחות הקולטן אינם מוטרדים קרבה של תאים אחרים.
    2. המבנה שוחזר 3D הסלולרי ראשון מנתוני קרינת multispectral באמצעות Imaris (v.7.1.1).
    3. בעקבות האלגוריתם שתוכנן על ידי Imaris, 1 עיבוד פני השטח נוצל כדי לייצג את קרום הגרעין. Imaris יקבע אם יש יותר מגרעין אחד בהחזר על ההשקעה.
    4. אז אלגוריתם כתמי יצירה נוצל כדי לאתר את סיומת CRF-R2. זיהוי כתמים נוצל כי זה מפצה על רעשי רקע ועצמה חריגה שלרשת מורכבת של תאי אמורפי בצורה.
    5. כדי למקסם את ההכללה של כל יחידת איתור קרינה של CRF-R2, בקוטר של הכתמים נקבע ל 0.2 מיקרומטר, המהווה את היחידה הקטנה ביותר בתוך התמונה על מנת להסיק מידע ייחודי בצורה של עצמה נמדדת באמצעות גאוסי מסנן. סינון ספוט התאגד בתהליך יצירת הנקודות האוטומטיות. התוכנה, לעומת זאת, נותנת למשתמש את הגמישות להשתמש במסננים כדי להגדיר את הפרמטרים.
    6. כדי להימנע מחיתוך נתונים, ערכת הנתונים הוסבה מ8-bit (לא חתום) נקודה קבועה, לעשרוני 32-bit.
    7. נתוני עוצמות voxel הוחלפו לזהות נתוני קואורדינטות באמצעות מודול Imaris XT interfaced עם MATLAB ואת המיקום המרחבי המדויק של כל נקודה נקבע על ידי ביצוע שינוי מרחק באמצעות קרום הגרעין כנקודת התייחסות (איור 3).
  8. הנתונים שיתקבלו ניתן לכמת ומוצגים בפורמט גרפי ליםניתוח tatistical. השוואות בין קבוצות בוצעו באמצעות דו כיוונית ANOVA וBonferroni posttest. נתונים מוצגים כממוצע ± SD. הבדלים נחשבים משמעותי ב* p <0.05. חישובים נעשו עם פריזמה GraphPad 5.02 (איור 4).

2. נציג תוצאות

כדי להדגים את כוחה של הגישה שלנו, לכמת את השינויים התאיים הנובע מהאינטראקציה של קולטני G חלבון מצמידים (GPCRs) וגורם משחרר corticotropin הקולטן-2 (CRF-R2) עם CRF יגנד אנדוגני בHEK293 תאי transfected.

אנו מראים כי רצפטורים CRF-R2 ממוקמים בקרום הפלזמה ופרויקט מאזורים סופיים של הקרום של התאים (האיור 2A וסרט 1). באמצעות ניתוח 2D קונבנציונלי, ניתן לזהות קבוצת משנה של קולטני תאי CRF-R2 רק אם אנו מנתחים את הקולטן הידבקות points על הזכוכית הקדמית. כתוצאה מכך אנו מאבדים את כל מידע אחר הנגזר מZ-נערמו נתוני multispectral (איור 5).

כאשר תאי מטופלים עם CRF, הקולטנים התאיים מופחתים מאוד, כפי שמוצגים על ידי הירידה במרחק של כתמים מקרום הפלזמה. הם גם מחולקים מחדש ממקומות בעיקר סופיים למספר המקומות נפרדים (2B איור וסרט 2).

ההשפעה של CRF על חלוקת קרום קולט נמנעת על ידי טיפול מקדים באנטגוניסט CRF-R2 הספציפי, 30 antisavagine (AS-30) ואנו מוצאים כי הרחבות CRF-R2 לא משתנות (האיור 2C וסרט 3).

ההפצה הדיסטלי של כתמים, זממה ב 5 המרווחים המקודדים ספקטרום צבעי מיקרומטר, מנוצלת כדי להמחיש את המרחק מvoxels מקרום הגרעין. לא pretreatm טיפול ואנטגוניסטאף אוזן גרון (AS-30, 1 מיקרומטר, 30 דקות) לפני טיפול אגוניסט (CRF, 1 מיקרומטר, 30 דקות) לא הראה הבדל משמעותי (NS) בהתכווצות GPCR. טיפול בתאים עם אגוניסט (CRF, 1 מיקרומטר, 30 דקות) בהדרגה מפחית את מספר voxels-R2 המכיל CRF בהשוואה לכל טיפול, 0-5 מיקרומטר (NS), 6-15 מיקרומטר (** p < 0.01) ו> 15 מיקרומטר (*** p <0.005), או בהשוואה לכמות ש- 30 לטיפול, 0-10 מיקרומטר (NS), 11-15 מיקרומטר (** p <0.01) ו> 15 מיקרומטר (*** p <0.005) (איור 4).

