Xenopus ביצת התמצית היא מערכת מודל שימושית לחקור מחסום הניזק לדנ"א. פרוטוקול זה מיועד להכנת תמציות ביצת Xenopus ריאגנטים ישכנעו מחסום ניזק לדנ"א. טכניקות אלה הן התאמה למגוון של גישות מזיקות DNA במחקר של איתות מחסום הניזק לדנ"א.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
חקר מחסום הניזק לדנ"א באמצעות
* These authors contributed equally
במאמר זה
סיכום
תקציר
על בסיס יומי, תאים נחשפים למגוון של עלבונות אנדוגניים וסביבתיים. כדי להתמודד עם העלבונות האלה, תאים התפתחו מחסום ניזק לדנ"א איתות כמנגנון מעקב לחוש ניזק לדנ"א ותגובות תאיות ישירות לניזק לדנ"א. ישנן מספר קבוצות של חלבונים הנקראים חיישנים, מתמר וגורמים מעורבים באיתות מחסום ניזק לדנ"א (איור 1). במסלול איתות מורכבת זו, ATR (כספומט וRad3 קשור) הוא אחד מקינאזות העיקרית שיכול להגיב לניזק לדנ"א, ומתח שכפול. הפעיל ATR יכול phosphorylate מצעי מורדה כגון Chk1 (קינאז מחסום 1). כתוצאה מכך, פוספורילציה והפעיל Chk1 מוביל לתופעות רבות במורד מחסום הניזק לדנ"א, כוללים מעצר מחזור תא, הפעלת שעתוק, תיקון ניזק לדנ"א, ואפופטוזיס או הזדקנות (איור 1). כאשר ה-DNA פגומה, שלא הצליח להפעיל את תוצאות מחסום הניזק לדנ"א בunrepניזק שודר, ועקב כך חוסר יציבות, הגנומי. המחקר של מחסום הניזק לדנ"א יבהיר כיצד תאים לשמור על שלמות גנטית ולספק הבנה טובה יותר של איך מחלות אנושיות, כגון סרטן, להתפתח.
תמציות Xenopus laevis ביצה מתגלות כמערכת חזקה תא חינם תמצית מודל במחקר מחסום ניזק לדנ"א. תמצית מהירות נמוכה (LSE) בתחילה תארה Masui קבוצת 1. התוספת של הכרומטין הזרע demembranated לתוצאות LSE בהיווצרות גרעינים שבו DNA משוכפל באופנת semiconservative פעם אחת בכל מחזור התא.
מסלול איתות מחסום ATR/Chk1-mediated מופעל על ידי ניזק לדנ"א או מתח כפול 2. שתי שיטות עיקריות משמשת כיום כדי לגרום הניזק לדנ"א מחסום: גישות מזיקות DNA ומבני ניזק-DNA מחק 3. ניזק לדנ"א יכול להיגרם על ידי קרינת אולטרה סגולה (UV), γ-קרינה, מהתיל methanesulfonate (MMS), mitomycin C (MMC), 4-nitroquinoline-1-התחמוצת (4-NQO), או aphidicolin 3, 4. MMS הוא סוכן אלקילציה שמעכב שכפול הדנ"א ומפעיל את מחסום הניזק לדנ"א ATR/Chk1-mediated 4-7. קרינת UV גם מפעילה 8 מחסום הניזק לדנ"א ATR/Chk1-dependent. מבנה ה-DNA ניזק מחקי AT70 הוא מורכב משני annealed oligonucleotides פולי-(DA) 70 ופולי-70 (dT). AT70 המערכת פותחה במעבדתו של ביל דאנפי ונמצאת בשימוש נרחב כדי לגרום ATR/Chk1 איתות מחסום 9-12.
כאן, אנו מתארים פרוטוקולים (1) כדי להכין תמציות ביצת תא חינם (LSE), (2) לטיפול בכרומטין זרע עם DNA Xenopus שתי שונים לפגוע גישות (MMS ו UV), (3) כדי להכין את מבנה ה-DNA ניזק המחקים AT70, ו( 4) כדי לעורר את מחסום הניזק לדנ"א ATR/Chk1-mediated בLSE בכרומטין זרע פגום או מבנה ה-DNA ניזק מחקים.
פרוטוקול
1. הכנת LSE
- צפרדעי נשים (Xenopus laevis) מוזרקות פעמים לאיסוף ביצים. הזריקה הראשונה (יחול) היא 100 U PMSG (Mare הסרום גונדוטרופין הריון) לצפרדע. צפרדעים חייבות להיות דרוכות לפחות ימים לפני ביצת גרימת הנחת וצפרדעים דרוכות הן שמישות לתקופה של עד שבועות. לצפרדעי ממשלה, להזריק PMSG תת עורית בגב הצ'קים הלימפה באמצעות מזרק 3 מ"ל ומחט 27 G.
