Assay Explant להערכת התנהגות ניידת של mesenchyme הגולגולת

סיכום

Mesenchyme הגולגולת עובר תנועות morphogenic דרמטיות שעשויים מספקת כוח מניע לגובה של הקפלים העצביים ^1,2. כאן אנו מתארים פשוטים Vivo לשעבר Explant assay לאפיין את ההתנהגויות הסלולר של mesenchyme הגולגולת במהלך neurulation. בדיקה זו יש יישומים רבים, בין היותך נוח למניפולציות תרופתיות וניתוחי הדמיה חיות.

תקציר

מערכת העצבים המרכזית נובעת מהצלחת העצבית שעוברת סדרה של תנועות המוךפו"גנטי המורכבות וכתוצאה מכך ההיווצרות של הצינור העצבי בתהליך המכונה neurulation. במהלך neurulation, המורפוגנזה של mesenchyme שעומד בבסיס הצלחת העצבית האמינה לנהוג גובה קיפול עצבי. Mesenchyme הגולגולת מורכב ממזודרם הפרקסיאלית ותאי רכס עצביים. התאים של צורת גולגולת mesenchyme meshwork pourous המורכב מתאי stellate ומתערב בצורת גדילים תאיים מטריקס (ECM) התומכים הקפלים העצביים. במהלך neurulation, mesenchyme הגולגולת עובר שחלופים סטריאוטיפיים וכתוצאה מההתרחבות שלה ותנועות אלה הם האמינו כדי לספק כוח מניע לגובה קיפול עצבי. עם זאת, בשבילים ובהתנהגויות המניעות סלולריות המורפוגנזה mesenchyme גולגולתי נותרים למדו בצורה גרועה. אינטראקציות בין ECM והתאים של thes בבסיס גולגולת mesenchymeהתנהגויות תא דואר. כאן אנו מתארים assay פשוט vivo לשעבר explant המציא כדי לאפיין את התנהגותם של תאים אלה. בדיקה זו היא amendable למניפולציות תרופתיות לנתח ניתוחי הדמיה חיות האותות המעורבים ולאפיין את התנהגותם של תאים אלה עוד יותר. אנו מציגים ניסוי נציג מדגים את התועלת של בדיקה זו באפיון מאפייני הנדידה של mesenchyme גולגולתי במגוון של רכיבי ECM.

מבוא

סגירת צינור עצבית באזור הגולגולת מתרחשת בין 8.5 עובריים היום (E8.5) ו -9.5 בעבר העכבר. כישלון לסגור כראוי הצינור העצבי בתוצאות הראש בanencephaly, מום מלידה מבנית נפוץ בבני אדם ואינו מתיישב עם חיים. הכוחות המניעים את סגירת צינור עצבית cephalic נוצרים משתי רקמות העצביות עצמו וסביבתו והאפידרמיס mesenchyme ^3. בהרחבה מסוימת של mesenchyme הגולגולת נחשב לחיוני לגובה של ^1,2 הקפלים העצבי קרניאלי. Mesenchyme גולגולתי הוא עשיר בחלבוני ECM בחלבונים מסוימים, כגון glycosylated proteoglycans ההפרין סולפט, כונדרואיטין סולפטים ^ו4-8 hyaluronate.

