הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

BCL-2 פונקצית בחינת משפחה עם שלפוחית ​​Unilamellar גדולה

7.5K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/4291

⸱

5 באוקטובר 2012

 ,  , 
1Department of Oncological Sciences, Department of Dermatology, The Tisch Cancer Institute, The Graduate School of Biological Sciences, Mount Sinai School of Medicine

במאמר זה

סיכום

שלפוכות חד-שכבתיות גדולות (LUVs) המוגדרות ביוכימית הן מערכת מודל נוחה לניתוח אינטראקציות של משפחת BCL-2, עם השלכות מיידיות להבנה טובה יותר של נתיב האפופטוזיס המיטוכונדריאלי. מוצגת כאן שיטה להכנת LUVs, יחד עם שילובי חלבונים סטנדרטיים ממשפחת BCL-2 ובקרות לבחינת חדירותן של ה-LUVs.

תקציר

משפחת ה-BCL-2 (B cell CLL/Lymphoma) מורכבת מכ-עשרים חלבונים הפועלים יחד כדי לשמר את הישרדות התא או להוביל לאפופטוזיס1. בעקבות עקה תאית (למשל, נזק ל-DNA), האפקטורים הפרו-אפופטוטיים ממשפחת BCL-2, BAK (BCL-2 antagonistic killer 1) ו/או BAX (BCL-2 associated X protein), הופכים לפעילים ופוגעים בשלמות ממברנת המיטוכונדריה החיצונית (OMM), בתהליך המכונה חדירות ממברנת המיטוכונדריה החיצונית (MOMP)1. לאחר התרחשות MOMP, חלבונים פרו-אפופטוטיים (למשל, cytochrome c) חודרים לציטופלזמה, מעודדים הפעלה של קספזים, ואפופטוזיס מתרחשת במהירות2.

כדי ש-BAK/BAX יגרמו ל-MOMP, הם זקוקים לאינטראקציות חולפות עם חברים בתת-קבוצה פרו-אפופטוטית אחרת של משפחת BCL-2, חלבוני BH3-only (חלבונים בעלי דומיין הומולוגי 3 של BCL-2 בלבד), כגון BID (BH3-interacting domain agonist)3-6. חלבונים אנטי-אפופטוטים ממשפחת BCL-2 (למשל, BCL-2 related gene, long isoform, BCL-xL; myeloid cell leukemia 1, MCL-1) מווסתים את הישרדות התא על ידי בקרה הדוקה של האינטראקציות בין BAK/BAX לבין חלבוני ה-BH3-only המסוגלים להשראות ישירה של הש activates BAK/BAX7,8. בנוסף, הזמינות של חלבוני BCL-2 אנטי-אפופטוטים נקבעת גם על ידי חלבוני BH3-only מסוג sensitizer/de-repressor, כגון BAD (BCL-2 antagonist of cell death) או PUMA (p53 upregulated modulator of apoptosis), אשר נקשרים למסלולים אנטי-אפופטוטים ומעכבים אותם7,9. מכיוון שמרבית הרפרטואר האנטי-אפופטוטי של BCL-2 ממוקם ב-OMM, ההחלטה התאית לשמר את ההישרדות או להשריע MOMP נקבעת על ידי אינטראקציות מרובות של משפחת BCL-2 בממברנה זו.

