הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

Profiling glycan של פולימרי דופן תא צמח באמצעות מערכים

14.2K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/4238

⸱

17 בדצמבר 2012

 ,  ,  ,  ,  , 
1Australian Centre of Excellence in Plant Cell Walls, School of Botany, University of Melbourne, 2Plant Cell Biology Research Centre, School of Botany, University of Melbourne, 3CSIRO Plant Industry, Black Mountain Laboratories, 4Department of Plant Biology and Biotechnology, University of Copenhagen

במאמר זה

סיכום

טכניקה הנקראת C Omprehensive M Icroarray P Profiling olymer (CoMPP) לאפיון של glycans דופן תא הצמח מתואר. שיטה זו משלבת את הספציפיות של נוגדנים חד שבטיים המופנים לאפיטופים glycan מוגדרות עם פלטפורמה אנליטית microarray מיניאטורי המאפשרת הקרנה של מופע glycan במגוון רחב של הקשרים ביולוגיים.

תקציר

קירות תא צמח הם מטריצות מורכבות של glycans הטרוגניות אשר משחק תפקיד חשוב בפיסיולוגיה וההתפתחות של צמחים ולספק את חומרי הגלם לחברות אנושיות (למשל תעשיות עץ, נייר, טקסטיל ודלק ביולוגיים) 1,2. עם זאת, הבנת יוסינתזה והתפקוד של רכיבים אלה נותר מאתגרים.

glycans דופן תא מבחינה כימי וconformationally בשל המורכבות של אובניים הבניין שלהם, את שאריות glycosyl מגוון. קשרים אלה טופס בתפקידים מרובים ושונים במבנה טבעת, תצורת isomeric או anomeric, ובנוסף, הם מחליפים עם מערך של שאריות שאינן סוכר. הרכב glycan משתנה בתא אחר ו / או סוגי רקמות או אפילו תת דומיין של תא בודד חומה 3. יתר על כן, ההרכב שלהם גם לשינוי ב1 פיתוח, או בתגובה לאותות סביבתיים 4.

ב לשעברCess של 2,000 גנים יש קירות תא צמח הם מטריצות מורכבות של glycans הטרוגניות נחזה להיות מעורבים בביוסינתזה תא קיר glycan ושינוי ב5 ארבידופסיס. עם זאת, מעטים יחסית של גני biosynthetic התאפיינו תפקודי 4,5. גישות גנטיקה הפוכות הן קשות כי את הגנים לעתים קרובות לידי ביטוי באופן דיפרנציאלי, לעתים קרובות ברמות נמוכות, בין סוגי תאים 6. כמו כן, מחקרי מוטציה לעתים קרובות הפריעו יתירות גן או מנגנוני פיצוי על מנת להבטיח תפקוד דופן תא מתאים נשמר 7. לכן יש צורך בגישות חדשות במהירות כדי לאפיין מגוון הרחב של מבני glycan וכדי להקל על גישות גנומיקה תפקודיות לביוסינתזה הבנת תא קיר ושינוי.

נוגדנים חד שבטי (בז) 8,9 צמחו ככלי חשוב לקביעת מבנה והפצת glycan בצמחים. אלה מכירים distאפיטופים נוכחיים בתוך סוגים עיקריים של glycans דופן תא צמח, כולל pectins, xyloglucans, xylans, mannans, glucans וarabinogalactans inct. לאחרונה השימוש שלהם הוארך לניסויי הקרנה בקנה מידה גדול כדי לקבוע את השפע היחסי של glycans במגוון רחב של צמחים וסוגי רקמות זמנית 9,10,11.

