מאמר שיטה

הקפאת ES תאים אנושיים

DOI:

10.3791/50

⸱

12 באוקטובר 2006

 ,  , 
1Department of Molecular and Cell Biology, Harvard

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן אנו מדגימים כיצד במעבדה שלנו קופא גוונים האדם עובריים קווי גזע.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן אנו מדגימים כיצד במעבדה שלנו קופא גוונים האדם עובריים קווי גזע. תרבות בריאה, אקספוננציאלית הרחבת נשטף עם PBS להסיר התקשורת שיורי שיכול אחרת להרוות את התגובה טריפסין. חימם 0.05% טריפסין-EDTA הוא הוסיף אז כדי לכסות את תאים, הצלחת מותר דגירה של עד 5 דקות בטמפרטורת החדר. במהלך הזמן הזה התאים ניתן לראות עיגול, ומושבות מרימים את פני הצלחת. Pipetting חזר עדין יסיר מושבות תאים מפני השטח צלחת. תאים Trypsinized ממוקמים צינור חרוטי סטנדרטי המכיל מראש חימם התקשורת הס תא להרוות טריפסין הנותרים, וסובב אז. תאים הם resuspended התקשורת צמיחה בריכוז של כמיליון תאים למ"ל אחד בתקשורת, ריכוז כזה שאף אחד aliquot קפוא מספיקה כדי להחיות תרבות על צלחת 10 ס"מ. אחרי התאים resuspended כראוי, קרים כקרח התקשורת מקפיא נוסף בהיקף זהה. המתלים Cell מעורבבים היטב, aliquoted לתוך צלוחיות מקפיא, ואיפשר לאט לקפוא-80C מעל 24 שעות. תאים קפואים יכול מכן מועבר בשלב אדים של חנקן נוזלי לצורך אחסון לטווח ארוך, או להישאר כ -80 שישה חודשים.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. תרבות בריאה, אקספוננציאלית הרחבת נשטף עם PBS להסיר התקשורת שיורי שיכול אחרת להרוות את התגובה טריפסין.
  2. חימם 0.05% טריפסין-EDTA הוא הוסיף אז כדי לכסות את תאים, הצלחת מותר דגירה של עד 5 דקות בטמפרטורת החדר. במהלך הזמן הזה התאים ניתן לראות עיגול, ומושבות מרימים את פני הצלחת.
  3. Pipetting חזר עדין יסיר מושבות תאים מפני השטח צלחת.
  4. תאים Trypsinized ממוקמים צינור חרוטי סטנדרטי המכיל מראש חימם התקשורת הס תא להרוות טריפסין הנותרים, וסובב אז.
  5. תאים הם resuspended התקשורת צמיחה בריכוז של כמיליון תאים למ"ל אחד בתקשורת.
  6. אחרי התאים resuspended כראוי, קרים כקרח מדיה מקפיא נוסף בהיקף זהה.
  7. המתלים Cell מעורבבים היטב, aliquoted לתוך צלוחיות מקפיא, ואיפשר לאט לקפוא-80C מעל 24 שעות.
  8. תאים קפואים יכול מכן מועבר בשלב אדים של חנקן נוזלי לצורך אחסון לטווח ארוך, או להישאר כ -80 שישה חודשים.

הערה: כזה aliquot קפוא בריכוז של 106 תאים / מ"ל ​​מספיקה כדי להחיות תרבות על צלחת 10 ס"מ.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הטכניקה אנו מתארים עבור קווי גוונים תא הקפאה עובד היטב עבור אחסון יעיל להחיות גוונים שורות תאים וכן כל תא יונקים של עניין. הקפאת חלק קטן של תאים במעבר זה הוא שיקול חשוב בעת עבודה עם שורות הס התא, כמו הפרעות קריוטיפ יכול להתעורר תאים חריגים יכולים במהירות להשתלט על הקו. לפיכך, לאחר קפוא מפצלת במעבר בכל בנוסף הבנקים הגדולים על קטעים מסוימים רצוי מאוד.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
HuES בינונילסך של 651.5 מ"ל, הוסף: 500 מ"ל KO-DMEM + 6.5 מ"ל PenStrep + 6.5 מ"ל L-Glut + 6.5 מ"ל NEAA 6.5 מ"ל + בטא-מרקפט– תנול 0.6 ומיקרו; L (מלאי 14.3 מ') + תחליף סרום 65 מ"ל + 65 מ"ל פלסמנט + 0.65 מ"ל bFGF2 (~10 ננוגרם/מ"ל סופי)
מקפיא80% FCS (סרום עגל עוברי) + 20% DMSO (דימתיל סולפוקסיד). מאוחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
בינוני

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cowan, C. A. Derivation of Embryonic Stem Cells from Human Blastocysts. , 1650-1656 (2004).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Human Embryonic Stem CellsTrypsin EDTA TreatmentCell Freezing ProtocolCryopreservation MethodPBS Washing StepCentrifugation ProcedureFreezing Media AdditionSlow Freeze TechniqueLiquid Nitrogen StorageCell Thawing Process

מאמרים קשורים