שלפושיות אונילמלולריות גדולות (LUVs) מהוות מודל ביוכימי לבחינת הקשרים בין אינטראקציות של משפחת BCL-2 לבין חדירות ממברנה10. LUVs מורכבות מליפידים מוגדרים המורכבים ביחסים שזוהו במחקרי הרכב ליפידי של מיטוכונדריה של Xenopus שהופקו באמצעות ממס (46.5% פוספטידילכולין, 28.5% פוספטידילאתנולאמין, 9% פוספטידילינוזיטול, 9% פוספטידילסרין, ו-7% קרדיוליפין)10. זוהי מערכת מודל נוחה לבחינה ישירה של תפקוד משפחת BCL-2 מכיוון שמרכיבי החלבון והליפידים מוגדרים לחלוטין וניתנים לניהול, מה שלא תמיד קורה במיטוכונדריה ראשונית. למרות שריכוז הקרדיוליפין בדרך כלל אינו גבוה כך לכל אורך ה-OMM, מודל זה מדמה נאמנה את ה-OMM כדי לקדם את תפקוד משפחת BCL-2. יתרה מכך, התאמה עדכנית יותר של הפרוטוקול לעיל מאפשרת ניתוחים קינטיים של אינטראקציות בין חלבונים ומדידות בזמן אמת של חדירות ממברנה, המבוססות על LUVs המכילות צבע פוליאניוני (ANTS: 8-aminonaphthalene-1,3,6-trisulfonic acid) ומכבה קטיוני (DPX: p-xylene-bis-pyridinium bromide)11. ככל שה-LUVs הופכות לחדירות, ANTS ו-DPX מפיצים זה מזה, ונמדדת עלייה בפלואורסצנציה. כאן מתוארים שילובי חלבונים רקומביננטיים נפוצים של משפחת BCL-2 ובקרות באמצעות LUVs המכילות ANTS/DPX.

פרוטוקול

1. שילוב ליפידים ויצירת שכבה ליפידית

  1. בעבודה במנדף תחת תאורה מינימלית, מערבבים ליפידים המומסים בכלורופורם לתוך מבחנה מזכוכית ענברית בנפח 1.5 ml באמצעות מזרק זכוכית gas-tight של Hamilton שנשטף בכלורופורם. שילוב זה יניב כ-4 mg של ליפידים (איור 1A).
    • Cardiolipin 10 mg/ml (CL) - 63 μl
    • Phosphatidylcholine 10 mg/ml (PC) - 84 μl
    • Phosphatidylethanoloamine 10 mg/ml (PE) - 125 μl
    • Phosphatidylinositol 10 mg/ml (PI) - 59.5 μl
    • Phosphatidylserine 10 mg/ml (PS) - 65 μl
  2. להסרת הכלורופורם, מפנים זרם עדין של גז אינרטי (למשל, חנקן או ארגון) לתוך המבחנה. שכבת ליפידים תהיה נראית בתחתית ובדפנות המבחנה כאשר תתייבש, תהליך שארך בדרך כלל 2 - 3 שעות (איור 1A).

2. הכנת תמיסת ליפוזומים

  1. במבחנות מיקרוצנטריפוגה של 1.7 ml, הכין 500 μl של 12.5 mM ANTS בבופר LUV (0.2 mM EDTA, 10 mM HEPES [pH 7], 200 mM KCl, 5 mM MgCl2 ) ו-500 μl של 45 mM DPX בבופר LUV (איור 1B).
  2. ערבב את תמיסאות ה-ANTS וה-DPX, בצע וורטקס למשך 1 min, וסונקציה למשך 1 min בטמפרטורת החדר. הסונקציה תבוצע באמבט מים אולטרסוני (לדוגמה, Branson 3510MTH, ללא הגדרה מיוחדת, פשוט במצב 'on'). פעולה זו מבטיחה שהתמיסות מומסות לחלוטין והומוגניות.
  3. הוסף את תמיסת ה-ANTS/DPX לסרט הליפידים, ואטום את הבקבוק באמצעות פאראפילם (איור 1B).
  4. בצע סונקציה לסרט הליפידים באמבט המים לעיל למשך 5 min. התמיסה תיראה חלבית לאחר הסונקציה. ודא שסרט הליפידים מומס לחלוטין, שכן אגרגטים קטנים של ליפידים ישפיעו לרעה על השלבים הבאים. כמו כן, בדוק את דפנות ותחתית הבקבוק כדי לוודא שלא נותר סרט ליפידים (איור 1B).

