Method Article

ניתוח RNA-seq של Transcriptomes בטרומבין טופל ותאי שליטה אנושי ריאת כלי דם האנדותל

DOI:

10.3791/4393

⸱

February 13th, 2013

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Children's Mercy Hospital and Clinics, School of Medicine, University of Missouri-Kansas City

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מציג הליך מלא ומפורט להחלת RNA-seq, טכנולוגיית דור הבא DNA עצמת רצף, לtranscriptomes פרופיל בתאים אנושיים ריאות כלי דם אנדותל עם או בלי טיפול תרומבין. פרוטוקול זה הוא להכליל לתאים או רקמות שונים שנפגעו על ידי חומרים כימיים שונים או במחלות.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

האפיון של ביטוי גנים בתאים באמצעות מדידת רמות ה-mRNA הוא כלי שימושי בקביעה כמה מכונות התעתיק של התא מושפעות מאותות חיצוניים (לדוגמה: טיפול תרופתי), או כמה תאים שונים בין מצב בריא ומצב חולה. עם כניסתו ועידון מתמיד של טכנולוגיית רצפי DNA של הדור הבא, RNA-רצף (RNA-seq) הפך שיטה פופולרית יותר ויותר של ניתוח transcriptome לקטלג את כל המינים של תמלילים, כדי לקבוע את מבנה התעתיק של כל הגנים הביעו ולכמת הרמות המשתנות הביטוי של המערך הכולל של תמלילים בניתן 1,2 תא, רקמה או אורגניזם. RNA-seq הדרגה מחליף מערכי DNA כשיטה מועדפת לניתוח transcriptome כי יש לו את היתרונות של אפיון transcriptome מלא, ומספק נתון סוג דיגיטלי (מספר העתק של כל פרוטוקול) ולא להסתמך על כל sequen הגנומי ידוע3 לספירה.

כאן, אנו מציגים פרוטוקול מלא ומפורט כדי להחיל RNA-seq לtranscriptomes פרופיל בתאי כלי דם ריאתי אדם אנדותל עם או בלי טיפול תרומבין. פרוטוקול זה מבוסס על המחקר שפורסם לאחרונה תחת הכותרת שלנו "RNA-seq חושף transcriptome רומן של גנים וisoforms בתאי כלי דם ריאתי אדם שטופלו באנדותל טרומבין," 4 שבבצענו ניתוח transcriptome המלא הראשון של תאי כלי דם ריאתי אדם אנדותל בהצלחה טופל בתרומבין באמצעות RNA-seq. הוא הניב משאבים חסרי תקדים לניסויים נוספים כדי לקבל תובנה לתוך מנגנונים מולקולריים שבבסיס תפקוד האנדותל תרומבין בתיווך בפתוגנזה של מצבים דלקתיים, סרטן, סוכרת, ומחלת לב כלילית, ומספק לידים חדשים פוטנציאליים למטרות טיפוליות למחלות אלה.

טקסט התיאורים של פרוטוקול זההוא מחולק לארבעה חלקים. החלק הראשון מתאר את הטיפול בתאים אנושיים ריאות כלי דם אנדותל עם תרומבין ו-RNA בידוד, איכות ניתוח וכימות. החלק השני מתאר את בניית ספרייה וסדר. החלק השלישי מתאר את ניתוח הנתונים. החלק הרביעי מתאר assay אימות RT-PCR. תוצאות מייצגות של כמה צעדים מרכזיים מוצגות. טיפים או אזהרות שימושיים כדי לשפר את ההצלחה בשלבים עיקריים מובאים בסעיף הדיון. למרות שפרוטוקול זה משתמש בתאי אנדותל כלי דם ריאתי אדם שטופלו בתרומבין, זה יכול להיות כללי לtranscriptomes הפרופיל בשני תאי יונקים ושאינם יונקים וברקמות שטופלו בגירויים שונים או מעכבים, או להשוואת transcriptomes בתאים או רקמות בין מצב בריא ומצב של מחלה.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תרשים זרימה מתאר פרוטוקול זה מוצג באיור 1.