כאן אנו מציגים שיטת microarray מבוססת glycan הקרנה נקראת Profiling המקיף microarray הפולימר (CoMPP) (איורים 1 ו -2) 10,11 המאפשרת דגימות מרובות (100 שניות) שיוקר באמצעות פלטפורמת microarray מוקטנת עם ריאגנט המופחת וכרכי מדגם. אותות הנקודה על microarray ניתן לכמת באופן רשמי לתת נתוני כמותיות על התרחשות epitope glycan. גישה זו מתאימה גם למעקב אחר שינויים במערכות מורכבות glycan ביולוגיות 12 ומתן סקירה כללית של הרכב דופן תא במיוחד כאשר לפני הידע of זו אינה זמינה.

פרוטוקול

1. אוסף רקמות והכנה

  1. איסוף משקל 100 מ"ג טריים של רקמות צמח (מינימום של 10 מ"ג משקל יבש) לפחות בשלושה עותקים לכל רקמות של עניין. השלבים הבאים מתארים את ההכנה של חומר דופן תא מרקמות צמח. במקרה של רקמות אחסון, עמילן בלתי רצוי יוסר enzymatically לפני שימשיך בהפקת פולימרי דופן תא כפי שתואר קודם לכן 13.
  2. הומוגני הדגימות לאבקה דקה עם חנקן נוזלי באמצעות Qiagen TissueLyser שני, עם 24 סטי מתאם צינור ו 3 חרוזי טונגסטן קרביד מ"מ (30 הרץ, 2 x 30 שניות). לחלופין, אם רק כמה דוגמאות שנמצאות בעיבוד, מכתש ועלי משמשים.
  3. העבר את homogenates לתוך צינורות חרוטים 10 מיליליטר פלסטיק.
  4. להכין חומרי דופן תא על ידי השטיפה בhomogenates מ"ל 80% אתנול 10 V / v בRT וvortexing נמרצות עבור 2 דקות.
  5. צנטריפוגה דגימות ב3500 XG ולהשליך supernatant. חזור על אתנול 70% שוטף לפחות שלוש פעמים או עד supernatant הוא ברור, במיוחד לרקמות המכילות כלורופיל.
  6. לבצע שטיפה סופית עם אצטון 100% ולהשאיר את הכדורים המכילים שאריות אלכוהול מסיסות (אוויר) לייבוש אוויר הלילה.
  7. מסננת דגימות האוויר עם 2 רשת 0.4 מ"מ להשיג אבקה דקה, אחידה ולהסיר גדולים יותר, גרוע חלקיקי קרקע שמתישהו יישארו בhomogenate.
  8. שוקל מדגם AIR 10 מ"ג לmicrotubes, כל אחת מכיל 3 מ"מ חרוז זכוכית כדי לסייע לערבוב של דגימות.

2. הפקת glycans דופן התא

  1. Pectins, ופולימרים הקשורים pectins נשלפים מהדגימות על ידי הוספת 500 μl של 50 מיקרומטר CDTA (pH 7.5) לכל דגימה.
  2. בקצרה מערבולת את הצינורות כדי להבטיח הממס הוא במגע עם החומר מדגם ואז לערבב באמצעות TissueLyser עבור 3 שעות ברץ 8.
  3. צנטריפוגה דגימות ב12000 XG, זהירות rסר את supernatants ולאחסן ב 4 ° C.
  4. שטוף את הכדורים ב1 מ"ל של מים מיוננים כדי לדלל ולהסיר כל מערבולת שנותרה ממס וצנטריפוגה ב13000 x גרם. חזור על שלב זה מבלי להפריע הגלולה ולהסיר את כל הנוזל מהצינורות לפני שתמשיך לשלב הבא.
  5. glycans cross-linking מופקים ברצף מהתא שנותר קיר הגלולה עם 500 μl של NaOH 4M עם 0.1% w / v NaBH4, תוך שימוש באותו ההליך מתואר בצעדים 2.1-2.4 לחילוץ CDTA. NaBH 4 נוסף כדי לצמצם את קבוצת אלדהיד (או keto) בסוף הצמצום של הסוכרים לאלכוהול ובכך למנוע בסיס קילוף של סוכרים.
  6. לאחר צנטריפוגה, supernatants יוסר שוב, מאוחסן ב 4 ° C, ושטפו את הכדורים פעמים במים מיוננים לפני שימשיך לחילוץ הבא.
  7. כצעד אופציונלי, פולימרים השיורי, כגון תאי מופקים עם 500 cadoxen μl (31% v / v 1,2-diaminoethane עם 0.78 מ CDO) באותו האופן כפי שמתואר בצעדים 2.1-2.4. לחלופין, תוכן תאית מוחלט בכדורים נותרים ניתן לקבוע באמצעות מבחנים אצטית / חנקן (ראה דיון).