3. דחיסה וטיהור של ליפוזומים

  1. הרכיבו את האקסטרודר (extruder) בהתאם להנחיות היצרן, תוך שימוש בבאפר LUV להרטבת תומכי המסנן וממברנת הפוליקרבונט. הדקו את מעטפת היחידה כך שלא יחול איבוד נפח במהלך האקסטרוזיה, אך לא בחוזקה רבה מדי כדי לא לקרוע את הממברנה. מומלץ לבחון את האקסטרודר עם באפר LUV כדי לוודא שאין דליפות או בעיות.
  2. התחילו עם תמיסת הליפידים במזרק הימני, בצעו אקסטרוזיה של תמיסת הליפידים 31 פעמים, וה-LUVs יסיימו במזרק השמאלי; פעולה זו מבטיחה שכל הליפידים עברו דרך הממברנה לפחות פעם אחת. בפעמים הראשונות עשוי להידרש לחץ מעט גבוה יותר כדי לעבור דרך הממברנה. אם התמיסה עוברת פתאום במהירות דרך הממברנה, בדקו אם הממברנה נקרעה והחליפו אותה במידת הצורך (איור 1C).
  3. הכינו עמודת זרימה בכבידה של 10 ml Sepharose S-500 (נפח חרוצים 10 ml, מידות 1.0 cm x 20 cm). שטפו עם 3 נפחי עמודה של באפר LUV, המתינו עד שהזרימה בעמודה תפסיק, וסגרו בפקק. מכיוון ששלב זה נמשך זמן מה, עדיף להתחיל את השטיפה בזמן שהליפידים מאוחדים לייבוש. השאירו את העמודה סגורה עד שתהיו מוכנים להשתמש בה.
  4. הוסיפו את ה-LUVs שעברו אקסטרוזיה לעמודה בפעולה אחת, תוך הימנעות מהפרעה לממשק החרוצים. המתינו עד שהבאפר יסיים לזרום מהעמודה, הזרימה תיעצר, וסגרו בפקק. מלאו בעדינות את העמודה בבאפר LUV. שוב, נהגו בזהירות בעת הוספת הבאפר כדי שהחרוצים לא יופרו (איור 1C).
  5. הסירו את הפקק ואספו 6 פרקציות של 1 ml. ה-LUVs אלוטים בדרך כלל בפרקציות 3 ו-4, וניתן לזהותם על פי מראה עכור. לאחר איסוף הפרקציות, שטפו את העמודה עם 5 נפחים של מים ו-2 נפחים של 20% ethanol. אחסנו את העמודה ב-4 °C (איור 1C).
  6. אחסנו את הפרקציות ב-4 °C בחושך עד לבדיקתן.

4. בדיקת פראקציות מהעמודה

  1. כעת בוחנים את פракציוני העמודה להפליורסצנציה תוך השוואה בין באפר LUV לבאפר LUV מועשר ב-0.5% CHAPS. פракציונים המראים עלייה בהפליורסצנציה עקב נוכחות של CHAPS מכילים LUVs. טפטפו 100 μl של באפר LUV או באפר LUV + 0.5% CHAPS לתוך שישה בארות של כל סוג, הוסיפו 5 μl מהפракציה המתאימה וערבבו. השתמשו בלוחות 96 בארות שחורים, אטומים ולא מטופלים לכל מחקרי ה-LUV (איור 1D).
  2. קראו את הלוח בטמפרטורה של 37 °C עם הפרמטרים הבאים: אורך גל עירור (Excitation): 355 nm; אורך גל פליטה (Emission): 520 nm; הגבר (מתח): 125; מיקום אופטיקה: Top; גובה קריאה: 5.5 mm. הגדרה זו מיועדת למכשיר BioTek H1 Synergy המשתמש בתוכנת Gen 5 2.0 (איור 1D).
  3. פракציונים 3 ו-4 מראים בדרך כלל עלייה של פי 5 עד 10 בהפליורסצנציה. לאחר הניתוח, איחדו את הפракציונים המכילים LUV ואחסנו ב-4 °C בחושך; יטוהרו כ-2 ml של ליפידים בריכוז של ~ 2 mM (איור 1D).