שלא כמו בעובר העוף שבו תאי רכס עצביים להגר מצינור העצבי הגבה לאחר סגירת צינור עצבית, הרכס העצבי בעובר העכבר נודד באותו הזמן שהקפלים העצביים מתחילים rISE (אחרי שלב 5 somite). כך במהלך neurulation בעבר העכבר, mesenchyme הגולגולת מורכב מתאים שמקורם ברכס העצבי ומזודרם הפרקסיאלית. רכס עצבי ואוכלוסיות מזודרם הפרקסיאלית מושרים בזמנים שונים בהתפתחות; מקומי בתפקידים שונים בעובר להתפתח במבנים שונים ^9,10. מזודרם הפרקסיאלית מקורו התכונה הראשונית ונודד לאזור הקדמי של העובר שבבסיס כל הצלחת העצבית המשוערת. הרכס העצבי מושרה בצומת של הצלחת העצבית ואקטודרם אפידרמיס, עובר לאפיתל mesenchyme מעבר וdelaminates רק לקראת גובה קיפול עצבי בעובר המכרסם. תאי רכס עצביים נודדים לאורך שבילים סטריאוטיפיים במזודרם הפרקסיאלית subectodermal לקשת branchial, frontonasal וmesenchyme periocular. מזודרם הפרקסיאלית יתרום לחלק מעצמותיו של קמרון הגולגולת ושרירים של פן, ואילו הדואר עצבי פסגה תתרום לעצמות אחרות של הגולגולת והפנים, בנוסף לעצבי גולגולת ^9-11. מזודרם הפרקסיאלית ושושלות רכס עצביות יכולים להיות מסומן באופן דיפרנציאלי, על ידי Mesp1-cre וקווי עכבר מהונדס Wnt1-cre, בהתאמה ^9.

התפקיד החיוני של mesenchyme הגולגולת בסגירת צינור עצבית כבר הסיק מניסויים שבו טיפול בעוברים עם מכרסמי ECM שיבוש סוכנים כגון hyaluronidase, chondroitinase ABC, heparitinase או Diazo-אוקסו-norleucine (דון) במהלך סגירת neurulation הלקויה העצבית צינור ^{7, 12-14.} בניסויים אלה, ניתוח היסטולוגית של קטעים סטטיים בעקבות neurulation חשף dysmorphogeneis קשורים של mesenchyme גולגולתי ^7,12-14. עם זאת, מאחר שסוכן טרטוגנים היה גישה לרקמות מרובות, עדיין לא נקבע אם mesenchyme הגולגולת הוא באמת רקמת המטרה. בתמיכה למסקנה שרקמה זוחיוני לneurulation, mesenchyme גולגולתי מופיע חריג על ניתוחים היסטולוגיים בכמה עכברים עם מוטציות exencephaly ^15-17. ובכל זאת, ברוב המקרים, ההשפעה של המוטציה על ההתנהגות התאית של mesenchyme גולגולתי לא טופלה.

אנחנו פתחנו assay explant vivo לשעבר ישירות לבחון את התוצאה של מוטציה גנטית או מניפולציה תרופתית על התנהגותם של תאי mesenchyme גולגולת ^15. בדיקה זו דומה לזו שפורסמה על ידי צחור et al 2003 לגשת פוטנציאל ההתמיינות של mesenchyme הגולגולת שנמצאה בבסיס את rhombomeres ¹⁸ מלבד ששונינו נתיחת explant כדי ללמוד את מאפייני הנדידה של אוכלוסיות קדמיות יותר של mesenchyme גולגולתי שבבסיס העצבי קדמי צלחת. השיטה שלנו היא גם שינוי של מבחני explant מבוצע בעובר העוף כדי לנתח את התנהגות הנדידה של הרכס העצבי עם keהבדלי y. הכנות קודמות explanted רכס העצבי או מזודרם הפרקסיאלית האחורי יותר ^19,20. כמו כן, במהלך גובה קיפול עצבי בעובר העוף, הפסגה העצבית עדיין לא הגרה מצינור העצבי הגבה ובכך explants נלקח ממזודרם הפרקסיאלית הקדמי לא מכיל תאי רכס עצביים. בבדיקה שלנו, explants mesenchyme גולגולת מורכבת ממזודרם הפרקסיאלית, רכס עצבי ואקטודרם משטח מוכן ומצופה על מצע. מניפולציה ניסויית כולל בידוד של מוטציות גנטיות explants מ, ציפוי explants על ECM השונה או טיפולים תרופתיים יכולה להתבצע. תאים נודדים מexplant והמרחק, מספר וההתנהגות יכולים להיות מנותחים והשוואה בין קבוצות טיפול. בנוסף, הכנה זו היא amendable לניתוחים של נדידה סלולרית על ידי שיטות הדמיה בשידור חייה. לאחר ניסוי ההגירה, explants יכול להיות קבוע ונתונים לניתוחי immunohistochemical לפרווהTher להבהיר את ההשפעה של טיפולים. באופן כללי, הפרוטוקול שהוצג כאן הוא assay vivo לשעבר פשוט כדי לחקור את ההתנהגות של mesenchyme גולגולתי. כניסוי מייצג, אנו מנצלים assay זה לבחון את ההגירה של mesenchyme גולגולת על מצעים תאיים שונים.