3. Microarrays הדפסה

  1. supernatants צנטריפוגות מכילים פולימרי חילוץ דופן תא ב13000 XG כדי להסיר כל חומר חלקיקים.
  2. טען 50 μl של כל דגימה לפוליפרופילן 384 גם צלחת microtiter באמצעות פריסה מותאמת אישית מראש תוכנן שבו דגימות מסודרות לפי סוג רקמה וסוג חילוץ.
  3. דלל את מדגם תא קיר הפולימר ב0, 5 ו 25 × סדרת דילול סדרתי עם מי deionized.
  4. פרמטרים כגון גובה סיכה, אוסף ולהתעכב זמן, וצעדי כביסה נקבעים על תוכנת שליטה microarrayer.
  5. הלחות של חדר ההדפסה נשלטת על 60% כדי למנוע אידוי מדגם.
  6. עבודת הדפסתו התחילה להשתמש LabNEXT Softwaמחדש ותכנית אשר תואמת את פריסת microarray.
  7. הרובוט משתמש בסיכות ערוץ נימים להדפיס פתרונות מצלחת המדגם גבי קרום 20 x 20 סנטימטרי ניטרוצלולוזה אשר מצורף לצלחת שטוחה במכונה. כל נקודה במערך מכילה 15 nl של פתרון והוא מודפס בשלושה עותקים.
  8. microarrays הזהה מודפסים לצד זה על הקרום וחתוך למערכים בודדים לאחר עבודת ההדפסה הסתיימה.
  9. בכל ניסוי את המערכים יכולים להיות שונים כדי להתאים פחות או יותר דגימות, דילולים או משכפל.

4. חיטוט של microarrays glycan

  1. לאחר הדפסה, לחסום את microarrays הבודד ב5% אבקת חלב רזה w / v מומסת בפוספט נאגרה מלוחה (Mpbs) בטמפרטורת חדר למשך 2 שעות כדי להפחית מחייב הלא ספציפי.
  2. microarrays בדיקה עם נוגדנים ספציפיים לתא קיר glycan אפיטופים עבור 2 שעות בMpbs חד שבטיים. רוב antib חד השבטיodies נגד glycans דופן התא זמין מסחרי משלוש חברות; Biosupplies (www.biosupplies.com.au), שירותי Carbosource (www.carbosource.net) וPlantProbes (www.plantprobes.net).
  3. כולל שליטה שלילית, microarray מודגרות עם Mpbs בלבד ואין נוגדנים עיקריים.
  4. שטוף את microarrays 3 פעמים בנאגרו מלוחות פוספט (PBS) למשך 5 דקות כדי להסיר מחייב הלא ספציפי.
  5. לחקור את microarrays עם נוגדן מצומד לperoxidase חזרת (HRP) בMpbs ל2 שעות משני. נוגדנים חד השבטיים ביותר נגד glycans דופן התא דורשים נוגדנים משניים אנטי עכבר או אנטי עכברוש.
  6. חזור על שלבי כביסת 3 פעמים עם PBS חיץ למשך 5 דקות כדי להסיר מחייב הלא ספציפי.
  7. לפתח את microarrays באמצעות chromogenic (3,3-Diaminobenzidine) או chemiluminecent (לומינול) מצעים.