5. מחקרי משפחת BCL-2 באמצעות LUVs

  1. חלבוני BCL-2 נבדקים ליכולתם להשרות ישירות פרמיליזציה של LUV, ולבקרת פעילות הפרמיליזציה. בדיקות LUV מבוצעות בדרך כלל בנפחים של 100 μl, בטמפרטורה של 37 °C, וניתן לנתח אותן כנקודת זמן בודדת לאחר 30 - 60 דקות (איורים 2A-C, 3A-B), או באמצעות מחקרי קינטיקה בכל 1 - 2 דקות למשך עד שעה אחת (איור 2D). תכנון בדיקה מייצג המתאר רכיבים, ריכוזי מלאי/ריכוז סופי וסדר ההוספה, מובא בטבלה (טבלה 1). מומלץ בנוסף להגדיר לקורא המיקרופלטה לנער בעדינות את הפלטה לפני כל קריאה. הדקות הראשונות נותנות לעיתים קריאות ספורדיות (ככל הנראה בשל שינויי טמפרטורה, ערבוב וכו'), ולכן אנו בוחנים בדרך כלל נקודות נתונים לאחר 2 - 3 קריאות במחקר קינטי. כמו כן, לא נדיר להיווצרות פסי שגיאה גדולים בחלק מהתנאים בשל שונות בין סדרות LUV, ויעילות אינטראקציות החלבונים בריכוזי הפעלה או עיכוב גבוליים.
  2. יש לדלל מלאי של חלבוני משפחת BCL-2 לתוך בופר LUV בריכוז של 100x, ויש לבצע טיטרציות נחוצות של BAX, BID וכל שאר החלבונים כדי למצוא את הריכוזים הנמוכים ביותר הדרושים לזיהוי פרמיליזציה מינימלית של LUV התלויה ב-BAX בהיעדרו של BID, וסינרגיה משמעותית בין BAX ל-BID. יתרה מכך, כל שאר החלבונים דורשים טיטרציות כדי להפחית בזבוז חלבון ולמזער את ריכוזי הוספות החלבונים העוקבות.

6. תוצאות מייצגות

קיימות אפשרויות רבות לצפייה ובחינה של ויסות תלוי-משפחת BCL-2 של חדירות LUV. כדי לייצר בקרת חיוביות לחדירות LUV, אנו משתמשים ב-BAX המופעל על ידי דטרגנט12. הדטרגנט, n-octyl-β-D-glucoside (OG), מעורר באופן מלאכותי את הפעלת BAX (עבור 100 μl של 2.3 μM OG-BAX: 5 μg BAX + 0.7% OG בבופר LUV, דגירה למשך 60 min ב-4 °C, חלוקה לאליקוטים ואחסון ב-80 °C-), ולפיכך ניתן להשתמש ב-OG-BAX (10 - 100 nM) כבקרת חיוביות מהימנה. ראוי לציין כי ריכוזי OG הנמוכים מ-0.025% אינם משפיעים ישירות על חדירות LUV. טיפול ב-0.5% CHAPS משמש לקביעת כמות הפלואורסצנציה המקסימלית של LUV לכל בדיקה, וערך זה קובע את ערך ה-100%. יש להכין את כל הטיפולים בשלוש חזרות. דוגמה למערך בדיקת בקרת LUV מוצגת ב-Table 1, והנתונים התואמים מוצגים ב-Figure 2A.

נקודת התחלה נחוצה לחקר חדירות של LUV באמצעות חלבוני משפחת BCL-2 היא קביעת ריכוזי ה-BAX וה-BID המעודדים שחרור אופטימלי. מכיוון שהכנות של חלבונים בודדים יפגינו פעילויות חדירות רקע שונות, מומלץ לבצע טיטרציה לפני ביצוע ניתוחים מורכבים יותר. יש לבצע טיטרציה של BAX (בטווח של 50–200 nM) ושל BID (בטווח של 0–10 nM) כדי להגיע לשחרור רקע מינימלי ולסינרגיה אופטימלית, כפי שמוצג ב- איורים 2B-C, בהתאמה. ניתן לרכוש צורות שונות של חלבון BID מ-R&D Systems; לחלופין, הפפטיד של דומיין BH3 של BID זמין מחברת Anaspec. אין צורה מסחרית של BAX המתאימה למבחני LUV, ולכן יש לבטא ולטהר אותו באמצעות שיטות שפורסמו במקורות.3,13.

