מאמר שיטה

תיוג ממוקד של תאי עצב בתחומים ספציפיים מייקר פונקציונליים של הניאוקורטקס ידי שילוב אותות פנימיים והדמית שני פוטונים

DOI:

10.3791/50025

⸱

12 בדצמבר 2012

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Neuroscience, Medical University of South Carolina

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שיטה מתוארת לתיוג נוירונים עם צבעי ניאון בתחומי מייקר מראש תפקודיים של הניאוקורטקס. ראשית, דימות אופטי אות פנימית משמש להשגת מפה תפקודית. אז מיקרוסקופ שני פוטונים משמש לתווית ונוירונים תמונה בתוך תחום מייקרו של המפה.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בקליפת המוח החזותית הראשונית של יונקים שאינם מכרסמים, נוירונים מקובצים בהתאם להעדפותיהם לתכונות גירוי כגון כיוון 1-4, כיוון דומיננטי 5-7, 8,9 עיני ופער משקף 9. הסלקטיביות יווניות היא התכונה למדה הנרחב ביותר והמפה רציפה עם פריסת עין תקופתית לכיוון מועדף היא הווה על פני כל קליפת המוח החזותי הראשונית 10,11. שילוב התרומות סינפטיים, סלולריות ורשת המובילות לתגובות סלקטיבית גירוי במפות תפקודיות אלה מחייב את ההכלאה של שיטות הדמיה שמשתרעות על פני תת מיקרון לקשקשים מרחביים מילימטר. עם הדמית אות אופטית פנימית קונבנציונלית, הפריסה הכללית של מפות פונקציונליות על פני כל השטח של קליפת המוח החזותית ניתן לקבוע 12. הפיתוח של מיקרוסקופיה in vivo שני פוטונים באמצעות סיד צבעים רגישים מאפשר לאדם לקבוע synaptקלט ic מגיע קוצים הדנדריטים בודדים פעילות 13 או להקליט בו זמנית ממאה גופי תא עצביים בודדים 6,14. כתוצאה מכך, שילוב הדמית אות פנימית עם הרזולוציה מרחבית תת מיקרון של מיקרוסקופיה שני פוטונים מציע את האפשרות של קביעה בדיוק אילו מגזרים ותאים דנדריטיים לתרום לתחום המייקר של כל מפה תפקודית בהניאוקורטקס. כאן אנו מדגימים שיטת תשואה גבוהה להשגת מהירות מפת התמצאות קליפת מוח ומיקוד תחומים ספציפיים במייקר המפה פונקציונלית זו לתיוג נוירונים עם צבעי ניאון ביונקים שאינם מכרסמים. עם אותו מיקרוסקופ המשמש להדמית שני פוטונים, אנחנו מייצרים 1 מפת התמצאות באמצעות דימות אופטי אות פנימית. ואז אנו מראים כיצד למקד-תחום המיקרו של ריבית באמצעות micropipette עמוס צבע או לתווית אוכלוסייה של גופי תא עצביים או תווית נוירון כזה שדנדריטים, קוצים ואקסונים נראים באחתvivo. החידודים שלנו על פני שיטות הקודמות להקל בחינת מבנה יחסי תפקוד עצביים עם רזולוציה תת הסלולר במסגרת של ארכיטקטורות פונקציונליות neocortical.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. הכנת כירורגים