- כדי לגרום להטלת ביצים, להזריק 500 U (gonadotrophin כוריוני האנושי) hCG לצפרדע דרוכה תת עורי בגב הצ'קים הלימפה באמצעות מחט 27 G. דגירת צפרדעים....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
ישנם מספר יתרונות בלימוד מחסום הניזק לדנ"א באמצעות תמציות Xenopus ביצים. השימוש בתמציות ביצה מספק כמות גדולה של תמציות תא חינם מסונכרנות בשלבי ביניים של מחזור התא. ניתן תמציות הביצים בקלות ובזול. זה יחסית קל לפגוע DNA או הכרומטין ולחשוף פגם במחסום הניזק לדנ"א לאחר immunodepleting חלבון מטרה מתמצית ביצה. בהמשך, פגם פונקציה פוטנציאלית ניתן "הציל" על ידי addback מסוג בר או חלבונים רקומביננטיים מוטציה. לכן, Xenopus ביצת התמצית היא מערכת מודל רבת ע.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
אין ניגודי האינטרסים הכריזו.
תודות
עבודה זו נתמכת בחלקו על ידי כספים הניתנים על ידי אוניברסיטת צפון קרוליינה בשארלוט, קרן יסוד Wachovia למצוינות סגל, ומענק מNIGMS (R15GM101571).
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| ריאגנטים | |||
| Anti-P-S344 Chk1 נוגדן | איתות תא | 2348L | |
| נוגדן אנטי Chk1 | סנט קרוז | SC7898 | |
| Aprotinin | Biomedicals MP | 0219115880 | |
| Cycloheximide | סיגמא | C7698-5G | |
| Cytochalasin B | EMD | 250233 | |
| Dithiothreitol (DTT) | VWR | JTF780-2 | |
| hCG | סיגמא | CG10-10VL | |
| L-ציסטאין | סיגמא | C7352-1 ק"ג | |
| Leupeptin | VWR | 97063-922 | |
| מתיל methanesulfonate (MMS) | סיגמא | 129925-5G | |
| Nocodazole | סיגמא | M1404-2MG | |
| PMSG | Calbiochem | 367222 | |
| חיץ מדגם | סיגמא | S3401 | |
| Tautomycin | Wako כימיקלי ארה"ב | 209-12041 | |
| ציוד | |||
| דלי להטלת ביצים | מוצרי Rubbermaid המסחריים | 6308 | |
| צנטריפוגה CL2 IEC עם הרוטור דלי מתנדנד | Thermo Scientific | 004260F | |
| הרוטור דלי HB6 נדנוד | Thermo Scientific | 11860 | |
| Sorvall RC6 תוספת צנטריפוגה SuperSpeed | Thermo Scientific | 46910 | |
| crosslinker UV | UVP | 95-0174-01 | |
| פתרונות | |||
| 1x MMR | 100 המ"מימ NaCl, 2 המ"מ KCl, 0.5 mM 4 MgSO, 2.5 המ"מ CaCl 2, 5 HEPES מ"מ, להתאים pH ל -7.8 עם 10 M NaOH | ||
| Aprotinin / מניות Leupeptin | 10 מ"ג / מ"ל כל אחד במים. אחסן 20 aliquots μl ב -80 ° C. | ||
| X החיץ | סוכרוז 0.2 מ ', 80 המ"מ KCl, 15 המ"מ NaCl, 5 המ"מ MgCl 2, 1 mM EDTA, 10 HEPES מ"מ, להתאים pH ל -7.5 ידי HCl | ||
| מניית Cycloheximide | 10 מ"ג / מ"ל במים. החנות 1 aliquots המ"ל ב -20 ° C. | ||
| Cytochalasin B המניות | 5 מ"ג / מ"ל בDMSO. אחסן 20 aliquots μl ב -20 ° C. | ||
| מניית Dithiothreitol (DTT) | M 1 במים. החנות 1 aliquots המ"ל ב -20 ° C. | ||
| ELB | 0.25 סוכרוז M, 1 mM DTT, 50 מיקרוגרם / המ"ל cycloheximide, 2.5 המ"מ MgCl 2, 50 mM KCl, 10 HEPES מ"מ, pH7.7 | ||
| Nocodazole המניות | 10 מ"ג / מ"ל בDMSO. אחסן 5 aliquots μl ב -80 ° C. | ||
| תערובת אנרגיה | פוספט 375 מ"מ קריאטין, 50 mM ATP, ו25 מ"מ MgCl 2. Aliquots נשמרים ב-80 ° C. | ||
| פתרון לצבוע גרעיני | 0.4 מיקרוגרם / המ"ל Hoechst 33258, גליצרול 25%(V / v), ב1x PBS | ||
| מניית Tautomycin | 100 מיקרומטר בDMSO. אחסן 10 aliquots μl ב -80 ° C. |
מקורות
- Lohka, M. J., Masui, Y. Formation in vitro of sperm pronuclei and mitotic chromosomes induced by amphibian ooplasmic components. Science. 220 (4598), 719-721 (1983).
- Cimprich, K. A., Cortez, D. ATR: an essential regulator of genome integrity. Nat. Re....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