פרוטוקול

1. הכנת מאכלי ECM המצופים תרבות או Coverslips

1. הכן את פתרון מניית ECM ידי המסת מצע ECM ב PBS (של Dulbecco פוספט שנאגר מלוח, Invitrogen, # 14040-133). סנן באמצעות מזרק 0.2 מ"מ מסנן (VWR, # 28145-495) וקיפאון בaliquots ב-80 ° C.
2. לדלל פתרון מניית ECM ב PBS לריכוז רצוי. לMaxGel, לדלל בDMEM (שינוי הנשר הבינוני של Dulbecco, Invitrogen, # 11995-065).
3. אם יבוצע immunofluorescence, לעקר 12 coverslips זכוכית עגולה מ"מ (VWR, # 89015-724) על ידי הטבילה באתנול ולאפשר לייבוש באוויר. זה צריך להיעשות בברדס מינרית סטרילי. אם immunofluorescence לא יבוצע דלג לשלב 1.5.
4. מקום לעקר coverslips בכל אחד גם מצלחת גם 24 (קורנינג, # 3526).
5. הוסף 0.5 מ"ל של תמיסה מדוללת מצע לכל אחד גם מצלחת 24 היטב ולדגור בטמפרטורת חדר למשך 3 שעות.
6. לשאוב את פתרון ECM ולשטוף threזמני דואר בPBS.
7. לשאוב את PBS ולהשתמש באופן מיידי או עטוף בparafilm ומאוחסן ב 4 מעלות צלזיוס עד 2 שבועות.

2. הכנת כלים לנתיחה

צלחות Sylgard עם פחם הוסיף מוכנות לפרוטוקול של הייצור. הרקע השחור העמיד בלוחות אלה מספק תמיכה עבור מצמיד את העובר והצבע מציע ניגודיות טובה המאפשרת לדמיין את העובר השקוף.

1. כדי להכין צלחות שוקלים ישירות לתוך כוס שלוש לשפוך על חלק איזון 150 גרם נוזלי 15 גר 'חלק ב' וגרם אבקת פחם 1 (מכשירי Precision העולם, # SYLG184). מערבב יחד בעזרת מקל ארטיק מעץ או depressor לשון. יוצק לתוך כוס או 100 סנטימטר מנות פלסטיק. השתמש במבער גז קטן שנערך בערך 10 עד 12 סנטימטרים מעל את הכלים כדי לשרוף את כל בועות. מכסי מקום על צלחות ותנו לו לשבת לפחות 24 שעות כדי להגדיר.
2. כדי להכין את כלי נתיחה להוסיף Minutien סיכה (0.1 המ"מ diameter) לבעל סיכה (כלים מדעיים, יפים # # 26002-10 ו26018-17, בהתאמה) לחלופין 26 מחטי מד (BD, # 309597) הכפופות בזווית ישרה בעזרת מלקחיים עשוי לשמש כביתור מכשירים. דומונט # 5 מלקחיים חדדו סטודנטים (כלי מדע פיין, # 91150-20) באמצעות אבן השחזה (כלים מדעיים פיין, # 29008-22).
3. לעקר את כל כלי הנתיחה עם אתנול 70% לפני השימוש.

