מאמר שיטה

גילוי חיידקים וזיהוי באמצעות חיישנים אלקטרוכימיים

DOI:

10.3791/4282

⸱

23 באפריל 2013

 ,  ,  , 
1Research Service, Veterans Affairs Greater Los Angeles Healthcare System, 2Department of Urology, The David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles , 3GeneFluidics, 4Division of Infectious Diseases, Veterans Affairs Greater Los Angeles Healthcare System, 5Department of Microbiology, Immunology & Molecular Genetics, University of California, Los Angeles

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מתארים שיטת assay חיישן אלקטרוכימי לגילוי חיידקים מהיר והזדהות. Assay כרוך מערך חיישנים פונקציונליות עם בדיקות ללכוד oligonucleotide DNA ל( rRNA) רצפי מינים ספציפיים ריבוזומלי RNA. הכלאה כריך של rRNA היעד עם הבדיקה ללכוד ובדיקת גלאי דנ"א oligonucleotide peroxidase צמודת חזרת מייצרת נוכחית amperometric למדידה.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

חיישנים אלקטרוכימיים נמצאים בשימוש נרחב למדידה מהירה ומדויקת של רמת סוכר בדם, ויכולים להיות מותאם לזיהוי של מגוון רחב של analytes. חיישנים אלקטרוכימיים לפעול על ידי transducing אירוע הוקרה ביולוגי לאות חשמלי שימושי. התמרה אות מתרחשת על ידי צימוד הפעילות של אנזים חיזור לאלקטרודה amperometric. הספציפיות חיישן היא גם מאפיין מהותי של האנזים, גלוקוז אוקסידאז במקרה של חיישן גלוקוז, או תוצר של קשר בין האנזים ונוגדן או הבדיקה.

כאן, אנו מתארים שיטת assay חיישן אלקטרוכימי כדי לזהות באופן ישיר ולזהות חיידקים. בכל מקרה, הבדיקות שתוארו כאן הן oligonucleotides DNA. שיטה זו מבוססת על הכלאה כריך של בדיקות ללכוד וגלאי עם היעד RNA ריבוזומלי (rRNA). הבדיקה ללכוד מעוגנת למשטח החיישן, ואילו הבדיקה הגלאי קשורה לשעותperoxidase orseradish (HRP). כאשר מצע כגון 3,3 ", 5,5"-tetramethylbenzidine (TMB) הוא הוסיף לאלקטרודה עם מתחמים ללכוד יעד גלאים מאוגדים פני השטח שלו, המצע הוא חמצון על ידי HRP ומופחת על ידי אלקטרודה לעבוד. תוצאות מחזור חיזור זה בדילוגים של אלקטרונים על ידי המצע מהאלקטרודה לHRP, ייצור זרימת זרם באלקטרודה.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שימוש rRNA כמולקולת מטרה לאיתור וזיהוי חיידקים יש מספר היתרונות. השפע של rRNA בתאי חיידקים מספק לגבול רגישות נמוך כמו 250 חיידקים למ"ל, ללא צורך בהגברת 1 היעד. rRNA חיידקים מכיל רצפי מינים ספציפיים ייחודיים כי הם נגישים להכלאה עם בדיקות ה-DNA. כתוצאה מכך, מערך של חיישני אלקטרו יכול לשמש כדי לזהות חיידקים לא ידועים, שבו כל חיישן פונקציונלי עם בדיקה ללכוד מינים ספציפיים שונה. חיישני בקרה חיוביים צריכים להיכלל ליעד oligonucleotide סינטטי ש" גשרים "ללכוד ובדיקות גלאים ליצור אות כיול פנימית.