5. קביעת כמות

  1. לאחר פיתוח, לסרוק את microarrays הבודד באמצעות רזולוציה גבוהה (1200 dpi) סורק שולחני ולשמור את התמונות כקבצים שליליים, 16-bit TIFF (איור 3).
  2. לחשב את העצמה בלתי נפרדת מכל מקום באמצעות Xplore תוכנת עיבוד תמונה (LabNEXT) המצוידת בכלי רשת אוטומטיות. עוצמת כתם בלתי נפרדת נגזרת מהסכום של פיקסלים באזור הרשת מסביב לכל מקום.
  3. את נתוני הרשת עבור כל microarray מיוצא כקובץ txt ויכולים ידניים ייובאו לתוך גיליון אלקטרוני Excel לצורך הניתוח. כלי מקוון (http://microarray.plantcell.unimelb.edu.au/) פותח כדי לתרגם באופן אוטומטי ולעבד נתונים מקבצי txt בודדים.
  4. עוצמת המקום אינטגרלית בממוצע על פני דפוס משכפל ודילולים כדי להשיג 'נקודת ממוצעערך העצמה "לכל דגימה (איור 2). לחלופין, אותות ספוט מתאימים רק לאחד הדילול ערך במערך משמשים לכמת את שפע epitope glycan היחסית לכל דגימה.
  5. עוצמות הספוט הממוצעות היחסיות בין מדגמים שונים מוצגות כheatmap (איור 4) שימוש בעיצוב מותנה בכלי heatmapper Excel או מקוונים (http://bar.utoronto.ca/welcome.htm). נתונים לכל אחד מסוגי נוגדנים הם תקן ל 100 ו5% ערך סף מוטל להסיר אות רקע ותוצאות חיוביות שגויות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

השפע היחסי של glycans בשישה סוגי רקמות (סיבי תועבה אחרות, אבקה, שחלות, עליי כותרת, עליי גביע וסטיגמה) מפרחי Nicotiana alata נקבע באמצעות CoMPP. האיור 3 א מציג microarray נציג שכבר גשש בJIM5 ספציפי מאב לאופן חלקי (נמוך) homogalacturonan methylesterified (ה"ג), אשר מתרחש בepitope סוכרים פקטיניים 14. JIM5 epitope הוא זוהה בתמציות CDTA של כל רקמות הפרחים זאת הוא גבוה ביותר באבקה והנמוכה ביותר ברקמה סטיגמטית (האיור 3A ו4A). מעניין, epitope JIM5...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

CoMPP היא שיטה מהירה ורגישה לאפיון הרכב glycan של מאה דגימות צמחיות בעניין של ימים. שיטה זו משלימה את הפלטפורמות הזמינות כבר חיידקים או יונקי glycan מערך לתפוקה גבוהה הקרנה של אינטראקציות פחמימות עם חלבוני glycan מחייב כגון קטינים, קולטנים, ונוגדנים 16. עם מגוון גדול של בדיקות זמינות לאיתור glycans דופן תא, ניתן לקבל מידע מפורט על אפיטופים glycan שייכים לכל המחלקות העיקריות של סוכרים בתאי צמח קיר 8,9. אולם אלה מקיפים רק חלק קטן ממבני glycan שזוהו 8,9,

