מאמר שיטה

באמצעות אסטרטגית האכלת התערבות RNA בתיווך למסך לגנים מעורבים בויסות משקל גוף בנמטודות ג elegans

DOI:

10.3791/4373

⸱

13 בפברואר 2013

 ,  , 
1Department of Science, Borough of Manhattan Community College, City Universtiy of New York (CUNY), 2Department of Biology, Queens College, The City University of New York (CUNY), 3Biochemistry Program, The Graduate Center, Queens College, The City University of New York (CUNY)

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מדגימים כיצד להשתמש בטכניקת RNAi ההאכלה להפיל גני המטרה ופנוטיפ גודל גוף בניקוד ג elegans. שיטה זו יכולה לשמש עבור מסך בקנה מידה גדול כדי לזהות רכיבי פוטנציאל גנטי של עניין, כגון אלה מעורבים בויסות משקל גוף על ידי איתות DBL-1/TGF-β.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפרעה דו גדיל RNA בתיווך (RNAi) היא אסטרטגיה יעילה כדי להפיל יעד ביטוי גני 1-3. זה כבר מיושם על מערכות מודל רבות, כוללים צמחים, חסרי חוליות ובעלי חוליות. קיימות שיטות שונות להשגת RNAi in vivo 4,5. לדוגמה, גן היעד עשוי להפוך לוקטור RNAi, ולאחר מכן שינה באופן קבוע או זמנית לשורות תאים או תאים ראשוניים כדי להשיג השפעות מציאת גן; לחלופין מסונתז oligonucleotides גדיל כפול מ גני המטרה ספציפיים (RNAi oligos) עשוי להיות transiently הופכים לשורות תאים או תאים עיקריים להשתיק גני המטרה, או מסונתז מולקולות דו גדיל RNA עשויות להיות microinjected לאורגניזם. מאז נמטודות ג elegans משתמש חיידקים כמקור מזון, להאכיל את החיות בחיידקים מבטאים-RNA גדיל כפול נגד גני המטרה מספק אסטרטגיה מעשית 6. כאן אנו מציגים האכלת RNAiשיטה להבקיע פנוטיפ גודל גוף. גודל גוף בג elegans מוסדר בעיקר על ידי TGF-β - יגנד כמו DBL-1, ולכן בדיקה זו היא מתאימה לזיהוי של רכיבי TGF-β איתות 7. אנחנו השתמשנו זנים שונים ביניהם שני זנים רגישים יתר RNAi לחזור על ניסויי האכלת RNAi. התוצאות שלנו הראו שrrf-3 מתח נתן לנו את הפנוטיפ RNAi הצפוי ביותר. השיטה קלה לביצוע, לשחזור, ולכמת בקלות. יתר על כן, הפרוטוקול שלנו ממזער את השימוש בציוד מיוחד, ולכן הוא מתאים למעבדות קטנות יותר או אלה בעיקר במוסדות לתואר ראשונים.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. הכנת צלחות האכלת RNAi נשיאת רצף גן המטרה

  1. אם אתם משתמשים בספריות RNAi זמינות מסחרי (למשל מהמקור LifeSciences Bioscience), המשך לשלב 1.4. לחלופין, לשכפל רצפי גני היעד לוקטור L4440, תולעת RNAi 8 פלסמיד נפוץ, על ידי פרוטוקול שיבוט סטנדרטי.
  2. להפוך פלסמיד רקומביננטי לזן חיידקים HT115 (DE3), תרבותם על צלחות אגרו LB עם 25 מיקרוגרם / המ"ל carbenicillin ו12.5 מיקרוגרם / המ"ל טטרציקלין, ולאסוף שיבוט יחיד לשימוש עתידי.
  3. בינתיים, להפוך L4440 הווקטור הריק למתח HT115 חיידקים לשימוש כשלט לניסויים.
  4. תרבות L4440 נושאים את החיידקים גם רקומביננטי וריקים במרק 1 מ"ל LB עם 100 מיקרוגרם / המ"ל אמפיצילין לילה בשעת 37 ° C. טטרציקלין לא הוסיף בשל עובדה שזה מקטין את יעילות RNAi.
  5. הוסף עוד 5 מיליליטר מרק LB עם 100 מיקרוגרם / המ"ל אמפיצילין לcultu הלילהמחדש, דגירה במשך 4-6 שעות נוספות בשעת 37 ° C.
  6. 0.5 מ"ל רקומביננטי זרעים או ריק L4440 נושאות תרבות חיידקים לצלחות תולעת RNAi. לתייג את כל הצלחות עם שם שיבוט.
  7. סמן את הצלחות ודגירת הלילה בשעת 37 ° C לצמוח דשא חיידקים, אלו הן צלחות RNAi עם או בלי רצף גן המטרה. לפחות 2 צלחות צריכות להיות מוכנות לכל מצב.

