אנו מתארים פרוטוקול באמצעות שקופיות קאמריות ותקשורת כדי לשתק פסיגי צמחים עבור הדמית confocal של האפידרמיס על פני כמה ימים של פיתוח, המתעד את בידול הפיוניות. חלבוני fluorophore מתויג-ניתן לעקוב באופן דינמי על ידי ביטוי ולוקליזציה subcellular, להגביר את ההבנה של התפקידים האפשריים שלהם במהלך חלוקת תאים והתמיינות תאים מסוג.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
לטווח ארוך הדמיה, ברזולוציה גבוהה Confocal זמן פקיעה של
במאמר זה
סיכום
תקציר
הדמיה בדינמיקת vivo של התנהגות תאית לאורך רצף ההתפתחותי יכולה להיות טכניקה רבה עצמה להבנת המכניקה של דפוסי רקמה. במהלך התפתחות בעלי חיים, התפשטות תאים מרכזיות ואירועי דפוסים להתרחש מהר מאוד. לדוגמה, בelegans Caenorhabditis כל חלוקות התא הנדרשות לתכנית גוף זחל סקרים בתוך שש שעות לאחר הפריה, עם שבעה מחזורי mitotic 1; את mitoses 16 או יותר של התפתחות עוברת תסיסנית להתרחש בפחות מ 24 שעות 2. לעומת זאת, חלוקות תא במהלך התפתחות צמח הן איטיות, בדרך כלל על סדר יום 3,4,5. זה מטיל אתגר ייחודי וצורך בהדמיה חייה לטווח ארוך לתיעוד התנהגות דינמית של חלוקת תאים והתמיינות במהלך אירועי organogenesis צמח. האפידרמיס ארבידופסיס הוא מערכת מודל מצוינת לאיתות חקירה, גורל תא, ופיתוח במפעלים. בטבורית, רקמה זו מורכבת מאוויר ותאים עמידים במים וביניהם ריצוף הפיוניות מופצת באופן שווה, שסתום שפתוח וקרוב לשליטת חילוף גזים ואובדן מים. מרווח נכון של הפיוניות אלה הוא קריטי לתפקוד שלהם, ופיתוחם כדלקמן רצף של חלוקה סימטרית ושלבי התמיינות תאים לייצר האפידרמיס המאורגן (1 איור).
פרוטוקול זה מאפשר תצפית של תאים וחלבונים באפידרמיס על פני כמה ימים של פיתוח. מסגרת זמן זו מאפשרת תיעוד מדויק של חטיבות תאי גזע והתמיינותם של תאי אפידרמיס, כולל תאי הפיוניות ומדרכת אפידרמיס. חלבוני ניאון ניתן התמזגו לחלבונים של עניין להעריך הדינמיקה שלהם במהלך חלוקת תאים ותהליכי התמיינות. טכניקה זו מאפשרת לנו להבין את הלוקליזציה של חלבון רומן, 6 POLAR, בשלב ההתפשטות של תאי הפיוניות-שושלת בדואר האפידרמיס ארבידופסיס פסיג, שבו הוא מתבטא בתאים שקדמו לאירועי חלוקה סימטריים ועובר לאזור אופייני לקליפת תא זמן קצר לפני חלוקה מתרחשת. תמונות יכולות להיות רשומות ווידאו יעיל בקלות הופק באמצעות תוכנת תחום ציבורית לדמיין לוקליזציה חלבון דינמית וסוגי תאים כפי שהם משתנים עם זמן.
פרוטוקול
1. עיקור זרעים
- להכין תמיסת זרע עיקור: 33% אקונומיקה ביתית, 0.1% Triton X-100.
- זרעי Place נשאו מבנה רצוי ניאון כתב (הים) וגנוטיפ (הים) בצינור מ"ל 1.7 ולהחיל 1 מ"ל של תמיסת חיטוי. דגירה על nutator במשך 15 דקות.
- במכסת מנוע סטרילי, השתמש pipettor להסיר פתרון עיקור מצינור, מותיר אחריו זרעים. לשטוף עם מי 1 מ"ל סטרילי. חזור על התרגיל ארבע פעמים.
- לדגור על 4 מעלות צלזיוס למשך ימים או יותר.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
סט של נקודתי זמן אינפורמטיבי שנאספו בשיטה זו הנו שמוצג באיור 3. קרום תא מסומן עם RFP (PM-RB) והוא התמזג GFP לחלבון POLAR תחת האמרגן המקורי שלו (POLAR :: POLAR-GFP) 6 בסולם הזמן 30-דקות, אנו רואים חלוקות תא יחד עם השינויים בלוקליזציה חלבון שקדם להם. חלוקות סימטריות בצורת שושלת הפיוניות תאי גזע דמוי מבשרי הפיוניות נקראים meristemoids, אשר שומר על היכולת לעבור חלוקות אסימטריות נוסף, ותאי האחות שלהם, הנקרא תאים קרקעי שושלת הפיוניות (SLGCs). S.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
טכניקת confocal זמן לשגות זה מאפשר מחקרים ארוכים טווח של ביטוי ולוקליזציה בתאים בודדים של האפידרמיס הפסיג ארבידופסיס, אשר במקרה של חלבוני POLAR והשני דינמי הוא קריטי להבנה נכונה של תפקודם חלבון מתויג fluorescently. בעבר, זמן לשגות הדמיה מתמשכת נעשתה שימוש כדי לבחון זיהום פטרייתי ארבידופסיס שורש 11 וצמיחת meristem 5,12, אך הוספת האפידרמיס הפסיג מרחיבה את הרבגוניות של טכניקה זו ומאפשרת את השימוש בו לחלבונים נוספים, בעיקר סיוע בתחום ההרחבה של פ.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
אין ניגודי האינטרסים הכריזו.
תודות
אנו מודים אמנדה Rychel לסיוע בפיתוח זמן פקיעת הפרוטוקול ולין Pillitteri לבניית POLAR :: POLAR-eGFP. אנו מודים גם לABRC למתן pm-RB לבנות. פרוטוקול זה פותח באמצעות תמיכה מPRESTO הפרס מטכנולוגיה והסוכנות יפניות למדע. מחקר על POLAR נתמך גם על ידי אוניברסיטת וושינגטון Royalty קרן מחקר (RRF-4098) והקרן הלאומי למדע (MCB-0855659). KMP הוא עמית מחקר למוסמכי NSF (dge-0718124), וKUT הוא חוקר HHMI-GBMF.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| שם מגיב | חברה | מספר קטלוגים | תגובות |
| אגר Bacto | BD | 214010 | |
| שקופית אחת קאמרית | Nunc (Thermo Scientific) | 155360 | או שני הקאמריים (155379) |
| confocal מיקרוסקופ סריקת ליזר | Zeiss | LSM700 | 2009 תוכנת זן |
| עדשה אובייקטיבית 20x | Zeiss | 420650-9901 | NA 0.8, תכנית-APOCHROMAT |
| ביתור מיקרוסקופ | נץ (הלאומי) | 431TBL | מאיר מלמטה |
| # 5 מלקחיים, ביולוגית קצה | מכשיר כירורגי Roboz | RS-4978 | טיפים יפים מאודהם קריטיים |
מקורות
- Sulston, J. E., Schierenberg, E., White, J. G., Thomson, J. N. The Embryonic Cell Lineage of the Nematode Caenorhabditis elegans. Developmental Biology. 100, 64(1983).
- Foe, V., Odell, G., Edgar, B. A. Chapter 3 Mitosis and Morphogenesis: Point and Counterpoint. Development of Drosophila melanogaster. Bate, ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