  1. לגרום להרדמה ורציפות לפקח על קצב לב, בסופו של גאות ושפל CO 2, EEG, וטמפרטורה. כל הנהלים אושרו על ידי טיפול בבעלי החיים המוסדיים ועדה השתמשה ומן האוניברסיטה לרפואה של דרום קרוליינה והתבססו על אלה שפורסמנו 9,15 בעבר.
  2. לחשוף את פני השטח הגבי של הגולגולת על ידי חיתוך העור בסכין אזמל. לנתח את רקמות חיבור המונחים על עצם שימוש במגרדת Brudon. נקה את עצם השימוש applicators חוד כותנה וכותנת גזה. החל שעוות עצם (לפי צורך) לגולגולת, כדי לעצור את הדימום מזדמן דרך ורידי שליח קטנים.
  3. צרף טיטניום או צלחת ראש נירוסטה לגולגולת (מעל האזור של עניין שבו יבוצע craniotomy) באמצעות מלט שיניים מעורבות בצבע שחור (ראה חומרים). פתח מלבני במרכז צלחת הראש מספק גישה לcraniotomy והדמיה אופטית. צרף קאמרי מתכת על גבי הצלחת בראש. חדר זה ישמש כמאגר לנוזל הדמיה עם העדשה האובייקטיבית הטבילה במים.
  4. להבטיח את הצלחת עד ראש xy שלב באמצעות עמודי מתכת.
  5. דק שטח גדול של העצם בתוך הפתח המלבני של headplate באמצעות מקדחת רופא שיניים. האזור לדילול חייב להרחיב גם מעבר לגבולות craniotomy המתוכנן. הגולגולת העבה של יונקים שאינם מכרסמים חייבת להיות דלילה אם תמונות ברזולוציה גבוהה שאפשר לרכוש מהניאוקורטקס כי באתר craniotomy, העובי של עצם יכתיב את העובי של agarose בין coverglass ומשטח neocortical (ראה בהמשך) .
  6. מקדחת x מתווית 2 2 מ"מ מרובעת בעצמות לcraniotomy. שטוף את התא מעת לעת עם נוזל השדרתי מלאכותי טרי (ACSF) להסיר ברי עצם ולהקטין את פיזור חום לקליפת המוח הבסיסית. החל שעוות עצם לפי צורך, כדי לעצור את הדימום מדי פעם.
  7. Lift דש העצם עם # 3 מלקחיים.
  8. הסר את כל אבל את השכבה התחתונה של דורה באמצעות מלקחי קנס (# 5CO) ומספרי אביב Vannas. הדורה ביונקים שאינם מכרסמים היא עבה ואטומה, אבל ניתן להסיר בשכבות נפרדות. דימום הוא נדיר, אך ניתן לעצור עם Gelfoam ושאריות דם צריכות להיות בעדינות להסיר את השכבה הנותרת של דורה באמצעות מלקחיים ושטיפה בACSF. השכבה הסופית של דורה היא שקופה וכלי pial צריכים להיות נראים בבירור דרכו. השארת השכבה האחרונה של דורה שלמה במהלך הדמית אות הפנימית תגדיל את שיעור ההצלחה של העמסת כמות גדולה של סידן אינדיקטורים ניאון לשלב הדמית שני הפוטונים הבאים של הניסוי (ראה דיון).
  9. תחול ירידה של 2% agarose החם (מומס בACSF) ולמקם coverglass מייד על פתיחת הגולגולת. בדקו craniotomy כדי להבטיח שפעימות לב וכלי דם ונשימה הן מינימאליות באמצעות מיקרוסקופ ניתוחי לנתח או oculars של שנימיקרוסקופ פוטון במצב בהיר תחום.

2. אותות אופטיים פנימית הדמיה

  1. הוסף ג'ל קצף ספוג ACSF סביב חלק החיצוני של coverglass למנוע agarose מההתייבשות במהלך הדמית אות הפנימית.
  2. צרף המצלמה הפנימית אות הדמית CCD ליציאת C-Mount הסטנדרטי על גבי מיקרוסקופ שני הפוטונים (איור 1). הנח את מקור האור מאיר על שולחן האוויר סמוך לבמת xy (איור 1 א). עמדה ולאבטח את מדריכי האור מעל craniotomy וheadplate / קאמרי (1B איור). לחזור בי Dichroic הראשוני ומראה, שמתחת C-Mount היציאה כך שהאור האדום משתקף נזקק לאותות פנימיים יעבור ישירות מcraniotomy למצלמת CCD (תרשים 1C-D). שימוש האובייקטיבי 4x אוויר (0.13 NA, 17 המ"מ WD), שדה 2 x 2 מ"מ של תצוגה הוא זמין להדמית אות פנימית.
  3. הכנס מסנן חום בlנתיב ight למנוע קליפה מהחימום. השתמש במסנן שמעביר אור הירוק (546 ננומטר מרכז λ) ולהקליט את תמונת התייחסות דיגיטלית של כלי הדם על פני השטח של קליפת המוח.
  4. העברת מוקד z ל500 מיקרומטר מתחת לפני שטח קליפת המוח. השתמש במסנן אדום (630 ננומטר מרכז λ) כדי להאיר את הקליפה למדידת אותות פנימיים. מקם את מדריכי אור כזה, שעל פני השטח של קליפת המוח הוא מוארים באופן אחיד. מגן craniotomy מהאור מיוצר על ידי תצוגת הגירוי החזותית. מציג רצף של גירויים חזותיים ותמונות נתוני reflectance שיא. כדי ליצור מפת התמצאות בתוך 10 דקות, לאסוף נתונים המתאימים 4 חזרות של רצף של 8 גירויים (4 כיוונים ושני כיוונים לכל כיוון).
  5. לנתח את נתוני אותות הפנימיים כדי ליצור מפת התמצאות צבע שווא. בחר אזורי היעד פוטנציאליים לתיוג שני פוטונים של תאי עצב, למשל, הייחודויות אורינטצית שבשבת - נקודות במפה שביכל האוריינטציות המועדפות מכונסות (איור 2 א). שכבת מפת ההתמצאות והדימוי של מערכת כלי הדם לפני שטח קליפת המוח (איור 2B-C). השתמש בפריסה של תחומים פונקציונליים ואת המיקום של ספינות שטח גדולות כדי לבחור יעד, הימנעות ממקומות עם כלי דם גדולים וarterioles 15.