2. תולעי תרבות על צלחות האכלת RNAi

  1. להבה לעקר את קצה חוט בחירת תולעת פלטינה. השתמש בתולעת לאסוף לאסוף שלב זחל 4 6-10 (L4) הרמפרודיטים לכל צלחת RNAi המכילה L4440 או רקומביננטי או ריק; החיות תשתמשנה בחיידקים כמקור מזון.
  2. בואו הרמפרודיטים לגדול ב 20 ° C למשך הלילה (מצב סטנדרטי לתרבות אלגנס), הם יהפכו למבוגרים צעירים ביום שלמחרת.
  3. להעביר 6-10 מבוגרים צעירים לתוך צלחת שכותרת בהתאם והכין חדשה RNAi.
  4. בואומבוגרים מטילים ביצים במשך 4-6 שעות, ולאחר מכן להסיר את כל המבוגרים מהצלחת; שלב זה הוא לסנכרן את הצאצאים. ברגע שהאמהות מוסרות, מתחיל לספור זמן. זה זמן אפס.
  5. דגירת הצלחות ב 20 ° C כדי לתת חיות לגדול לשלב התפתחות מסוים; בפרוטוקול זה, אנו בוחרים אנשים צעירים לניתוח פנוטיפית. הנוקאוט המתפתח בקצב נורמלי, דגירת 72 שעות מספיקה לבעלי חיים כדי להפוך למבוגרים צעירים. עם זאת, גנים שונים משפיעים על התפתחות חיים בצורה שונה. אם RNAi גורם חיות לגדול בקצב שונה, מבוגרים הצעירים ניתן לזהות אלו לא יותר מאשר 24 שעות האחרונות L4 עם פיתוח השלים פות ו2-6 עוברים ברחם (אם פורה). כדי לזהות שלבי התפתחות אחרים, חוקר צריך להשתמש התפתחות אשכים ופות כמדריך.

3. פנוטיפים גודל גוף ציון של RNAi מטפלים בתולעים

  1. הנח שתי שכבות של קלטות תווית צבעוניות בשקופית זכוכית. הפכו שתייםשקופיות זכוכית se. לאחר מכן, הנח שקופית זכוכית חדשה בין שתי שקופיות עם קלטת. ממסים 2% agarose במים; להחיל טיפה אחת למרכז שקופית הזכוכית החדשה, ולאחר מכן לחץ על שקופית הכוס השנייה בחלק העליון כדי לעשות שכבה דקה של 2% agarose כפי שתואר לעיל 9.
  2. לאחר agarose הוא מוצק, להסיר את שקופית הזכוכית העליונה; השקופית עם כרית agarose מוכנה לטעון תולעים. שקופית תווית עם שם שיבוט.
  3. הוסף 10 μl 25 מ"מ 3 NaN לagarose הפנקס; לאסוף חי 30-40 ל3 פתרון NaN כדי לשתק אותם, ואז לשים על coverslip העליון; חוזר עבור שניהם רקומביננטי והריק נושא-L4440 חיות שטופלו ב-RNAi.
  4. תמונת התולעים תחת מיקרוסקופ לנתח באמצעות עדשה אובייקטיבית 2.5x; כאן אנו משתמשים מצלמה דיגיטלית יקה עם תמיכת Qcapture תוכנה.
  5. לכיול, ראשון ללכוד תמונה של שליט מיקרומטר סטנדרטי. ואז לפתוח את התמונה בתוכנת Image-Pro, לחץ על "מידה" ובחר באפשרות "כיול" ואז לבחור"אשף כיול המרחבית". עם "לכייל את התמונה הפעילה" שנבחרה, לחץ על "הבא". הקלט שם לכיול ולהבטיח שיחידות ההתייחסות מרחביות מוגדרות מיקרומטר. לאחר מכן, בדוק "ליצור הפנית הכיול" הכפתור וללחוץ על "הבא". לחץ על "קו התייחסות תיקו." סרגל קנה מידת התייחסות יופיע. שנה את מיקום סרגל קנה המידה כדי להתאים את הקצוות של מיקרומטר, ולאחר מכן ציינתי שההתייחסות מציינת 1,000 יחידות. לחץ על "אישור", "בא", וגם "סיום".
  6. לאחר שהתוכנה מכוילת, לפתוח תמונה עם תולעת. לאחר מכן, בחר בתפריט "המדד", בחר "כיול" ואז ללחוץ על "בחר המרחבית". בתפריט הנפתח, בחר את שם קובץ שנוצר לכיול מיקרומטר. לאחר מכן, תחת התפריט "המידה", בחר "מדידות". בחלון שנפתח, בחר בכלי חופשי לצייר ולשרטט קו דרך מרכז גוף החיה מראש ועד זנב עם עכבר מחשב (איור 1). האורך ידווח בחלון. עכשיויש לך שתי קבוצות של נתונים: אורך גופם של בעלי חיים שטופלו ביעד הגן RNAi וחיות בקרה שטופלו בL4440 וקטור ריק.
  7. לייצא את מדידות אורך לקובץ של Microsoft Excel, או תוכנה סטטיסטית מתאימה אחרת. לנתח את הנתונים על ידי חישוב הסטייה הממוצעת וסטנדרטית לכל דגימה. לאחר מכן, השווה דגימות באמצעות מבחן t של סטודנט.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