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

תודות

IEM הייתי רוצה להכיר המועצה למחקר הדנית (FTP ו FNU) למימון. ERL מכיר בתמיכה של ARC DP מענק. א.ב. מכיר בתמיכה של מרכז ARC ההצטיינות במענק קירות תא צמח.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
שם המגיב חברה מספר קטלוגים תגובות (אופציונלי)
3 חרוזי טונגסטן קרביד מ"מ Qiagen 69997
microtubes אוסף (1.2 מ"מ) Qiagen 19560 1.5 צינורות מיליליטר microfuge יכולים לשמש גם
Qiagen TissueLyser השני Qiagen 85300
3 חרוזי זכוכית מ"מ סיגמה אולדריץ Z143928
CDTA סיגמה אולדריץ 34588
קדמיום אוקסיד סיגמה אולדריץ 202894
1,2-diaminoethane סיגמה אולדריץ 03550
קרום ניטרוצלולוזה (0.22 גודל נקבובי מיקרומטר) מים-GE ותהליך טכנולוגיות EP2HY00010 קרומים בגודל נקבובי שונים מתאימים לסוגים שונים פינים
Xact השני microarrayer רובוט Labnext 001A Xact השני הרובוט מצויד בצלחת מותאמת אישית 20 x 20 סנטימטר קרמיקה שקרום ניטרוצלולוזה מצורף
Xtend סיכות microarray RM Labnext 0037-350 פינים חייבים להיות מתאימים להיווצרות כתם על קרומים
384 צלחות microtiter היטב (פוליפרופילן) גריינר 781207
נוגדנים חד שבטי נגד glycan בדיקות צמח /
CarboSource / Biosupplies 		אתרי אינטרנט; PlantProbes (www.plantprobes.net), (Carbosource"Target =" _blank ww.carbosource.net "> www.carbosource.net) וBiosupplies (www.biosupplies.com.au).
אנטי עכברוש IgG (כל מולקולה) - נוגדני peroxidase מיוצרים בעז. סיגמא A9037 הסוג של נוגדנים משניים תלוי בנוגדן העיקרי בשימוש (למשל העלה בחולדה, עכבר, וכו 'עז).
SIGMA FAST 3,3 טבליות '-Diaminobenzidine סיגמא D4293 הסוג של פיתוח ריאגנט תלוי בנוגדנים מהשניים שיושמו ושל שיטת זיהוי (colourmetric, או chemiluminecent).
תשתית chemiluminescent פיק מערב SuperSignal Thermoscientific 34080 ראה לעיל
Xplore תוכנת עיבוד תמונה LabNext 008 סוגים רבים תוכנה עם כלים אוטומטיים gridding זמיניםכדי למדוד את ערך פיקסל של כתמי microarray.
סוכרים צמחיים סיגמא / Megazyme
p>

