הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

הכנת כרומוזום מתאים בתרבית

83.5K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/50203

⸱

28 בינואר 2014

 ,  , 
1Department of Genetics, Louisiana State University Health Science Center

במאמר זה

סיכום

יכולים להיות מבודדים הכרומוזומים מתאי חיים כגון לימפוציטים או fibroblasts עור, ומאורגניזמים כולל בני אדם או עכברים. הכנות כרומוזום אלה יכולים להיות מנוצלים נוספים עבור ה-G-פסים שיגרתי ונהלים ציטוגנטית מולקולריים כגון הקרינה הכלאה באתרו (FISH), הכלאה השוואתית גנומית (CGH), וkaryotyping ספקטרלי (SKY).

תקציר

ניתוח כרומוזום (ציטוגנטית) נמצא בשימוש נרחב לגילוי של חוסר יציבות כרומוזום. כאשר אחריו ה-G-פסים וטכניקות מולקולריות כגון הקרינה הכלאה באתרו (FISH), יש assay זה את היכולת רבת עוצמה לניתוח תאים בודדים לסטיות שכוללות רווחים או הפסדים מחלקים של הגנום ושחלופים מעורבים כרומוזומים אחד או יותר. בבני אדם, מומים כרומוזום מתרחשים בכ 1 לכל 160 לידה חי 1,2, 60-80% מכלל הפלות 3,4, 10% מלידה מתות 2,5, 13% מאנשים עם מחלת לב מולדת 6, 3-6% מהמקרים בעיות פוריות 2, ואצל חולים רבים עם עיכוב התפתחותי ומומים מולדים 7. ניתוח ציטוגנטית של ממאירות משמש באופן שגרתי על ידי חוקרים וקלינאים, כמו תצפיות של פגמים בכרומוזומים משובטים הוכחו יש גם משמעות דיאגנוסטית ופרוגנוסטית 8,9.60; בידוד כרומוזום לא יסולא בפז עבור ריפוי גנטי ומחקר בתאי גזע של יצורים כוללים פרימטים ומכרסמים 10-13 לא אנושיים.

יכולים להיות מבודדים הכרומוזומים מהתאים של רקמות חיות, ובכלל זה לימפוציטים בדם, fibroblasts עור, amniocytes, שליה, מח עצם, ודגימות גידול. כרומוזומים מנותחים בשלב metaphase של מיטוזה, כאשר הם מרוכזים ביותר, ולכן בצורה ברורה יותר לעין. הצעד הראשון של טכניקת בידוד כרומוזום כרוך השיבוש של סיבי הכישור ידי דגירה עם Colcemid, כדי למנוע את התאים מפני שתמשיך לשלב anaphase שלאחר מכן. לאחר מכן טופלו התאים עם פתרון hypotonic והשתמרו במצב הנפוח שלהם עם המקבע של Carnoy. לאחר מכן התאים נפלו על שקופיות ואז יכולים להיות מנוצל עבור מגוון רחב של נהלים. G-banding כרוך טיפול טריפסין ואחרי צביעה עם Giemsa כדי ליצור אור אופייני ופסים כהים. אותו יחסי הציבורocedure לבודד את הכרומוזומים יכול לשמש להכנת תאים להליכים כגון הקרינה הכלאה באתרו (FISH), הכלאה השוואתית גנומית (CGH), וkaryotyping ספקטרלי (SKY) 14,15.

מבוא

ניתוח כרומוזום הוא טכניקה קונבנציונלית מנוצל ברחבי העולם כדי לאבחן חוסר יציבות כרומוזום ושחלופים שמובילות להפרעות גנטיות ו1,2,8,9 ממאירות. בנוסף, ברזולוציה גבוהה יותר לאבחון והמחקר של מומים גנטיים חוקתיים והסרטן רכשה ניתן להשיג עם השילוב של הנהלים הקלאסיים ציטוגנטית ומתודולוגיות ציטוגנטית מולקולריות כגון הקרינה הכלאה באתרו (FISH), הכלאה גנומית השוואתית (CGH) , וkaryotyping ספקטרלי (SKY) 14,15. לאחרונה, טכניקות אלה כבר נוצלו להערכה של חוסר יציבות כרומוזום קשור עם מחקר בתאי גזע. מומים Karyotypic כגון aneuploidy של תאים לטווח ארוך בתרבית עוברית (ES) ותאי גזע בוגרים של אורגניזמים שונים שדווחו על ידי מעבדות מרובות. הראיות אחרונות תומכת שבכמה שורות תאי מטבעם נוטים יותר instabi כרומוזוםlity ללא קשר לתנאי תרבות. מסיבה זו, בעת הקמת ו / או שמירה על אדם, עכבר, או שורות תאי גזע רזוס, ניתוח כרומוזום מומלץ כחלק מתהליך בקרת איכות. דיווחים רבים לתאר את העניין הגובר בשימוש בציטוגנטיקה השגרתית והמולקולרית כדי לפקח על היציבות בכרומוזומים של תאי גזע ותאים ממאירים או אורגניזמים שונים בתרבות 10-13. פרוטוקולים אלה הם יותר ויותר בשימוש על ידי מעבדות לא גנטיות להערכה כרומוזומלית מהירה של התאים בתרבית שלהם 13. אנו מציגים הנהלים הבסיסיים שלנו להכנת כרומוזום מסוגי תאים שונים, אשר יכול להיות מיושמים למטרות מחקריות וקליניות ובתאים שמקורם אורגניזמים שונים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. קציר כרומוזום של תאים חסידים