במחקר שלנו, אנו מתמקדים בויסות משקל גוף על ידי נתיב DBL-1/TGF-β. אובדן התפקוד של תוצאות DBL-1 המסלול בגודל גוף קטן, כולל אורך גוף קצר יותר בהשוואה לבעלי חיים פראיים מסוג 7,10,11. לפיכך, מסכים לג מוטנטים גודל גוף elegans הם מסוגלים לזהות רכיבים ומכפילי איתות TGF-β. DBL-1 איתות מתווכת על ידי מסלול TGF-β משומר אות תמרה הכולל קולטנים בתא שטח ומתמר אותות תאיים Smad 12. בכדי לבחון את היעילות של RNAi ידי האכלה לזיהוי של מוטציות גודל גוף, השתמש בטכנ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בפרוטוקול זה, אנו מתארים את השיטה שלנו לזיהוי של מוטציות פגומות גודל גוף של ג elegans ידי האכלת RNAi. שיטה זו ישימה לזיהוי רכיבי איתות TGF-β. מאחר שהרכיבים אלה שמורים ביותר עד 15 אבולוציה, מסכים אלה רלוונטיים להבהרת המנגנונים המולקולריים של איתות TGF-β בכל metazoans. שיקול חשוב בעיצוב מסך כזה הוא מתח המוצא. אנחנו הוכחנו שגם בארי-1; lin-15b וrrf-3 הם רגישים יותר להאכלת RNAi מאשר זני בקרה, העולים בקנה אחד עם מחקרים קודמים 12,13. עם זאת, למרות ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים לג'יימס קלארק למתן דמויות של חיות בנקודתי זמן שונים של התפתחות. ג זני elegans במחקר זה נלקחו מCaenorhabditis גנטיקת המרכז, אשר נתמך על ידי NIH המרכז הלאומי למשאבי מחקר (NCRR). עבודה זו נתמכה על ידי CIRG 1817 מCUNY לJL וCSD; ועל ידי NIH 1R15GM073678-01 ו1R15GM097692-01 לCSD אנו מודים לד"ר ויליאם J רייס, ד"ר נטליה הולצמן, ומליסה Silvestrini להערות על כתב היד. עבודה זו בוצעה במילוי חלקי של הדרישות לקבלת תואר דוקטור ממרכז בוגר אוניברסיטת העיר ניו יורק (ס 'שיונג).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
צלחות תולעת RNAi
מיקס בינוני תולעת גרם 17.7
60 גר 'אגר
הוסף H 2 O ל 3 ליטר. חיטוי.
הוסף 3 המ"ל 1M IPTG (סטרילי) ומיליליטר מ"ג / מיליליטר Carbenicillin 3 25 (סטרילי), ואז לשפוך לתוך צלחות פטרי 60 מ"מ.

צלחות תולעת
מיקס בינוני תולעת גרם 17.7
סולפט 0.6 גרם סטרפטומיצין
60 גר 'אגר
הוסף H 2 O ל 3 ליטר. חיטוי. יוצק לצלחות פטרי 60 מ"מ.