מקורות

  1. Carpita, N. C., Gibeaut, D. M. Structural models of primary cell walls in flowering plants: consistency of molecular structure with the physical properties of the walls during growth. Plant J. 3, 1-30 (1993).
  2. Somerville, C. Biofuels. Curr. Biol. 17, 115-119 (2007).
  3. Willats, W. G., Orfila, C., Limberg, G., et al. Modulation of the degree and pattern of methyl-esterification of pectic homogalacturonan in plant cell walls. implications for pectin methyl esterase action, matrix properties, and cell adhesion. J. Biol. Chem. 276, 19404-19413 (2001).
  4. Doblin, M. S., Pettolino, F., Bacic, A. Plant cell walls: the skeleton of the plant world. Functional Plant Biology. 37, 357-381 (2010).
  5. Carpita, N., Tierney, M., Campbell, M. Molecular biology of the plant cell wall: searching for the genes that define structure, architecture and dynamics. Plant Molecular Biology. 47, 1-5 (2001).
  6. Sarria, R., Wagner, T. A., O'Neill, M. A., Faik, A., et al. Characterization of a family of Arabidopsis genes related to xyloglucan fucosyltransferase1. Plant Physiol. 127, 1595-1606 (2001).
  7. Somerville, C., Bauer, S., Brininstool, G. Toward a systems approach to understanding plant cell walls. Science. 306, 2206-2211 (2004).
  8. Willats, W. G. T., Knox, J. P. Molecules in context: probes for cell wall analysis. The Plant Cell Wall. Rose, J. K. C. , Blackwell. 92-110 (2003).
  9. Pattathil, S., Avci, U., Baldwin, D., et al. A Comprehensive Toolkit of Plant Cell Wall Glycan-Directed Monoclonal Antibodies. Plant Physiology. 153, 514-525 (2010).
  10. Moller, I. E., Sørensen, I., Bernal, A. J., et al. High-throughput mapping of cell-wall polymers within and between plants using novel microarrays. The Plant J. 50, 1118-1128 (2007).
  11. Sørensen, I., Willats, W. G. T. Screening and characterization of plant cell walls using carbohydrate microarrays. Methods Mol. Biol. 715, 115-121 (2011).
  12. Moller, I. E., Licht, D. eF. ine, Harholt, H. H., J,, et al. The dynamics of plant cell-wall polysaccharide decomposition in leaf-cutting ant fungus gardens. PLoS One. 6 (3), e17506(2011).
  13. Pettolino, F. A., Walsh, C., Fincher, G. B. Chemical procedures for the determination of polysaccharide composition of plant cell walls. Nature Protocols. , In Press (2012).
  14. Clausen, M. H., Willats, W. G. T., Knox, J. P. Synthetic methyl hexagalacturonate hapten inhibitors of anti-homogalacturonan monoclonal antibodies LM7, JIM5 and JIM7. Carbohydrate Res. 338, 1797-1800 (2003).
  15. Verhertbruggen, Y., Marcus, S. E., Haeger, A., et al. Developmental complexity of arabinan polysaccharides and their processing in plant cell walls. Plant J. 59, 413-425 (2009).
  16. Heimburg-Molinaro, J., Song, X., Smith, D. F. UNIT 12.10 Preparation and Analysis of Glycan Microarray. Current Protocols in Protein Science. , (2011).
  17. McCartney, L., Blake, A., Flint, J., et al. Differential recognition of plant cell walls by microbial xylan-specific carbohydrate-binding modules. PNAS. 103, 4765-4770 (2006).
  18. Caño-Delgado, A. I., Metzlaff, K., Bevan, M. W. The eli1 mutation reveals a link between cell expansion and secondary cell wall formation in Arabidopsis thaliana. Development. 127, 3395-3405 (2000).
  19. Manabe, Y., Nafisi, M., Verhertbruggen, Y., et al. Loss-of-Function Mutation of REDUCED WALL ACETYLATION2 in Arabidopsis Leads to Reduced Cell Wall Acetylation and Increased Resistance to Botrytis cinerea. Plant Physiology. 155, 1068-1078 (2011).
  20. Updegraff, D. Semimicro determination of cellulose in biological materials. Anal. Biochem. 32, 420-424 (1969).
  21. 21Moller, I., Marcus, S. E., Haeger, A., et al. High-throughput screening of monoclonal antibodies against plant cell wall glycans by hierarchial clustering of their carbohydrate microarray binding profiles. Glycoconjugate Journal. 25, 37-48 (2007).
  22. Sørensen, I., Pettolino, F. A., Wilson, S. M., et al. Mixed linkage (1→3),(1→4)-β-D-glucan is not unique to the Poales and is an abundant component of Equisetum arvense cell walls. Plant J. 54 (13), 510-521 (2008).
  23. Domozych, D. S., Sørensen, I., Willats, W. G. T. The distribution of cell wall polymers during antheridium development and spermatogenesis in the Charophycean green alga, Chara. 2104, 1045-1056 (2009).
  24. Singh, B., Avci, U., Eichler Inwood, S. E. A specialized outer layer of the primary cell wall joins elongating cotton fibers into tissue-like bundles. Plant Physiol. 150, 684-699 (2009).
  25. Øbro, J., Sørensen, I., Derkx, P., et al. High-throughput screening of Erwinia chrysanthemi pectin methylesterase variants using carbohydrate microarrays. Proteomics. 9, 1861-1868 (2009).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

MicroarrayCDTA
Profiling glycan של פולימרי דופן תא צמח באמצעות מערכים
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.