3. אוסף של עוברים

1. להרדים את עכבר ההריון תזמן בימי ההודעה coitum 8.5 בהתאם לתקנות ועדה לשימוש בבעלי חיים ולהסיר רחם.
2. רחם מקום בצלחת פטרי פלסטיק עם סטרילי PBS.
3. שטוף את הרחם פעם עם PBS סטרילית.
4. תחת מיקרוסקופ נתיחת עובר להסיר בזהירות מdeciduas באמצעות זוג המלקחיים.
5. הסרת קרומי extraembryonic ולשמור לgenotyping במידת הצורך.
6. שלב עובר על ידי ספירת somites. השלבים האידיאליים לעשות explants לנתח הסלולרי Behאביאור בגובה קיפול עצבי יהיה בין 6 ל 10 שלבי somite כאשר הקפלים העצביים רק מתחילים לרומם ולפני המורפוגנזה העיקרית של mesenchyme הגולגולת מתרחשת.
7. שטוף את העובר בPBS. מקום בצלחת sylgard שחורה עם DMEM המכיל לא אדום פנול (Invitrogen, # 21063-029). הסר את קרומי extraembryonic ולשמור לgenotyping במידת הצורך.

4. הכנת explants

1. מקד מחדש מיקרוסקופ בהגדלה הגבוהה ביותר האפשרית על אזור הראש של העובר.
2. לבצע חתכים עם מחט לנתיחה בכל יד. השתמש במחט אחת להחזיק את הרקמה במקום ואחר לקיצוצים.
3. חותך את הראש של העובר הקדמי לrhombomeres.
4. לחתוך לאורך קו האמצע לחוצה את הראש לשני חצי שווים.
5. חותך סביב לשולי הראש וקו האמצע. קיצוצים אלה יסירו את פסגת premigratory ואקטודרם פני שטח בגבול החיצוני וצלחת prechordal בקו האמצע. הרקמה הנותרת תהיה explant ותכיל פסגה נודדת גולגולת העצבית, מזודרם ואקטודרם הפרקסיאלית פני שטח.
6. כרקמה היא לחתוך, להסיר שאריות גזורות מהתבשיל באמצעות פיפטה פסטר סטרילי. זה מונע מבלבל explant עם הפסולת הגזורה.
7. לשטוף בעדינות explant ידי pipeting מעלה ומטה עם 20 פיפטה קצה μl וpipetman. זו תסיר תאים רופפים מצורפים ולמנוע קצוות משוננים על explants.
8. בזהירות להרים את כל explant בכ 10 μl של נוזל בעזרת 20 טיפ פיפטה μl וpipetman ומקום במרכז התרבות המצופית היטב.
9. הוסף 20 μl של תקשורת התרבות והשלמה עם 15% FBS לכסות explant.
10. צלחת מקום בתרבות רקמות חממת humidified (5% CO _2, 37 המעלות צלזיוס) במשך 1-2 שעות כדי לאפשר explant לצרף לתחתית הקערה. צפו תקופתי כדי לוודא שלא יתייבש explantהחוצה.
11. כאשר explant צרף, מוסיף בזהירות לכל גם 250 DMEM μl השלים עם FBS 10% שכבר חמם עד 37 מעלות צלזיוס בwaterbath. ברגע explants צרף הם לא יזוזו בעת הצלחת מתערערת בעדינות מתחת למיקרוסקופ.
12. להחזיר מנה לרקמות תרבות חממה.
13. לאחר 24 שעות, את explants יהיה מחובר היטב ותאים יתחילו להגר. בשלב זה סוכנים תרופתיים ניתן להוסיף לתקשורת.
14. 48 שעות לאחר ציפוי, תאים הגרו מexplants. המרחק הגר יכול להיות חזותי והדמיה. אנחנו בדרך כלל לעצור את התרבות בשלב זה מאז explants מתחיל להראות סימנים של כדאיות פחתה עם incubations הארוך יותר. יכול לשמש גם חיוני כתם כגון acridine כתום או כחול trypan כדי לבדוק את הכדאיות של explant.
15. בשלב זה ניתן לרכוש תמונות לתעד את המרחק ומספר התאים שנודדים מexplant. לחלופין, אם explants היה מצופה על coverslips,הם יכולים להיות קבועים וניתוחי immunohistochemical בצעו לדמיין חלבונים של עניין.