3. טוען גורף של אינדיקטורים סיד פלורסנט

  1. הכן את הפתרון של Pluronic 20% / DMSO ידי הוספת Pluronic 1 גרם בDMSO 5 μl. מחמם את התערובת על 60 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, לפזר את Pluronic לחלוטין. לאפשר לתערובת להתקרר לטמפרטורת חדר. הוסף 4 μl של תערובת Pluronic / DMSO לבקבוקון 50 מיקרוגרם של מחוון סיד ניאון אורגון גרין 488 Bapta-1 בבוקר (OGB-1 בבוקר). ואז להוסיף μl 1 מתוך צבע אדום (אלקסה פלואוריד 594, 2 פתרון מניית מ"מ) ו35 μl של פתרון פיפטה (ראה חומרים) לריכוז סופי של 1 מ"מ OGB-1 AM. Sonicate הפתרון לשעה וחצי באמבטיה מקוררת מים ולאחר מכן סרכזת עם 0.45 מיקרומטר מסנן כדי להסיר זיהומים.
  2. משוך פיפטה להתחדד ארוכה עם קוטר קצה חיצוני של 2.0-2.5 מיקרומטר. טען 5 μl של תערובת הצבע לתוך פיפטה.
  3. הסר את השכבה האחרונה של דורה כדי להקל על החדרת פיפטה ולקבל את התמונות באיכות הגבוהה ביותר של שני הפוטונים.
  4. לקבוע את המיקום המדויק על פני קליפת המוח שפיפטה יש להציב על מנת להגיע ליעד שלו בקליפת מוח השכבה 2/3. היעד שנקבע מראש בקליפת המוח שלנו הוא ייחודיות שבשבת במפת ההתמצאות (איור 2). פיפטה חייבת להיות מונע אל קליפת המוח בזווית 30 מעלות כדי לעבור בין קיר החדר והאובייקטיבי. לכן, כדי לתייג את אזור היעד של 200 מיקרומטר מתחת לפני השטח של קליפת המוח, בעמדת כניסת פיפטה על פני קליפת המוח תהיה כ 350 מיקרומטר הרוחבי למיקום היעד (איור 3 א.ב.).
  5. להזיז את במת xy (שבחיה וpmicromanipulator ipette ממוקם) למרכז עמדת כניסת משטח קליפת המוח תחת אובייקטיבי (האיור 3C). השתמש אובייקטיבי 20x או 40X עם מרחק עבודה (WD) של לפחות 3 מ"מ (ראה חומרים) כדי להבטיח שפיפטה קלות תיכנס לקליפה בלי לגעת אובייקטיבי או העצם לאורך קיר craniotomy. ברגע שעמדת הכניסה מרוכזת תחת אובייקטיבי, להגביה את מיקום Z של המטרה על ידי 2 מ"מ (האיור 3D). עם האור הירוק עלית פלואורסצנטי מופעל לדמיין אלקסה צבע אדום בפיפטה, השתמש בציר האלכסוני של micromanipulator לעבור פיפטה עד שקצו הוא מרוכז (וממוקד) במטרה ישירות מעל עמדת כניסת משטח קליפת המוח ( איור 3E).
  6. מנמיך את פיפטה האנכית (לאורך ציר z) עד פיפטה מגיעה לפני השטח של קליפת המוח (איור 3F), ואילו ברציפות צפיית קצה פיפטה דרך OCUלארס של המיקרוסקופ. שימוש בתאורה בהירה שדה, כלי קליפת מוח משטח הדם וקרומי meningeal נותר (פיא והארכניאיד) הם נראים בקלות כפיפטה מתקרבת משטח קליפת המוח. אם פיפטה אינה מגיעה עמדת הרשומה הרצויה, להעלות את פיפטה ולכייל מחדש מיקוד המבוסס על ציוני דרך כלי הדם על פני השטח של קליפת המוח.