  1. פרוטוקול סטנדרטי
    1. לגדל תאים בהתאם לתנאי culturing התא ספציפיים. כאשר התאים הגיעו שלב לוגריתמים (confluency 80%), להוסיף 10 μl / מיליליטר של Colcemid לבקבוק תרבית תאים. מינימום של 2 x 10 6 תאים מומלץ.
    2. דגירה תאים ב 37 מעלות צלזיוס ב5% CO 2 באינקובטור במשך 45 דקות. באמצעות פיפטה סטרילית, להעביר מדיה מהתאים לתוך צינור חרוטי 15 מיליליטר. מניח בצד.
    3. לשטוף בעדינות את התאים על ידי הוספת 2 מיליליטר של HBSS הצפת לתוך הבקבוק. מערבולת חיץ ולאחר מכן להסיר בעזרת פיפטה. בטל.
    4. הוסף 1 מיליליטר של טריפסין, מה שמבטיח שהוא מכסה את כל פני השטח של הבקבוק. להשאיר רק את התאים בטריפסין למשך כ -2 דקות. לאחר שרוב התאים יש מנותקים, פיפטה התקשורת בצינור חרוטי חזרה אל התאים.
    5. מעביר את ההשעיה התא ב10 aliquots מיליליטר לתוך צינורות חרוטי 15 מיליליטר.צנטריפוגה ב XG 200 10 דקות. הסר supernatant ו resuspend את הכדור.
    6. הוסף 10 מיליליטר של 0.075 M KCl אשר כבר prewarmed ל37 ° C עד גלולה שנותרה בצינור חרוטי. צינור וורטקס במהירות בינונית לערבב KCl ותאים.
    7. דגירה תאים ב 37 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. צנטריפוגה ב XG 200 במשך 5 דקות ב25 ° C. הסר supernatant (עד כ 0.5 מיליליטר שרידים) וגלול resuspend.
    8. בזהירות להוסיף 5 מיליליטר של המקבע של Carnoy הטרי (3:1 יחס של מתנול: חומצה אצטית קרחונית) לתאים תוך vortexing. לאחר מכן להוסיף 5 מיליליטר יותר מקבע בלי vortexing עבור סכום כולל של 10 מיליליטר.
    9. צנטריפוגה ב XG 200 למשך 5 דקות. הסרת תאי supernatant ו resuspend. הוסף 5 מיליליטר של מקבע לצינור אחד.
    10. צנטריפוגה ב XG 200 למשך 5 דקות. הסרת תאי supernatant ו resuspend. הוסף 5 מיליליטר של מקבע לצינור אחד. כעת ניתן לאחסן את התאים ב4 מעלות צלזיוס למשך עד שנה אחת.
  2. שינוי לפרוטוקול: harvesti כרומוזוםננוגרם של שורות תאי lymphoblastoid
    1. לגדל תאים בהתאם לתנאי culturing התא ספציפיים. (שימוש בבקבוקון מתאים לכמות של תאים בתרבית). כאשר התאים הגיעו שלב לוגריתמים (כ 2 ימים לאחר התאים מפוצלים), להוסיף 10 μl / מיליליטר של Colcemid לבקבוק תרבית תאים.
  3. שינוי לפרוטוקול: קצירת כרומוזום מכל דם
    Phytohemagglutinin (PHA), לקטינים הנגזרים משעועית הכליה האדומה, הוא mitogen עוצמה לתאי T אנושיים 16. 72 שעות לאחר התוספת של PHA לתרבות, על 45% מתאים נמצאים בשלב S. זה מייצג את הפעילות המיטוטי שיא, והוא הנקודה האופטימלית שבו למסוק ללימודי כרומוזום. mitogens אחרת כגון פיטולקה (1-10 מיקרוגרם / מיליליטר) ניתן להשתמש בו בעת ניתוח תאי B 17,18.
    1. לאסוף לפחות 1 מיליליטר של דם מלא בצינור הפרין סודיום העליון ירוק. השתמש בתוך 3 ימים לאחר גבייה. דם חנות ב RT בלתיtil מוכן לשימוש.
    2. Aliquot 0.25 מיליליטר של דם מלא ב10 מיליליטר של מדיה מלאה RPMI המכילה L-גלוטמין (20% בסרום שור עוברי, 1% פניצילין / סטרפטומיצין, fungizone 1%, וPHA 1%). תרבות על 37 ° C עם 5% CO 2.
  4. שינוי לפרוטוקול: קצירת כרומוזום ממח העצם
    ניתוח ציטוגנטית במח עצם הוא מועיל בפרעות המטולוגיות ממאירות רבות כתצפית של שיבוט chromosomally חריג עשויה להיות אבחון לסוג מסוים של סרטן דם. מחקרי כרומוזום משמשים גם כדי להעריך את התקדמות מחלה, כגון תחילת משבר פיצוץ ותגובה לטיפול. מכיוון שתאי מח העצם באופן פעיל בחלוקה, לא גירוי mitogen הוא 9,19 צורך. לוקמיה חריפה 24 ו48 תרבויות שעה גם להגדיר.
    1. לאסוף לפחות 1 מיליליטר של מח עצם בצינור הפרין סודיום העליון ירוק. Aliquot 0.25 מיליליטר של מח עצם ב10 מיליליטר של מדיה מלאה RPMI המכילה L-גלוטמין (20% בסרום שור עוברי, 1% פניצילין / סטרפטומיצין, fungizone 1%). תרבות על 37 ° C עם 5% CO 2.