מיקס בינוני תולעת
55 גרם טריס-Cl
24 גרם טריס-OH
310 גרם Bacto Peptone
כולסטרול מ"ג 800
200 ג'NaCl
מערבב היטב ולהיות בטוח, כדי למנוע גושים; תערובת אבקה זה יכול להיות מאוחסן במשך חודשים שקדמו לשימוש רבים.

2% agarose
0.5 גרם agarose
מודעהד 25 המ"ל DH 2 O. מחממים במיקרוגל עד להמסה.

1M איזופרופיל β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)
2 גרם IPTG
ממס in10 המ"ל DH 2 O

1M 3 NaN
6.5 גרם 3 NaN
הוסף DH 2 O ל 100 מ"ל

25 המ"מ 3 NaN
2.5 המ"ל 1M 3 NaN
הוסף DH 2 O ל 100 מ"ל

elegans Caenorhabditis מCaenorhabditis גנטיקת מרכז
L4440 פלסמיד (נושאת גן אמפיצילין התנגדות)
חיידקים להתאמץ HT115 (DE3) (מכיל פולימראז T7 המושרה IPTG; לקוי לRNAse השלישי גן (dsRNAse) שגם נושא גן טטרציקלין-התנגדות) 16
60 מנות מ"מ פטרי
100 מנות מ"מ פטרי
14 צינורות תרבות פלקון ישבן עגול מ"ל
שקופיות זכוכית
coverslips זכוכית
1-20 pipettor μl
20-200 pipettor μl
200-1000 μlpipettor
1-200 טיפי pipet μl
200-1000 טיפי pipet μl
1.5 מ"ל אפנדורף צינורות
בחירת תולעת חוט פלטינה

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Melnyk, C. W., Molnar, A., Baulcombe, D. C. Intercellular and systemic movement of RNA silencing signals. Embo J. 30, 3553-3563 (2011).
  2. Wall, N. R., Shi, Y. Small RNA: can RNA interference be exploited for therapy. Lancet. 362, 1401-1403 (2003).
  3. Kalantidis, K., Schumacher, H. T., Alexiadis, T., Helm, J. M. RNA silencing movement in plants. Biol. Cell. 100, 13-26 (2008).
  4. Shim, M. S., Kwon, Y. J. Efficient and targeted delivery of siRNA in vivo. Febs. J. 277, 4814-4827 (2010).
  5. Amarzguioui, M., Rossi, J. J., Kim, D. Approaches for chemically synthesized siRNA and vector-mediated RNAi. FEBS Lett. 579, 5974-5981 (2005).
  6. Kamath, R. S., Ahringer, J. Genome-wide RNAi screening in Caenorhabditis elegans. Methods. 30, 313-321 (2003).
  7. Savage-Dunn, C., et al. Genetic screen for small body size mutants in C. elegans reveals many TGFb pathway components. Genesis. 35, 239-247 (2003).
  8. Timmons, L., Fire, A. Specific interference by ingested dsRNA. Nature. 395, 854(1998).
  9. Sulston, J. E., Horvitz, H. R. Post-embryonic cell lineages of the nematode, Caenorhabditis elegans. Dev. Biol. 56, 110-156 (1977).
  10. Wang, J., Tokarz, R., Savage-Dunn, C. The expression of TGFβ signal transducers in the hypodermis regulates body size in C. elegans. Development. 129, 4989-4998 (2002).
  11. Liang, J., et al. The Caenorhabditis elegans schnurri homolog sma-9 mediates stage- and cell type-specific responses to DBL-1 BMP-related signaling. Development. 130, 6453-6464 (2003).
  12. Savage-Dunn, C. TGF-β signaling. WormBook. , 1-12 (2005).
  13. Simmer, F., et al. Loss of the putative RNA-directed RNA polymerase RRF-3 makes C. elegans hypersensitive to RNAi. Curr. Biol. 12, 1317-1319 (2002).
  14. Wang, D., et al. Somatic misexpression of germline P granules and enhanced RNA interference in retinoblastoma pathway mutants. Nature. 436, 593-597 (2005).
  15. De Robertis, E. M. Evo-devo: variations on ancestral themes. Cell. 132, 185-195 (2008).
  16. Timmons, L., Court, D. L., Fire, A. Ingestion of bacterially expressed dsRNAs can produce specific and potent genetic interference in Caenorhabditis elegans. Gene. 263, 103-112 (2001).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

RNA InterferenceRNAi FeedingGene KnockdownTGF beta SignalingMicroscopic ImagingLength MeasurementStudent s T testWorm Strains

מאמרים קשורים