יש חיישנים אלקטרוכימיים מגוון רחב של יישומי מחקר בסיסיים ותרגומים. לדוגמה, assay מתואר כאן נעשה שימוש כדי למדוד את ההשפעה של א 'דווקא שלב צמיחת חיידק בRRNלהעתיק מספרים מראש rRNA ו, שהוא עניין רב לחוקרים המעוניינים בחיידקי פיזיולוגיה 2. הרגישות של assay חיישן אלקטרוכימי נקבעת על ידי יחס האות לרעש. מגוון רחב של שיטות והגברת אות להפחתת רעש נחקר. אנו מוצאים כי שיפור הכימיה של פני השטח החיישן הוא מפתח לצמצום כריכה ספציפי של בדיקה ו / או אנזים HRP גלאי. בפרט, monolayer מעורבת של alkanedithiols וmercaptohexanol כבר מצא להפחית את הרקע על ידי כיסוי פני האלקטרודה יותר לחלוטין תוך שמירה על הנגישות של הבדיקה ללכוד להכלאת היעד 3. טיפולי כימיה של פני שטח אלה חשובים במיוחד עבור מבחני הכוללים דגימות ביולוגיות מורכבות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Functionalization של חיישנים אלקטרוכימיים

  1. הכן את הבדיקה ללכוד thiolated בריכוז של 0.05 מיקרומטר ב300 מיקרומטר 1,6-hexanedithiol (HDT), 10 מ"מ טריס-HCl, pH 8.0, 0.3 M NaCl, 1 mM EDTA ו דגירה בחושך בטמפרטורת חדר למשך 10 דקות . דגירה של הבדיקה ללכוד thiolated עם HDT מבטיחה כי קבוצת תיאול על הבדיקה ללכוד מצטמצמת, וכתוצאה מכך תוצאות יותר עקביות.
  2. החל זרם של חנקן עד 16 שבב מערך החשוף זהב חיישן (ים) למשך 5 שניות כדי להסיר את הלחות ו / או חלקיקים.
  3. החל 6 μl של תמהיל הבדיקה ללכוד HDT-thiolated להאלקטרודה העבודה של כל 16 החיישנים של מערך החיישנים ולאחסן את שבב החיישן (ים) בצלחת פטרי מכוסה על 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. בדיקות ללכוד thiolated להיקשר ישירות לאלקטרודה הזהב החשופה וHDT פועל למניעת overpacking של הבדיקות ללכוד ולשמור אותם בקונפורמציה מורחבת שמקדמת הכלאה עם היעד.
  4. לאחר היום, לשטוף עם שבב חיישן deionized H 2 O במשך 2-3 שניות ויבשות תחת זרם של חנקן למשך 5 שניות.
  5. החל 6 μl של 10 מ"מ טריס-HCl, pH 8.0, 0.3 M NaCl, 1 mM EDTA, 1 מ"מ 6 mercapto-1-hexanol (MCH) לאלקטרודה העבודה של כל 16 החיישנים ו דגירה במשך 50 דקות. זה ובכל incubations שבב החיישן הבאים מבוצעים בצלחת פטרי מכוסה בטמפרטורת חדר. MCH פועל כסוכן חסימה, מילוי בכל פערים שבו הבדיקה ללכוד thiolated או HDT לא קיימת על פני השטח האלקטרודה.

2. לדוגמא הכנה

  1. העבר 1 מ"ל של תרבות חיידקים בשלב היומן של צמיחה (OD 600 ≈ 0.1) לצינור microcentrifuge צנטריפוגות ב XG 16,000 למשך 5 דקות. הסר את supernatant התרבות. יכולה להיות מעובד גלולה החיידקים באופן מיידי או מאוחסנת ב -80 ° C לשימוש מאוחר יותר.
  2. יסודיות resuspend גלולה חיידקים ב10 μl של 1 M NaOH על ידי יישום קצה פיפטה לבוטטום של צינור microcentrifuge וpipetting מעלה ומטה מספר פעמים. דגירה ההשעיה בטמפרטורת חדר למשך 5 דקות.
  3. לנטרל את lysate החיידקים על ידי הוספה של 50 μl 1 חיץ פוספט ', pH 7.2, המכיל 2.5% מ"מ סרום אלבומין (BSA) ושור של 0.25 בדיקה גלאי העמסה-שונה. דגירה lysate נוטרל למשך 10 דקות בטמפרטורת חדר. בדיקות גלאי העמסה-modified להכליא עם מולקולות מטרת rRNA חיידקיים.