  7. הסר את המטרה, פתיל נוזל שדרה עודף מcraniotomy ולייבש את העצם הסמוך באמצעות חניתות קליטה נטולת מוך. תחול ירידה של 3% agarose החם (מומס בACSF) כדי לייצב את הקליפה שנראית מבעד לcraniotomy (האיור 3G). ב- מכרסמי עישון, 3% agarose יש צורך לצנן את הפעימות לספיגה מוצלחת של צבעי ניאון על ידי נוירונים. עבור דימות אופטי אות פנימית רק 2% agarose נדרש משום ששילוב של 2% agarose וcoverglass מספק את היציבות הדרושה. הנה, לא coverglass משמש לצעד לצבוע טעינה כך 3% agarose הואצורך. לאחר agarose בסס, הכנס אובייקטיבי 40X (0.8 NA, 3.3 המ"מ WD) ולמלא מחדש את בית הנבחרים בACSF.
  8. לעבור משדה בהיר לצפיית שני פוטונים ולאתר את קצה פיפטה. שימוש בציר האלכסוני של micromanipulator, הזז את פיפטה עד שקצו מגיע לעומק הרצוי בקליפת המוח (האיור 3H). פחזניים פליטת לחץ מזדמן של תערובת הצבע (כמה psi, דופק בכל 0.1 שניות) יסייעו למנוע קצה פיפטה מסתימה. בגלל OGB-1:00 הופך גלוי רק על להיכנס לתאים, האדום אלקסה הצבע הוא קריטי להדמיה של קצה פיפטה בתוך הקליפה.
  9. לפני שתנסה לטעון נוירונים בקליפת מוח השכבה 2/3 במינון המלא של צבע, מחדש להתמקד במטרה על פני קליפת המוח כדי לאשר את העומק של קצה פיפטה ולהבטיח שהקצה הוא במיקום היעד מבוסס על הפריסה של כלי דם על פני שטח. אם פיפטה היא בשכבה 2/3, שאיפות קטנות של תערובת הצבע צריכות להאירחלל חוץ תאי ולחשוף הרכבה צפופה של גופי תא מעגליים כצללים כהים.
  10. לטעינת גופי תא עצביים בתחום קוטר מיקרומטר קליפה 300-600, מזריק את תערובת הצבע לתוך חלל החוץ התאי באמצעות 30-90 פעימות, דופק בכל 1.0 שנייה, 2-10 psi. פולסים של לחץ לא צריכים להיות כל כך חזקים שהרקמה עוברת. לאחר ההזרקה היא מוחלטת, לחכות כמה דקות, ואז להסיר את הצינורית והאובייקטיבית. חכה לשעה 1 כדי לאפשר OGB-1 בבוקר ועד שנלקח במלוא על ידי נוירונים.
  11. הסר את agarose משמש לטעינת הצבע ולשטוף תא ההקלטה. שים טיפה קטנה של 2-3% agarose על פני שטח ואת מקום coverglass מעל craniotomy במהירות. בגלל צבעי הניאון הם רגישים לאור, להימנע מחשיפת יתר בקליפת המוח לשדה בהיר או אור הניאון עלית. הכנס NA (1.0) 20x אובייקטיבי גבוהה לבעל האובייקטיבי ומחדש מרכז אזור קליפת המוח מתויג תחת אובייקטיבי באמצעות שלב xy. מגן craniotomy מאקסמקורות traneous אור, למשל, תצוגת גירוי חזותית, תוך שימוש במספר שכבות של חומר אפל.

