אנו מציגים פרוטוקול להקפאה וcryosectioning קהילות שמרים להתבונן דפוסים הפנימיים של תאי ניאון. השיטה מסתמכת על מתנול, תיקון ואוקטובר הטבעה-לשמר את הפיזור המרחבי של תאים ללא inactivating חלבוני ניאון בתוך קהילה.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
Cryosectioning קהילות שמרים לבחינת דפוסי פלואורסצנטי
במאמר זה
סיכום
תקציר
חיידקים בדרך כלל לגור ביישובים. הארגון המרחבי של תאים בתוך קהילה הוא האמין כדי להשפיע על ההישרדות והתפקוד של הקהילה 1. שיטות אופטיות, כולל חתך מיקרוסקופיה confocal ושני פוטונים, הוכיחו שימושיות להתבוננות ארגון המרחבי של קהילות חיידקים וarchaeal 2,3. שילוב של הדמית confocal וחתך פיזי של מושבות שמרים חשף ארגון הפנימי של תאים 4. עם זאת, חתך אופטי ישיר באמצעות מיקרוסקופיה confocal או שני פוטונים הצליח רק להגיע לכמה שכבות תאים עמוקים לתוך מושבות שמרים. מגבלה זו עשויה בגלל פיזור אור חזק מתאי שמרים 4.
כאן, אנו מציגים שיטה המבוססת על התיקון וcryosectioning להשיג פיזור המרחבי של תאי ניאון בתוך קהילות cerevisiae Saccharomyces. אנו משתמשים במתנול כסוכן מקבעכדי לשמר את הפריסה המרחבית של תאים. קהילות קבועות הם הסתננו עם מתחם אוקטובר, קפוא, וcryosectioned בcryostat. דימות פלואורסצנטי מהסעיפים חושפת את הארגון הפנימי של תאי ניאון בקהילה.
דוגמאות לקהילות שמרים הכוללות זנים המבטאים חלבוני ניאון אדומים וירוקים מדגימות את הפוטנציאל של שיטת cryosectioning כדי לחשוף את הפיזור המרחבי של תאי ניאון כמו גם זה של ביטוי גנים במושבות שמרים 2,3. למרות ההתמקדות שלנו הייתה בקהילות cerevisiae Saccharomyces, באותה השיטה יכולה באופן פוטנציאלי להיות מיושמת לבחון קהילות חיידקים אחרות.
פרוטוקול
1. תיקון קהילות שמרים
- לגדול קהילות שמרים על קרום מסנן (למשל, Millipore MF קרום מסנן; 2A איור). פרוטוקול זה מתאים לקהילה טיפוסית של פחות מ 2x10 8 תאים במסנן 6 מ"מ בקוטר הממברנה.
- השתמש בפיסת נייר סינון Whatman 541 כדי לכסות את תחתית סנטימטר בקוטר 1 היטב (איור 2 ב '). נייר Whatman זה ישמש כנישא להעברת הקהילה בשלבים מאוחר יותר. הוסף 1 המ"ל מתנול 100% לטובים, ולהשאיר גם ב-20 ° C לטמפרטורה לאזן.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
תמונות פלואורסצנציה של חתכים אנכיים של קהילות שמרים המכילות אוכלוסיות לאדומות וירוק מתויגות תחרותיות 6 מוצגות באיור 3. קהילות אלה מורכבות משני זני prototrophic של שמרים והתחרות שלהם למשאבים משותפים, כולל שטח, מובילות לעמודי 7 דפוסים, כפי שהיא מוצגות בחתכים האנכיים שלהם. החלטות עד לתא בודד ניתן לפתור בחתכים. איור 3 משווה חתכי רוחב של קהילות לשכפל הושגו עם (תחתון) וללא מתנול-קיבוע (למעלה), בעקבות הפרוטוקולים באיור 1.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
ההליך שהוצג כאן מציע דרך כדי להתבונן במבנה הפנימי של קהילות שמרים. צעד קיבוע מתנול הופך את מושבת השמרים נוקשה 8 ושומר על שלמותה של המושבה, ואולם, הוא גם גורם להתכווצות 8 שצריכים להילקח בחשבון בלפרש את התוצאות. אנחנו בדרך כלל רואים סביב 30% התכווצות בגובה של מושבות שמרים, בהשוואה למושבות משובצות ישירות באוקטובר ללא תיקון 9.
כדי למנוע התכווצות, גישה חלופית לcryosectioning היא ישירות.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
אין ניגודי האינטרסים הכריזו.
תודות
אנו רוצים להודות ליונתן קופר מעבדה בפרד האצ'ינסון לחקר הסרטן לרשות להשתמש cryostat. עבודה זו נתמכה על ידי NIH וקק WM קרן. BM הוא עמית גורדון ובטי מור של קרן לחקר מדעי חיים. אנו מודים לדניאל Gottschling הפרוטוקול לשיתוף קיבועו איתנו.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| שם המגיב | חברה | מספר קטלוגים | תגובות (אופציונלי) |
| 100% מתנול | JT בייקר | 9070-01 | |
| מתחם רקמות-Tek אוקטובר | Andwin מדעי | 4583 | |
| Whatman כיתת מספר 541 נייר סינון כמותית | Whatman | 1541-047 | |
| Millipore-MF ממברנה סינון | Millipore | HAWP04700 | |
| Cryostat | ליקה | CM 1510 S |
מקורות
- Tolker-Nielsen, T., Molin, S. Spatial Organization of Microbial Biofilm Communities. Microbial Ecology. 40 (2), 75-84 (2000).
- Moller, S., et al. In Situ Gene Expression in Mixed-Culture Biofilms: Evidence of Metabolic Inter....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