3. Assay חיישן אלקטרוכימי

  1. שטוף MCH משבב החיישן עם deionized H 2 O עבור 2-3 שניות ויבשות תחת זרם של חנקן למשך 5 שניות.
  2. החל 4 μl של lysate חיידקים נטרל את האלקטרודה לעבודה של כל אחד מחיישני 14 ו דגירה במשך 15 דקות. מתחמי בדיקה יעד גלאים להכליא לבדיקות ללכוד thiolated משותק.
  3. החל 4 μl של 1 ננומטר גישור oligonucleotide ב1 חיץ פוספט ', pH 7.2, המכיל BSA 2.5% ו 0.25 μ בדיקה גלאי העמסה-modified M ל2 חיישני בקרה חיוביות (ששמש לנורמליזציה אות) ו דגירה במשך 15 דקות.
  4. שטוף את שבב החיישן עם deionized H 2 O במשך 2-3 שניות ויבשות תחת זרם של חנקן למשך 5 שניות.
  5. החל 4 μl של 0.5 U / מ"ל ​​אנטי העמסה-HRP ב1 חיץ פוספט ', pH 7.2, המכיל 0.5% קזאין להאלקטרודה העבודה של כל 16 החיישנים ודגירה במשך 15 דקות. אנטי ההעמסה-HRP נקשר לבדיקות גלאי העמסה-שונה המשותקות.
  6. שטוף את שבב החיישן עם deionized H 2 O במשך 2-3 שניות ויבשות תחת זרם של חנקן למשך 5 שניות.
  7. החל סרט גם מדבקה על פני השטח של השבב וחיישן העומס לתוך הר שבב החיישן. פיפטה μl 50 של מצע TMB על כל 16 החיישנים ולסגור את הר שבב החיישן.
  8. השג amperometry ומדידות Voltammetry מחזורי לכל 16 חיישני שימוש בקורא צ'יפ הליוס. Amperometric הנוכחי הוא פרופורציונלי לשיעור של TMB Reduction על משטח החיישן (ראה איור 1).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מתארים assay אלקטרוכימי שבנוי באופן דומה לכריך ELISA. כפי שניתן לראות בתרשים 1, יעד ההכלאה ריבוזומלי רנ"א (rRNA) עם בדיקות ללכוד וגלאי שפותחה על ידי תגובת חיזור catalyzed ידי HRP מצומדת לברי נוגדן אנטי העמסה אשר נקלטות על ידי העמסת הצמדה '3 בבדיקת הגלאי. מרכיב חשוב של רגישות assay הוא הכימיה של פני השטח של האלקטרודה הזהב. מצאנו כי monolayer משולשת המורכב מבדיקות thiolated ללכוד, mercaptohexanol וhexanedithiol משפרת את יחס אות לרעש באופן משמעותי על ידי הפחתת רק...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Assay חיישן אלקטרוכימי המתואר כאן מאפשר זיהוי מהיר של מטרות חומצות גרעין. רגישות וסגוליות תלויים בחלקו על האנרגיה החופשית של הכלאה יעד חללית, אשר בתורו תלוי באורך ותוכן GC של הלכידה ובדיקות גלאים. אנחנו בדרך כלל לבצע את פעולות ההכלאה בטמפרטורת הסביבה (~ 20 מעלות צלזיוס) 5, 6. עם זאת, צעדי ההכלאה (3.2 ו -3.3) יכולים גם להתבצע בטמפרטורות גבוהות יותר בתנור הכלאה אם השבב ממוקם בתא מכוסה המכיל טבולה נייר סינון כדי למנוע אידוי 7, 8. אות אופטימלית מתקבלת עם זוגות בד...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל הכותבים הם ממציאים על פטנטים הנוגעים לשיטות שתוארו. אחד מהפטנטים האלה כבר רישיון לתאגיד Qvella. BMC ו DAH יש עניין בהון תאגיד Qvella. VG הוא נשיא GeneFluidics, שהנו היצרנית של שבבי מערך חיישני אלקטרו, הר שבב, וקורא שבבים המתואר במאמר זה.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה נתמך על הסכם שיתוף פעולה AI075565 פרס (לDAH) מהמכון הלאומי לאלרגיה ומחלות זיהומיות על ידי ועל ידי ונדי וקרן קן רובי למצוינות במחקר אורולוגיה ילדים. BMC היא יהודית ויו"ר רוברט וינסטון באורולוגיה ילדים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
6-מרקפטו-1-הקסנול (MCH)Sigma451088אחסן בטמפרטורת החדר
1,6-hexanedithiol (HDT)SigmaH-12005אחסן בטמפרטורת החדר
בדיקות לכידת תיולציהOperonN/AStore ב-100 μ M ב-0.1x TE ב-20 ו-deg;
C גלאי שונה פלואורסצאין בודקOperonN/AStore ב-100 μ M ב-0.1x TE ב-20 ו-deg; C
גישור אוליגונוקלאוטידאופרוןN/Aחנות ב 100 μ M ב-0.1x TE ב-20 ו-deg; C
Anti-Fluorescein-HRP, שברי FabRoche11 426 346 910חנות ב-4 מעלות; C
Helios שבב קוראGeneFluidicsGFR-2009
חיישן שבב הרGeneFluidicsGFR-003
סרט היטב מדבקהGeneFluidicsנשלח עם שבבי חיישן
זהב חשוף 16 חיישנים מערך שבבים GeneFluidicsSC1000-16X-Bלאחסן ב 100% N2< / sub> בטמפרטורת החדר
בקר סרום אלבומין חנות SigmaA7906ב-4 מעלות; C
1M מאגר פוספט, pH 7.2 0.35M NaH2PO4, 0.65M K2HPO4, מותאם ל-pH 7.2
חוסם קזאין ב-PBS Pierce37528מדולל בנפח שווה של 1M מאגר פוספט, pH 7.2, יש לאחסן ב-4 מעלות; C
<חזק>טבלה 1. ריאגנטים וציוד.
את