figure-protocol-1
איור 1. תרשים של טכניקות הזמינות הנוכחיות והגבלתם לנתח תמונות פלואורסצנציה. לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.

figure-protocol-2
(1 IgG) נוגדנים מצומדות אלקסה משניים; DAPI שמש כדי להמחיש את הגרעינים. התמונות שנרכשו עם ליזר confocal מיקרוסקופ סריקה (CLS). 5 מיקרומטר סרגל קנה מידה.

figure-protocol-3
איור 3. מודל 3D של HEK293 תאי transfected עם HA-CRF-R2 שחזר מתמונות CLS באמצעות תוכנת Imaris. עיבוד פני שטח של הגרעין ויצירת כתמים מתאר רחבות GPCR הומרו לשלפוחית ​​קטנה. נתוני הקרינה עובדו ראשון באמצעות Imaris המאפשר הדמיה והפילוח של נתונים להגדיר מיקרוסקופיה 3D. ואז, Imaris XT נוצל לImaris ממשק עם MATLAB. עוצמות voxel הוחלפו לתוךנקודת המרכזת. כתמי צבע קשת מקודד (0-5 מיקרומטר הכחול, ירוק, 6-10 מיקרומטר, מיקרומטר 11-15 צהוב והאדום> 15 מיקרומטר) מייצגים את צורת מרחק קרום הגרעין. הסולם של 5 מיקרומטר.

figure-protocol-4
האיור 4. ייצוג גרפי של ההפצה הדיסטלי של כתמים זמם בספקטרום הצבעים המקודדים ב 5 מרווחי מיקרומטר מנוצל כדי להמחיש את המרחק מvoxels מקרום הגרעין. אין טיפול וטיפול מקדים ביריב (AS-30, 1 מיקרומטר, 30 דקות) לפני טיפול אגוניסט (CRF, 1 מיקרומטר, 30 דקות) לא הראה הבדל משמעותי (NS) בהתכווצות GPCR. טיפול בתאים עם אגוניסט (CRF, 1 מיקרומטר, 30 דקות) מפחית בהדרגה את המרחק של מספר voxels-R2 המכיל CRF בהשוואה לשום טיפול 0-5 מיקרומטר (NS), 6-15 מיקרומטר (עמ ** <0.01) ו> 15 מיקרומטר (*** p <0.005); או 0-10 מיקרומטר הטיפול AS-30 (NS), 11-15 מיקרומטר (** p <0.01) ו> 15 מיקרומטר (*** p <0.005).

figure-protocol-5
איור 5. הגבלת ניתוח מורפומטריות 2D של 293 תאי transfected HEK עם HA-CRF-R2. סעיף מטוס האמצע של תאים (3-4μm מעל זכוכית coverslip) מראה את מרכז הגרעינים דמיין בDAPI וHA-CRF-R2 חקר באמצעות אנטי HA ו דמיין באמצעות Alexa 488nm מצומדת אנטי עכבר (1 IgG) משני נוגדנים ורכש עם CLS מראים שום הבדל בין () ללא טיפול (NT) ו (ב) אגוניסט (CRF, 1 מיקרומטר, 30 דקות), ואילו את נקודתי ההדבקה הקולטן הן שונות באופן דרמטי.

סרט 1. הסתובב בחופשיות, מודל 3D במצב "לעלות" לHEK 293 תאי transfected עם HA-CRF-R2, ללא טיפול, כדי להעריך את ההבדלים בין פנוטיפ סלולריים חלבוני הקולטן. סרגל קנה מידה 5-20 מיקרומטר."Target =" / files/ftp_upload/4233/4233movie1.avi _blank "> לחץ כאן לצפייה בסרט.

סרט 2. הסתובב בחופשיות, מודל 3D במצב "לעלות" לHEK 293 תאי transfected עם HA-CRF-R2, טיפול אגוניסט, CRF (CRF, 1 מיקרומטר, 30 דקות) כדי להעריך הבדלי פנוטיפ סלולריים בין חלבוני הקולטן. סרגל קנה מידה 5-20 מיקרומטר. לחץ כאן לצפייה בסרט.