4. Electroporation תא בודד של צבעי ניאון

  1. ללימוד מורפולוגיה הדנדריטים, להכין תמיסה של מיקרומטר Alexa פלואוריד 100 594 (01:20 דילול בACSF מתוך 594 מניות 2 מ"מ Alexa פלואוריד). להדמיה תפקודית של הדנדריטים מלח OGB ניתן להשתמש 16,17.
  2. משוך פיפטה להתחדד ארוכה עם גודל קצה 1 מיקרומטר ולטעון 5 μl של צבע לתוך פיפטה. כל הצעדים האחרים של מיקוד תחום תפקודי זהים לשיטת הטעינה בתפזורת (תרשימי 1-3). כדי למקם את קצה פיפטה סמוך לממברנת גוף תא עצבית, לפקח על העלייה בעכבת אלקטרודה ולהחיל פחזניים לחץ של צבע כדי להאיר את חלל החוץ התאי ולראות גופי תא כצללים במהלך הדמית שני פוטונים.
  3. כאשר קצה פיפטה צמוד לממברנת גוף תא עצבית, השתמש 800A Axoporator ליישםקטניות (1-3 -8 ל -10 וולט, 10 אלפיות דופק). המילוי המיידי של נוירון עם צבע הוא בקלות דמיין עם מיקרוסקופ שני פוטונים. הסר את פיפטה ולאסוף תמונות ברזולוציה גבוהה של דנדריטים ואקסונים in vivo.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כדי להמחיש את הדיוק של שיטות תיוג הצבע שלנו, אנחנו ממוקדים בתחום מייקרו הקטן ביותר של כל מפה פונקציונלית ידועה בניאוקורטקס אינם המכרסם. מנוקד בדלילות לאורך מפת ההתמצאות בקליפת הראייה העיקרית הם נדירים. אלה מתרחשים בנקודות בי כל הכיוונים המועדפים להתכנס כך שבשנת צבע מפות שווא של נטייה מועדפת, האזורים מסביב למראה הייחודי כמו "גלגלי רוח" (איור 2A-B). אחד סבב לcraniotomy נבחר לצבע תיוג (העיגול ירוק באיור 2C), להיות בטוח, כדי למנוע וכלי arterioles גדול...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מציגים שיטה למקד את התיוג של גופי תאים עצביים (או דנדריטים ואקסונים) בתחומי מייקרו תפקודיים שנקבעו מראש של הניאוקורטקס. מיזוג הדמיה אופטית אות פנימית עם מיקרוסקופ שני פוטונים מציע אפשרות לקביעת שהסינפסות ותאים לתרום לתחום המייקר של כל מפה, בין אם פונקציונלית קושרי סלקטיביות עצבית עם מיקומו של תא העצב במפה פונקציונלית, ומעגל העצבי רכיבים שהשינוי בחוויה חזותית 7 או יישום קליני תרופות טיפוליות 18.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהמכון הלאומי עין R01EY017925 וR21EY020985 ומימון מהיסודות דנה וייטהול לPK אנו מודים גם מתיו Petrella לסיוע בפעולות כירורגיות; גרייס הדיון לאיתור הדנדריטים המוצגים באיור 5A; וPratik Chhatbar עבור הערות על כתב היד.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
שם מגיב / חומרים חברה מספר קטלוגים תגובות
1. תמיכת חיים / ניסוי מכין
Isoflurane וטרינר ובסטר NDC 57319-474-05
מאדה isoflurane Midmark VIP 3000
חימום שמיכת משוב מוסדרת הרווארד Apparatus 50-7079F
א.ק.ג. לפקח Digicare יורפואית LifeWindow לייט
מגבר EEG מערכות AM 1800
צג התצוגה EEG היולט פקארד 78304A
בסופו 2 צג CO גאות RESPIRONICS Novametrix Capnoguard 1265 לייעל אוורור
שבבי מקדח קרביד לעצם קידוח הנרי שיין בסדר (0.5 מ"מ קצה) וגס (1.25 טיפ מ"מ)
מלט לheadplate / קאמרי Dentsply 675571, 675572
צבע שחור אבקת טמפרה סרג'נט האמנות בע"מ 22-7185 הוסף למלט כדי לשפר אור מיגון ולצמצם השתקפויות