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wu, J., Campuzano, S., Halford, C., Haake, D. A., Wang, J. Ternary Surface Monolayers for Ultrasensitive (Zeptomole) Amperometric Detection of Nucleic Acid Hybridization without Signal Amplification. Anal. Chem. 82, 8830-8837 (2010).
  2. Halford, C., et al. Rapid Antimicrobial Susceptibility Testing by Sensitive Detection of Precursor Ribosomal RNA Using a Novel Electrochemical Biosensing Platform. Antimicrob. Agents Chemother. 56, In Press (2012).
  3. Campuzano, S., et al. Ternary monolayers as DNA recognition interfaces for direct and sensitive electrochemical detection in untreated clinical samples. Biosens. Bioelectron. 26, 3577-3584 (2011).
  4. Gau, V., et al. Electrochemical molecular analysis without nucleic acid amplification. Methods. 37, 73-83 (2005).
  5. Patel, M., et al. Target Specific Capture Enhances Sensitivity of Electrochemical Detection of Bacterial Pathogens. J. Clin. Microbiol. 49, 4293-4296 (2011).
  6. Mastali, M., et al. Optimal probe length and target location for electrochemical detection of selected uropathogens at ambient temperature. J. Clin. Microbiol. 46, 2707-2716 (2008).
  7. Liao, J. C., et al. Use of electrochemical DNA biosensors for rapid molecular identification of uropathogens in clinical urine specimens. J. Clin. Microbiol. 44, 561-570 (2006).
  8. Liao, J. C., et al. Development of an advanced electrochemical DNA biosensor for bacterial pathogen detection. J. Mol. Diagn. 9, 158-168 (2007).
  9. Pedrero, M., Campuzano, S., Pingarron, J. M. Electroanalytical sensors and devices for multiplexed detection of foodborne pathogen microorganisms. Sensors (Basel). 9, 5503-5520 (2009).
  10. Kuralay, F., Campuzano, S., Haake, D. A., Wang, J. Highly sensitive disposable nucleic acid biosensors for direct bioelectronic detection in raw biological samples. Talanta. 85, 1330-1337 (2011).
  11. Ecker, D. J., et al. Ibis T5000: a universal biosensor approach for microbiology. Nat. Rev. Microbiol. 6, 553-558 (2008).
  12. Casalta, J. P., et al. Evaluation of the LightCycler SeptiFast test in the rapid etiologic diagnostic of infectious endocarditis. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 28, 569-573 (2009).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

RNATMB

מאמרים קשורים