לאחר קביעת הריכוזים והסינרגיה של BAX ו-BID, בדיקה נפוצה היא קביעת השפעתן של חלבונים אנטי-אפופטוטיים על חדירות LUV התלויה ב-BAX וב-BID. BCL-xL הוא חבר אנטי-אפופטוטי ממשפחת BCL-2 הזמין מסחרית, אשר מעכב באופן תלוי-מינון את פעילותם של BAX ו-BID, בדרך כלל בטווח של עודף מולרי של 5-10 פעמים ביחס ל-BAX או BID (איור 3A). ניתן להפוך השפעה מעכבת זו על ידי הוספה של חלבוני BH3-only נוספים (עודף מולרי של 2-5 פעמים ביחס ל-BCL-xL) או פפטידים של דומיין BH3 (עודף מולרי של 5-10 פעמים ביחס ל-BCL-xL), אשר נקשרים ל-BCL-xL, ובכך מאפשרים ל-BAX ו-BID לפעול בסינרגיה ולהגדיל את חדירות ה-LUVs (איור 3B). באיור 3B, אנו מראים את ההשפעה של PUMAβ אנושי רקומביננטי באורך מלא, ופפטיד דומיין BH3 של PUMA הוא דומה תפקודית (נתונים לא מוצגים)8. ניסוי זה מכונה בדרך כלל 'בדיקת הסרת דכייה' (de-repression assay), שכן חלבון PUMA מסיר את ההשפעה המעכבת של BCL-xL על BAX ו-BID. באופן אידיאלי, להוספת חלבון/פפטיד BH3-only המסיר את הדכייה צריכות להיות השפעות מינימליות על הפעלת BAX14.

Lipid synthesis and purification process diagram; chromatography and fraction analysis steps detailed.
איור 1. (A) ליפידים המומסים בכלורופורם משולבים, מיובשים ליצירת שכבת ליפידים (lipid film) ונחתמים. (ב) מכינים את תמיסות ה-ANTS וה-DPX, מערבבים ביניהן ומבצעים סוניקציה כדי להבטיח המסה מלאה והומוגניזציה. מוסיפים את התמיסה לשכבת השומן (lipid film), אוטמים את הבקבוק ב-parafilm ומבצעים סוניקציה למשך 5 דקות באמבט מים. התמיסה תיראה כעת חלבית. (ג) את תמיסת הליפידים שעברה סוניקציה טוענים לתוך מיני-אקסטרודר (mini-extruder), מעבירים בתהליך 31 פעמים, ומוסיפים לעמודת Sepharose S-500 שהוכנה מראש לצורך טהרה לאחר מכן. (ד) מנתחים את הפרקציות שהתקבלו לאחר כרומטוגרפיית החרגה לפי גודל (size exclusion chromatography) על ידי השוואת היחידות הפלואורסצנטיות היחסיות (RFUs) בבופר LUV ובבופר LUV + 0.5% CHAPS. קריאת "בופר LUV" מעידה על פלואורסצנציית רקע עם LUVs שלמים; תנאי "בופר LUV + 0.5% CHAPS" יראו עלייה בפלואורסצנציה עקב ליזיס, המעידה על נוכחות LUVs. פרקציות 3 ו-4 מכילות בדרך כלל את ה-LUVs, והן מאוחדות לאחר הניתוח. פרקציות 5 ו-6 מכילות ANTS שאינו מקולטן (כלומר, (לא בתוך ה-LUVs לאחר אקסטרוזיה), המראים פלואורסצנציה גבוהה ללא תלות ב-CHAPS. לחץ כאן להצגת איור גדול יותר.