צעדים קריטיים בפרוטוקול

1. חותך explants של בערך באותו הגודל.
2. לנקות את כל פסולת הנתיחה מהצלחת לנתח כמו שאתה לנתח כדי להימנע מפסולת מבלבל עם רקמת explanted הרצויה.
3. כאשר explants ציפוי בבארות או בcoverslips מקפיד להציב טיפה של תקשורת עם explant במרכז היטב.
4. אפשר explant מספיק זמן כדי לצרף לפני ההצפה היטב עם תקשורת.
5. תנאי טיפול צריכים להיות אחידים לכל מצע מבחן ותרופתי בשימוש.
6. שני explants יכול להתבצע מכל עובר (אחד מימין ואחד מהימין של הצינור העצבי).
7. כשבדוק הגירה של תאים מקווי עכבר מוטציה תחת תנאי ניסוי שונים, לשים explant 1 מוטציה בקבוצת הביקורת והשנייה בקבוצה שטופלה.

פתרון בעיות

1. אם ייכשל explants לצרף, להגדיל את הזמן המוקצב לקובץ מצורף. מניסיוננו, כמחצית מexplants לא לצרף וexplants הגדול יותר לדבוק בצורה יעילה יותר.
2. אם explants לצרף לפריפריה של באר שזה יהיה קשה לתמונה. הקפד למקם explants במרכז הבאר.
3. באופן אידיאלי explants יהיה בערך באותו הגודל. עם זאת, הבדלים בגודל explant ניתן לתקן לשימוש בקוטר של explants כגורם תיקון כאשר quanitating נדידה של תאים מexplants.
4. אם זיהום מתרחש להיות בטוח תנאי עבודה סטריליים נמצאים בשימוש. כל הכלים ומשטחי עבודה צריכים להיות מעוקרים עם אתנול 70%. Pipets וצלחות פטרי צריך להיות חדשים וסטרילית.
5. אם explants מקבל אבד במהלך הנתיחה, מעת לעת להסיר פסולת כדי למנוע לאבד explant.
6. מאסטרינג הנתיחה היא גוזל זמן ודורשת תרגול. Optimal גדלה, כלים חדים נתיחה ועזרת מחטים.

תוצאות

המראה של תאים הנודדים מexplants mesenchyme גולגולת מוצג באיור 2. בדקנו הגירה על מצעי ECM שונים שנמצאים בmesenchyme הגולגולת במהלך neurulation כוללים פיברונקטין (100 מ"ג / מ"ל; סיגמא # F1141), laminin (100 מ"ג / מ"ל; סיגמא # L2020), MaxGel ECM (1:500 דילול בDMEM ; סיגמא # E0282) וחומצה היאלורונית (1 מ"ג / מ"ל; סיגמא, # 53747). תאים מצליחין להעביר מexplant כאשר אין ECM הוא הווה (נתונים לא מוצגים) ואת כל המצעים נבדקו הגירה נתמכת של התאים. גם צורתה, כמו גם את הגודל של תאים שנודדים מexplants תלויה במצע. זה צפוי כמו מחקרים קודמים מראים כי הכוחות המכאניים שנוצרו על ידי אינטראקציה של תאים עם ECM השונה להשפיע היא על הצורה ומאפייני נדידה של תאים ^21.

איור 1. הכנת explants. () להכין explants, E8.5 עוברים הם גזורים מdeciduas ורקמות extraembryonic. (ב) ראשי Embryo הם גזורים מקדמיים לגוף rhombomeres. Explants מוכן על ידי הסרת רקמה מקו האמצע והשולים החיצוניים של הראש להסיר את צלחת prechordal בקו האמצע והרכס העצבי premigratory ואקטודרם פני שטח בגבול, בהתאמה. (ג) explants מוכן על ידי גזירה מרקמות מקצות קו האמצע וחיצוניים של הראש להסיר את צלחת prechordal בקו האמצע ופסגת premigratory העצבית ואקטודרם משטח בגבולות. (ד) explants ממוקם בנפח קטן של מדיה במנות / coverslips מצופות ECM ואפשר לצרף לפני התוספת של מדיה נוספת.