1. טיפול בתאים עם טרומבין, RNA בידוד, הערכת איכות וכימות של RNA

  1. תאי תרבות אנושי ריאות כלי דם (אנדותל HMVEC-LBL) למפגש 90-100% בצלחות 6-גם במדיום EGM-2 עם 5% FBS, גורמי גדילה ואנטיביוטיקה (Lonza, חתול # CC-3202).
  2. שינוי תקשורת לתקשורת הרעבה (0% FBS) 30 דקות לפני הטיפול עם תרומבין.
  3. פנק את התאים עם 0.05 U / ml תרומ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבור שלב 1: -28: יחס 18s משמש באופן מסורתי כאינדיקציה לפירוק רנ"א. באופן אידיאלי, -28 השיא צריך להיות בערך פי שניים מהשטח של להקת 18s (יחס של 2), אולם יחס אידיאלי זה הוא לעתים קרובות לא ראה בפועל. יתר על כן, יחסים -28: 18S המתקבלים משיטות spectrophotometric יכולים לזלזל בסכום של השפלה של רנ"א. באופן מדויק יותר כדי לכמת את ההשפלה, ולכן האיכות של מדגם RNA, המערכת מחשבת Experion איכות מחוון מספר רנ"א (RQI). אלגוריתם RQI משווה electropherogram של דגימות RNA לנתונים מס.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שלבים עיקריים

טיפול RNA: RNases לבזות אפילו את רוב RNA באיכות גבוהה, ולכן יש להקפיד בעת הבידוד, האחסון והשימוש של רנ"א 10. כפפות תמיד שחוקות על מנת למנוע זיהום על ידי RNases שנמצא על ידי אדם. כפפות צריכות להיות שונות לעתים קרובות, במיוחד לאחר עור נוגע, ידיות של דלתות או משטחים נפוצים אחרים. קבוצה של pipettes צריכה להיות מוקדשת אך ורק לעבודת RNA וכל הטיפים וצינורות צריכים להיות RNase .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מבקשים להודות לד"ר סטיבן Kingsmore ומרכז לרפואת הגנום ילדים בבתי החולים ומרפאות מרסי לילדים לשימוש באשכולות המחשוב שלהם לניתוח הנתונים שלנו, צוות של Illumina תחום השירות (אליזבת בוייר, סקוט קוק ומארק קוק) והטכני צוות יועצים לתגובות המהירות שלהם והצעות מועילות על הריצה של מכשיר הדור הבא של רצפי DNA, HiScanSQ, וניתוח איכות נתונים. עבודה זו נתמכה בחלקו על ידי המכון הלאומי לבריאות גרנט HL080042 (לSQY) והקרן הזנק והנחלה של בתי החולים ומרפאות מרסי לילדים, אוניברסיטת מיזורי בקנזס סיטי (לSQY).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
ריאגנטים או ציוד חברה מספר קטלוגים תגובות
תאי ריאת כלי דם האנדותל אדם Lonza CC-2815
Lonza, קיט Bullet Lonza CC-3202 מכיל EGM-2, FBS, גורמי גדילה ואנטיביוטיקה
תרומבין סיגמא T4393
Ambion מיר נה קיט חי טכנולוגיות AM 1560
RNase-Zap חי טכנולוגיות AM9782
Experion StdSens רנ"א Bio-Rad 700-7103
TruSeq רנ"א הכנהקיט Illumina FC-122-1001
חרוזי AMPureXP Beckman Coulter A63881
עילי הפוך transcriptase השני חי טכנולוגיות 18064-014
1K Experion DNA Bio-Rad 700-7107
QuantiTect SyberGreen Qiagen 204163
PE Cluster דור קיט Illumina PE-401-3001
PhiX בקרת הקיט Illumina FC110-301
200 מחזור SBS קיט Illumina FC-401-3001
HiScanSQ * Illumina SY-103-2001
CBOT Illumina SY-301-2002
מכונת qPCR - Viia7 חי טכנולוגיות # VIIA7 / ציוד דגם # 10631261 או שווה ערך
Experion מערכת Bio Rad 7007001 Bioanalyzer היא מערכת חלופית
ספקטרופוטומטר Bio-Tek אפוק Microplate ספקטרופוטומטר או שווה ערך
צנטריפוגה - Sorvall המקרא XTR Thermo Scientific 75004521 או שווה ערך
מעמד מגנטי חי טכנולוגיות AM10027
96-היטב thermocycler ספק מעבדת כללית
לוח 3. רשימה של ריאגנטים מפתח ומי מז'ורquipment. *, בוידאו, HiSeq1000 במקום HiScanSQ הודגם.

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat. Rev. Genet. 10, 57-63 (2009).
  2. Shendure, J., Ji, H. Next-generation DNA sequencing. Nat. Biotechnol. 26, 1135-1145 (2008).
  3. Marioni, J. C., Mason, C. E., Mane, S. M., Stephens, M., Gilad, Y.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

RNA seq AnalysisTranscriptome ProfilingThrombin TreatmentHuman Pulmonary Microvascular Endothelial CellsRNA IsolationLibrary ConstructionData AnalysisRT PCR ValidationHighSeq 1000Cuffdiff Analysis

Related Articles