תרשימי עמודות של חדירות LUV המראים השפעות של טיטרציית BAX ו-BID; גרף של עוצמת פלואורסצנציה לאורך זמן.
איור 2. ניסויי בקרה של משפחת BCL-2 וטיטרציות BAX/BID באמצעות LUVs. (A) ניסויי בקרה. LUVs טופלו בבופר LUV לבדו, 0.025% octylglucoside "OG", 50 nM BAX, או 50 nM OG-BAX. LUVs דגרו במשך 60 min ב-37 °C. אחוז (%) החדירות נקבע על ידי חיסור הפלואורסצנציה של טיפול הבופר מכל הדגימות; חדירות של 100% נקבעה על ידי דגימה שהומסה ב-0.5% CHAPS; חילקו את הערכים הניסויים בערך ה-CHAPS כדי לקבל את % חדירות ה-LUV. OG-BAX הוא BAX המופעל על ידי דטרגנט, המהווה בקרת חיובית מהימנה לחדירות LUV. (B) קביעת ריכוז ה-BAX האופטימלי. LUVs טופלו בריכוזים עולים של BAX (50 - 200 nM) בנוכחות 10 nM C8-BID "BID", או בבופר לבדו. (C) קביעת ריכוז ה-BID האופטימלי. LUVs טופלו בריכוזים עולים של BID (0 - 10 nM) בנוכחות 100 nM BAX. (D) דוגמה של סט נתונים קינטי של חדירות LUV. LUVs טופלו ב-BAX (100 nM) ± BID (10 nM). קריאות בוצעו מדי שתי min למשך 30 min, עם שתי שניות של ניעור עדין של הפלטה לפני כל קריאה. שלוש הקריאות הראשונות (0, 2, ו-4 min) אינן כלולות בגרף. יחידות הפלואורסצנציה היחסיות (RFU) המינימליות והמקסימליות נקבעו כפי שמתואר בסעיף 4.3. פסי השגיאה באיורים 2A-C מייצגים את סטיית התקן מנתונים של שלשויות. הנתונים ב-2D מייצגים בדיקה כפולה.

גרפים של חדירות LUV; השפעת BID/BAX/BCL-xL ו-PUMA; ניתוח ניסויי.
איור 3. דוגמאות לאינטראקציות נפוצות של משפחת BCL-2 שנבחנו באמצעות LUVs. (A) חדירות LUV המתווכת על ידי BAX ו-BID נבלמת על ידי BCL-xL. LUVs דגרו עם 100 nM BAX, 10 nM BID וריכוזים עולים של BCL-xL (0 - 500 nM). LUVs דגרו למשך 60 min ב-37 °C. (B) PUMA מסירה את הדיכוי של BCL-xL כדי לקדם את תפקודם של BAX ו-BID. LUVs דגרו עם שילובים של 100 nM BAX, 10 nM BID, 500 nM BCL-xL ו-(0 - 2.5 μM) PUMA למשך 60 min ב-37 °C. PUMA שימשה בריכוז של 2.5 μM עם BAX לבדו. פסי השגיאה מייצגים את סטיית התקן של נתונים משלוש חזרות.

סדר ההוספה:123456 
תנאיםLUV
בופר		OG
(0.7%)		BAX
(2.3 μM)		OG-BAX
(2.3 μM)		CHAPS
(10%)		וזיקולות חד-שכבתיות גדולות (LUVs)
(2 mM)		סה"כ
בופר95 μl    5 μl100 μl
OG (0.015%)92.83 μl2.17 μl   5 μl100 μl
BAX (50 nM)92.83 μl-2.17 μl  5 μl100 μl
OG-BAX (50 nM)92.83 μl  2.17 μl 5 μl100 μl
CHAPS (0.5%)90 μl   5 μl5 μl100 μl

טבלה 1. דוגמה לבדיקת ביקורת לקביעת ההשפעה של OG-BAX על חדירות LUV.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

השיטה המתוארת ליצירת LUVs מאפשרת דרך מהירה ויעילה לבדיקת התפקוד של חלבוני משפחת BCL-2 שונים, פפטידים וריאגנטים קשורים בסביבת ממברנה מוגדרת ביוכימית הדומה ל-OMM. אם משתמשים בערכי נקודת סיום (end point) כדי לקבוע את חדירות ה-LUVs, ניתן להכין מספר פלטות כדי לנתח מאות תנאים ביום אחד. מצאנו כי הריאגנטים המגבילים במבחנים אלו נוטים להיות האיכות והכמות של החלבונים הרקומיננטיים, לכן הקדשת זמן ומשאבים מספיקים לניקוי חלבונים תאפשר תוצאות הדירות במבחני LUV.

מניסיוננו, כאשר LUVs מאוחסנים ב-4 °C בחושך, הם ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

לא הוצהרו ניגודי אינטרסים.