איור 2. Explants ההגירה של תאי mesenchyme גולגולת מexplants מצופה על מצעים שונים. היה מצופה על פיברונקטין, laminin, MaxGel ECM או חומצה היאלורונית וצלם אחרי 48 שעות בתרבות. בר גודל = 200 מ"מ.

דיון

השיטה מיושמת כאן מספקת assay חזק כדי לבחון את התנהגותם של תאי mesenchyme גולגולת. בנוסף לניתוחים סטטיים שהוצגו כאן, לחיות ניסויי הדמיה בשדה בהיר או בשילוב עם ביטוי של חלבוני ה-GFP שכותרתו, יכול להיות מועסק על מנת לבחון את התנהגותם של תאים בזמן אמת כפי שהם נודדים מexplant. לניסויי הדמיה חיים, explants יכול להיות מתויג עם DiI או להבדיל הגירה של רכס עצבי ממזודרם הפרקסיאלית, רוזה-YFP; Mesp1-cre או Rosa-YFP; Wnt1-cre או קווים הטרנסגניים אחרים יכול לשמש. אינטראקציות גולגולת mesenchyme-ECM גם ניתן לבחון ניצול assay explant זה. כאן אנו explants צלחת על מצעי ECM שונים שנמצאים בmesenchyme גולגולתי להראות כי תאים נודדים על אלה בדרגות שונות ושECM משפיע על המורפולוגיה של התאים. יתר על כן, explants יכול להיות מוטבע במטריצה ​​תלת ממדים כדי לגשת להתנהגויות של cells בהקשר זה. assay explant זה amendable לניתוח של ההשפעה של מניפולציות גנטיות ותרופתיות על התנהגויות mesenchyme גולגולת לניתוח אותות פנימיים וחיצוניים שיכול לווסת ולשנות הגירה. לדוגמה, אנו מנוצלים assay זה במחקרים שלנו להבחין בתפקיד של Hsp90 הפרשה עודפת בהתנהגויות החריגות בסלולריות mesenchyme גולגולתי מוטצית Hectd1 ^15. בניסויים אלה, התייחסו explants עם נוגדן אנטי Hsp90, Hsp90 חלבון, geldanamycin וDMA (amelioride דימתיל) כדי לחסום את ההפרשה של Hsp90 להוכיח כי ההתנהגות החריגה של תאים מוטנטים Hectd1 נובעת Hsp90 ¹⁵ תאיים עודפים. גישות דומות יכולות לשמש פרמקולוגית לנתח מסלולים נוספים העומדים בבסיס המורפוגנזה נורמלית או לא נורמלית של mesenchyme גולגולתי. לאחר הבדיקה תושלם, explants ותאים נודדים יכולים להיות מנותח על ידי שורה של שיטות. לדוגמה, ג ניתוחים immunohistochemicalלהיות מועסק על מנת לבחון את הלוקליזציה של חלבונים חשובים לתנועות תא. ניתוחי transcriptome גם יכולים להיות מועסקים על מנת לקבוע כיצד ישפיע טיפול על ביטוי גנים.

מגבלה משמעותית אחד של טכניקה זו היא שזה לא התנהגויות מודל בשלושה ממדים כפי שהם מתרחשים בגוף חי. השינוי של הפרוטוקול בי explants מוטבע במטריצה ​​תלת ממדים (למשל matrigel), יחד עם ביטוי של תאים סלולריים חלבון מסומן ניאון יכול להיות מועסק הכרחי כדי לטפל בבעיה זו. גם אם שינויים אלה בוצעו, ניסויים נוספים כדי לקשר בין התנהגויות שנראו בassay זה vivo לשעבר עם אלה in vivo יהיו צורך בכך. מגבלות אחרות כוללות מספר הגדול של עוברים הנדרשים כדי לייצר כמות מספקת כדי להפיק נתונים סטטי משמעותיים. והכי חשוב, הנתיחה היא פשוטה יחסית, זה דורש תרגול כדי לשלוט.