סרט 3. הסתובב בחופשיות במצב 3D "לעלות" לHEK 293 תאי transfected עם HA-CRF-R2, טיפול מקדים ביריב (AS-30, 1 מיקרומטר, 30 דקות) לפני טיפול אגוניסט (CRF, 1 מיקרומטר, 30 דקות ') כדי להעריך הבדלי פנוטיפ סלולריים בקרב חלבוני הקולטן. סרגל קנה מידה 5-20 מיקרומטר. לחץ כאן לצפייה בסרט.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנחנו הראינו כי טיפול CRF מושרה שינוי משמעותי במורפולוגיה ומיקום של CRF-R2. השינוי בCRF-R2 נבלם על ידי טיפול אנטגוניסט סלקטיבי. אנחנו הראינו כי שינויי הקולטן הם לא אותרו ולא ניתן למדוד באמצעות טכניקות multispectral 2D הסטנדרטיות. היכולת ללמוד תמונות 3D מורכבות היא קריטית כדי לשלב את המורכבות של פרמטרים ביולוגיים לצורך ניתוח מורפומטריות. היינו מסוגלים לבצע מדידות 3D של תאים ללא צורה מוגדרת מראש עם רכיבי רשת קרינה הבלתי עקביים. החבילה של שיטות המשתמש modifiable האוטומטי שלנו מאפשרת ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים הביולוגית הדמית מרכז הפיתוח (BIDC) מאוניברסיטת קליפורניה, סן פרנסיסקו לשימוש בImaris, Imaris XT ו Matlab. אנו מודים V. Kharazia לסיוע הטכני ועל הנרי, LK פלורן, L. ךייטש על תרומתם לעריכה של כתב היד. עבודה זו נתמכה על ידי מימון ממדינת קליפורניה מחקר רפואי על אלכוהול התעללות וסמים דרך קליפורניה בסן פרנסיסקו לSEB, המכונים הלאומיים לבריאות: 1R21DA029966-01 ופרס NIH מסלול המהיר להקרין את אוסף MLSMR לSEB, קליפורניה בסן פרנסיסקו בית הספר לרוקחות ( משרד הדיקן ורוקחות קליניות) ובית הספר לרפואה (פרמקולוגיה קלינית & Therapeutics ניסיוני) לCLHK.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
שם המגיב חברה מספר קטלוגים תגובות (אופציונלי)
הכליה עוברית אנושית (HEK293) אוסף תרבות סוג אמריקאי CRL-1573
של Dulbecco שינוי הנשר הבינוני (DMEM) Invitrogen 11965118
עוברי בסרום שור (FBS) Invitrogen SH30070.03
AlexaFluor-488 (IgG2b) Invitrogen -11001
חד שבטי אנטי HA.11 (1 IgG) Covance 16B12
DAPI מעבדות וקטור H-1200 ;
CRF סיגמא C2917
Antisauvagine-30 (AS-30) סיגמא A4727

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. West, M. J. Design-based stereological methods for counting neurons. Prog, Brain Res. 135, 43-51 (2002).
  2. Burke, M., Zangenehpour, S., Mouton, P. R., Ptito, M. Knowing what counts: unbiased stereology in the non-human primate brain. J. Vis. Exp. (27), e1262(2009).
  3. Sugawara, Y., Ando, R., Kamioka, H., Ishihara, Y., Honjo, T., Kawanabe, N., Kurosaka, H., Takano-Yamamoto, T., Yamashiro, T. The three-dimensional morphometry and cell-cell communication of the osteocyte network in chick and mouse embryonic calvaria. Calcif. Tissue Int. 88, 416-424 (2011).
  4. Vickery, R. G., von Zastrow, M. Distinct dynamin-dependent and -independent mechanisms target structurally homologous dopamine receptors to different endocytic membranes. J. Cell Biol. 144, 31-43 (1999).
  5. Bartlett, S. E., Enquist, J., Hopf, F. W., Lee, J. H., Gladher, F., Kharazia, V., Waldhoer, M., Mailliard, W. S., Armstrong, R., Bonci, A. Dopamine responsiveness is regulated by targeted sorting of D2 receptors. Pro.c Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 11521-11526 (2005).
  6. Gordon, A., Colman-Lerner, A., Chin, T. E., Benjamin, K. R., Yu, R. C., Brent, R. Single-cell quantification of molecules and rates using open-source microscope-based cytometry. Nat. Methods. 4, 175-181 (2007).
  7. Schock, F., Perrimon, N. Molecular mechanisms of epithelial morphogenesis. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 18, 463-493 (2002).
  8. Pincus, Z., Theriot, J. A. Comparison of quantitative methods for cell-shape analysis. J. Microsc. 227, 140-156 (2007).
  9. Spiller, D. G., Wood, C. D., Rand, D. A., White, M. R. Measurement of single-cell dynamics. Nature. 465, 736-745 (2010).
  10. Loo, L. H., Wu, L. F., Altschuler, S. J. Image-based multivariate profiling of drug responses from single cells. Nat Methods. 4, 445-453 (2007).
  11. Yarrow, J. C., Totsukawa, G., Charras, G. T., Mitchison, T. J. Screening for cell migration inhibitors via automated microscopy reveals a Rho-kinase inhibitor. Chem. Biol. 12, 385-395 (2005).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

3D Fluorescence ImagingCellular Morphology AnalysisConfocal MicroscopyImaris SoftwareMATLAB IntegrationGPCR Receptor TrackingAutomated Morphometric QuantificationReceptor Trafficking AnalysisDrug Discovery AssayFluorescence Image Segmentation

Related Articles