תודות

ברצוננו להודות לכל חברי מעבדת Chipuk על עבודתם המשותפת ותמיכתם. בנוסף, ברצוננו להביע הערכה ל-Tomomi Kuwana ול-Donald Newmeyer על פיתוח התשתית הניסויית לעבודה זו. עבודה זו נתמכה על ידי: NIH CA157740 (עבור J.E.C.), ופרויקט פיילוט מ-NIH P20AA017067 (עבור J.E.C.). עבודה זו נתמכה בחלקה גם על ידי מענק מחקר 5-FY11-74 מקרן March of Dimes Foundation (עבור J.E.C.).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
1,2-Dioleoyl-sn-Glycero-3-Phosph–thanolamine "PE"Avanti850725C
L-α-Phosphatidylcholine (ביצה, תרנגולת) "PC"Avanti840051C
L-α-Phosphatidylinositol (כבד, בקר) "PI"Avanti840042C
L-α-Phosphatidylserine (מוח, חזיר) "PS"Avanti8400320
Cardiolipin (לב, בקר - מלח נתרן) "CL"Avanti840012C
ערכת מיני-אקסטרודר (Mini-extruder set)Avanti610023
ממברנת PC 0.2 mMAvanti610006
פלטת 96 בארות שחורה של CostarFisher Scientific07-200-590
BID אנושי שעבר שסוע על ידי Caspase-8R&D Systems882-B8-050
BCL-xL אנושי (ללא הקצה הקרבוקסילי)R&D Systems894-BX-050
פפטידים של דומיין BH3 מ-BID/PUMAAnaspec61711/62404
קורא מיקרו-פלטות רב-מצב היברידי Synergy H1BioTekNone

מקורות

  1. Chipuk, J. E., Moldoveanu, T., Llambi, F., Parsons, M. J., Green, D. R. The BCL-2 family reunion. Mol. Cell. 37, 299-310 (2010).
  2. Green, D. R. Apoptotic pathways: ten minutes to dead. Cell. 121, 671-674 (2005).
  3. Gavathiotis, E. BAX activation is initiated at a novel interaction site. Nature. 455, 1076-1081 (2008).
  4. Dewson, G. To trigger apoptosis, Bak exposes its BH3 domain and homodimerizes via BH3:groove interactions. Mol. Cell. 30, 369-380 (2008).
  5. Dewson, G. Bak activation for apoptosis involves oligomerization of dimers via their alpha6 helices. Mol. Cell. 36, 696-703 (2009).
  6. Gavathiotis, E., Reyna, D. E., Davis, M. L., Bird, G. H., Walensky, L. D. BH3-triggered structural reorganization drives the activation of proapoptotic BAX. Mol. Cell. 40, 481-492 (2010).
  7. Kuwana, T. BH3 domains of BH3-only proteins differentially regulate Bax-mediated mitochondrial membrane permeabilization both directly and indirectly. Mol. Cell. 17, 525-535 (2005).
  8. Chipuk, J. E. Mechanism of apoptosis induction by inhibition of the anti-apoptotic BCL-2 proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 20327-20332 (2008).
  9. Letai, A. Distinct BH3 domains either sensitize or activate mitochondrial apoptosis, serving as prototype cancer therapeutics. Cancer Cell. 2, 183-192 (2002).
  10. Kuwana, T. lipids cooperate to form supramolecular openings in the outer mitochondrial membrane. Cell. 111, 331-342 (2002).
  11. Lovell, J. F. Membrane binding by tBid initiates an ordered series of events culminating in membrane permeabilization by Bax. Cell. 135, 1074-1084 (2008).
  12. Hsu, Y. T., Youle, R. J. Nonionic detergents induce dimerization among members of the Bcl-2 family. J Biol Chem. 272, 13829-13834 (1997).
  13. Suzuki, M., Youle, R. J., Tjandra, N. Structure of Bax: coregulation of dimer formation and intracellular localization. Cell. 103, 645-654 (2000).
  14. Du, H. BH3 domains other than Bim and Bid can directly activate Bax/Bak. J Biol Chem. 286, 491-501 (2011).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

ANTS DPX
BCL-2 פונקצית בחינת משפחה עם שלפוחית ​​Unilamellar גדולה
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.