2. שקופיות הכנה ומכתים מוצק

הערכה מהירה של שקופית אחת נציג תספק מידע על איכות היבול לפני שתמשיך להליכים נוספים כגון G-banding, FISH, CGH, או SKY. מעבדות שמעדיפות כתם מוצק התאים לקציר מהיר והערכת כרומוזום. לחלופין, מיקרוסקופ לעומת שלב ניתן להשתמש בניתוח זה. שקופיות מוכנות הטובים ביותר כאשר הלחות היא כ 50% וסביבת הטמפרטורה (20-25 ° C).

  1. צנטריפוגה התאים ב XG 200 במשך 5 דקות ב25 ° C. הסר את supernatant עד שרק 0.3-0.5 מיליליטר שרידים.
  2. לאחר בעדינות resuspending גלולה, שלוש טיפות פיפטה של ​​ההשעיה התא ממרחק של כ 2 בשקופית אשר נטויה בזווית של כ 45 ° ולאפשר ההשעיהלגלגל על ​​פני השקופית. הוסף טיפה אחת גדולה של המקבע של Carnoy הטרי לשקופית.
  3. ייבש את הגב של השקופית על מגבת נייר ולאחר מכן לשבת השקופיות לייבוש לפחות 10 דקות. השקופית צריכה להיות יבשה לחלוטין.
  4. הכן טרי Giemsa מכתים פתרון (3:1 יחס Gurr הצפת וGiemsa הכתם). מניחים את השקופיות על מדף מכתים. לכסות את השקופית כולה בפתרון מכתים Giemsa. בואו השקופיות יישארו בפתרון מכתים למשך 5 דקות. יש לשטוף את השקופיות עם מים מזוקקים, לטמיון, ולאפשר לאוויר יבש.
  5. הוסף 4 טיפות של Permount ולהחליק את מכסה לשקופית. ודא שאין בועות מתחת coverslip. Permount העודף ניתן להסיר עם מגבת נייר.
  6. נתח את התאים עם מיקרוסקופ אור בהגדלה 10X ו100X. אם תאי metaphase נמצאים בשפע וגם התפשטות, השקופיות שנותרו יכולות לשמש לפרוצדורות אחרות.