Agarose - סוג III- סיגמא A9793 לצמצום פעימות במהלך אות הפנימית והדמית שני פוטונים
Coverglass: קוטר 5 או 8 מ"מ, עובי 0.17 מ"מ דיוק בעולםstruments 502040, 502041 לצמצום פעימות במהלך ההדמיה, coverglass ניתן לחתוך לפי צורך
curettes Brudon ג'ורג' Tiemann 105-715-0, 105-715-3 ניקוי משטח גולגולת
שעוות עצם Ethicon W31G מהירות לעצור את הדימום
כותנת כטיפ מוליך מדעי מיקרוסקופ אלקטרונים 72308-05 משטח עצם נקי ויבש
דומון # 5CO מלקחיים כלי מדע פיין 11295-20 תפוס שכבות בודדות של דורה או פחז
Vannas מספרי האביב כלי מדע פיין 15000-03 Cut דורה
Gelfoam פייזר 09-0396-05 כדי לעצור את הדימום בדורה
חניתות קליטה כלי מדע פיין 18105-01 פתילת אולטרה מהיר ונטול מוך של CSF
חומרי Blackout Thorlabs BK5 החומה craniotomy
2. לצבוע הכנה / זריקה
Sulphoxide דימתיל (DMSO) סיגמא D2650
Pluronic סיגמא P2443
אורגון גרין 488 Bapta-01:00 Invitrogen O6807 מחוון סידן
Alexa פלואוריד 594 Invitrogen A10438
מסנן צנטריפוגלי (0.45 גודל נקבובי מיקרומטר) Millipore UFC30HV00 כדי להסיר זיהומים לפני ההזרקה
זכוכית פיפטה חולץ סאטר מכשירים P97
ורוסיליקט זכוכית filamented נימים (בקוטר 1.5 מ"מ חיצוני) מכשירי Precision העולם 1B150F-4 פיפטה הפליטה דיי
Microloader אפנדורף 5242 956 003 לטעינת צבע לתוך פיפטה
Micromanipulator סאטר מכשירים MP-285 כדי למקם פיפטה
בקר דופק לחץ פארקר Hannifin PicoSpritzer III להזרקת לחץ של הצבע
electroporator תא בודד התקנים מולקולריים Axoporator 800A לelectroporation של הצבע
3. העצמותי imaגינג
מטרת 4x (0.13 NA, 17 המ"מ WD) אולימפוס UPLFLN4X
חומרה / תוכנה פנימית אופטי הדמיה בע"מ Imager 3001 / VDAQ תוכנת VDAQ משמשת להדמית אפיזודי
CCD מצלמה Adimec Adimec-1000
אספקת חשמל מקור אור KEPCO ATE 15-15 מ'
מקור אור אופטי הדמיה בע"מ HAL 100 עוצמת אור על פני השטח של קליפת המוח היא 3-5 mW
גרין מסנן (לתמונת כלי דם) אופטי הדמיה בע"מ λ = 546 ננומטר (30 ננומטר bandpass) לתמונת התייחסות של מערכת כלי דם לפני שטח
מסנן אדום (לאות פנימית) האופטי Imaging בע"מ λ = 630 ננומטר (30 ננומטר bandpass) כדי לאסוף את האותות פנימיים
חום מסנן אופטי הדמיה בע"מ KG-1
4. שני פוטוני אסדה / הדמיה
מיקרוסקופ שני פוטונים ותוכנה טכנולוגיות ערבה ראה שן et al. 2012 לנתיב אור, מסננים וכוח הליזר
טי: ספיר ליזר ספקטרה-פיסיקה מאי טאי XF
20x (0.5 NA; 3.5 המ"מ WD) אולימפוס UMPLFLN20X מטרת 0.5 NA משמשת רק ליישור פיפטה מעל craniotomy (לא עבור הדמית 2 פוטון)
20x (1.0 NA; 2.0 המ"מ WD) אולימפוס XLUMPLFLN20X
40X (0.8 NA; 3.3 המ"מ WD) אולימפוס LUMPLFLN40X/IR
שולחן אוויר ניופורט ST-200 הכנה מבודדת מתנודות חיצוניות
שלב xy של מייק המכונית ושות (Attleboro, MA) נושא ניסוי וmicromanipulator סאטר הונח על במת xy
מתכונים
נוזלים מלאכותיים Cerebro-Spinal NaCl (135 מ"מ), KCl (5.4 מ"מ), MgCl 2 (1.0 מ"מ), CaCl 2 (1.8 מ"מ), HEPES (5 מ"מ), 7.4 pH
פתרון פיפטה 14 NaCl (150 מ"מ), KCl (2.5 מ"מ), HEPES (10 מ"מ), 7.4 pH

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Blasdel, G. G., Salama, G. Voltage-sensitive dyes reveal a modular organization in monkey striate cortex. Nature. 321, 579-585 (1986).
  2. Grinvald, A., Lieke, E., Frostig, R. D., Gilbert, C. D., Wiesel, T. N. Functional architecture of cortex revealed by optical imaging of intrinsic signals. Nature. 324, 361-364 (1986).
  3. Bonhoeffer, T., Grinvald, A. Iso-orientation domains in cat visual cortex are arranged in pinwheel-like patterns. Nature. 353, 429-431 (1991).
  4. Ohki, K., et al. Highly ordered arrangement of single neurons in orientation pinwheels. Nature. 442, 925-928 (2006).
  5. Shmuel, A., Grinvald, A. Functional organization for direction of motion and its relationship to orientation maps in cat area 18. J. Neurosci. 16, 6945-6964 (1996).
  6. Ohki, K., Chung, S., Ch'ng, Y. H., Kara, P., Reid, R. C. Functional imaging with cellular resolution reveals precise micro-architecture in visual cortex. Nature. 433, 597-603 (2005).
  7. Li, Y., Van Hooser, S. D., Mazurek, M., White, L. E., Fitzpatrick, D. Experience with moving visual stimuli drives the early development of cortical direction selectivity. Nature. 456, 952-956 (2008).
  8. Bonhoeffer, T., Kim, D. S., Malonek, D., Shoham, D., Grinvald, A. Optical imaging of the layout of functional domains in area 17 and across the area 17/18 border in cat visual cortex. Eur. J. Neurosci. 7, 1973-1988 (1995).
  9. Kara, P., Boyd, J. D. A micro-architecture for binocular disparity and ocular dominance in visual cortex. Nature. 458, 627-631 (2009).
  10. da Costa, N. M., Martin, K. A. Whose Cortical Column Would that Be. Frontiers in Neuroanatomy. 4, 16(2010).
  11. Kaschube, M., et al. Universality in the evolution of orientation columns in the visual cortex. Science. 330, 1113-1116 (2010).
  12. Villeneuve, M. Y., Vanni, M. P., Casanova, C. Modular organization in area 21a of the cat revealed by optical imaging: comparison with the primary visual cortex. Neuroscience. 164, 1320-1333 (2009).
  13. Chen, X., Leischner, U., Rochefort, N. L., Nelken, I., Konnerth, A. Functional mapping of single spines in cortical neurons in vivo. Nature. 475, 501-505 (2011).
  14. Stosiek, C., Garaschuk, O., Holthoff, K., Konnerth, A. In vivo two-photon calcium imaging of neuronal networks. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 7319-7324 (2003).
  15. Shen, Z., Lu, Z., Chhatbar, P. Y., O'Herron, P., Kara, P. An artery-specific fluorescent dye for studying neurovascular coupling. Nat. Methods. 9, 273-276 (2012).
  16. Nevian, T., Helmchen, F. Calcium indicator loading of neurons using single-cell electroporation. Pflugers Archiv. 454, 675-688 (2007).
  17. Kitamura, K., Judkewitz, B., Kano, M., Denk, W., Hausser, M. Targeted patch-clamp recordings and single-cell electroporation of unlabeled neurons in vivo. Nat. Methods. 5, 61-67 (2008).
  18. Pohl-Guimaraes, F., Krahe, T. E., Medina, A. E. Early valproic acid exposure alters functional organization in the primary visual cortex. Exp. Neurol. 228, 138-148 (2011).
  19. Bock, D. D., et al. Network anatomy and in vivo physiology of visual cortical neurons. Nature. 471, 177-182 (2011).
  20. Rochefort, N. L., et al. Development of direction selectivity in mouse cortical neurons. Neuron. 71, 425-432 (2011).
  21. Mrsic-Flogel, T. D., et al. Homeostatic regulation of eye-specific responses in visual cortex during ocular dominance plasticity. Neuron. 54, 961-972 (2007).
  22. Bonhoeffer, T., Grinvald, A. Optical Imaging Based on Intrinsic Signals. Brain mapping: The Methods. Toga, A. W., Mazziotta, J. C. , Academic Press. San Diego. 55-97 (1996).
  23. Kerr, J. N., Greenberg, D., Helmchen, F. Imaging input and output of neocortical networks in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 14063-14068 (2005).
  24. Hofer, S. B., et al. Differential connectivity and response dynamics of excitatory and inhibitory neurons in visual cortex. Nat. Neurosci. 14, 1045-1052 (2011).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Intrinsic Signal ImagingTwo photon MicroscopyOrientation MapNeuron LabelingFunctional Micro domainCortical ImagingFluorescent DyeSingle Neuron ResolutionVisual CortexSub cellular Resolution

מאמרים קשורים