3. G-Banding באמצעות טריפסין וGiemsa (GTG)

טריפסין הוא אנזים פרוטאוליטי הdenatures ההיסטונים euchromatic באזורי DNA עם פעילות תעתיק גבוהה יותר וכתוצאה מכך. בעקבות צביעת Giemsa, אזורים אלה יופיעו כלהקות אור. הכרומטין מרוכז מאוד עם פעילות מועטת או לא תעתיק (heterochromatin) יהיה חלק גדול של ההיסטונים המוגנים מפני טריפסין ולכן כתם כהה הבא מכתים Giemsa. זה חיוני כדי תחילה G-band שקופית אחת כדי לפקח על התנאים ולהתאים את עיתוי טריפסין במידת צורך לשקופיות שלאחר מכן.

  1. להוסיף את הפתרונות הבאים ל4 צנצנות Coplin.
    # צנצנת 1 = 30 מיליליטר של 1x HBSS ו4 מיליליטר של 10x טריפסין (0.5%)
    # צנצנת 2 = 50 מיליליטר של 1x HBSS
    צנצנת # 3 = 45 מיליליטר של 1x HBSS ו5 מיליליטר של סרום שור עוברי
    # צנצנת 4 = 50 מיליליטר של 1x HBSS
  2. לטבול כל שקופית בצנצנת # 1 במשך 5 שניות, שטיפה מהירה בצנצנת # 2, תעזוב את כל שקופית בצנצנת # 3 לפחות 30 שניות, שטיפה מהירה בצנצנת # 4 לאחר מכן לאפשר שקופיות לייבוש.
  3. הכן fresשעות Giemsa מכתים הפתרון (3:1 יחס Gurr הצפת וGiemsa הכתם). מניחים את השקופיות על מדף מכתים. לכסות את השקופית כולה בפתרון מכתים Giemsa. בואו השקופיות יישארו בפתרון מכתים למשך 5 דקות.
  4. יש לשטוף את השקופיות במים מזוקקים באותו סדר שהם היו מוכתמים. אפשר השקופיות לייבוש במשך 10 דקות בערך. השקופית צריכה להיות יבשה לחלוטין.
  5. הוסף 4 טיפות של Permount ולהחליק את מכסה לשקופית. ודא שאין בועות מתחת coverslip. Permount העודף ניתן להסיר עם מגבת נייר.
  6. נתח את התאים עם מיקרוסקופ אור בהגדלה 10X ו100X. התאם עיתוי טריפסין של שאר השקופיות המבוססות על התוצאות של השקופית הראשונה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

ממרחי metaphase איכות גבוהה חיוניים לניתוח כרומוזום. Assay מוצלח מניב כרומוזומים אשר פרוסים היטב ומורפולוגיה כרומוזום המתאימה. כרומוזומים כראוי התאגדו-G מכילים את האור האופייני ודפוסי פסים כהים.

figure-results-1
איור 1. כרומוזומליות התפשטות...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

יש לנו מנוצלים בהליך הנוכחי לבידוד כרומוזום מהתאים של אורגניזמים שונים, לרבות סוגים שונים של תאים המתקבלים מאדם, קופי רזוס, חולדות, עכברים ו11,20-22. הפרוטוקול הסטנדרטי מסופק, אבל צעדי מפתח מסוימים ומשתנים ייתכן שיצטרכו להיות מותאמים לסוגים השונים של תאים אלה. כמה צעדים ספציפיים הם קריטיים בשני ההכנה כרומוזומליות ו-G-banding כדי להבטיח את האיכות הטובה ביותר האפשרית של התוצאות. אחד מהמשתנים אשר יכול להשפיע על assay הוא זמן הדגירה Colcemid. פחות מידי הזמן בColcemid תשואות...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

יש המחברים אין לחשוף.

תודות

העבודה המתוארת בכתב היד הזה התאפשרה על ידי מימון מקרן פטריק פ טיילור.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
KaryoMAX ColcemidGibco15212-012
HBSS BufferGibco24020-117
0.5% Trypsin EDTA 10xGibco15400-054
PermountFisher ScientificSP15-100
טבליות חיץ "GURR"Gibco10580-013
Geimsa StainRicca Chemical Company3250-16
צנטריפוגה 5810אפנדורף
מתנולקלדון מעבדה כימיקלים6700130
חומצה אצטית קרחוניתKrackeler Scientific Inc.11-9508-05

מקורות

  1. Driscoll, D., Gross, S. Prenatal screening for aneuploidy. New Engl. J. Med. 360, 2556-2562 (2009).
  2. Nussbuam, R., et al. Genetics in Medicine: 7th Edition. , Saunders/Elsevier. Philadelphia. 76 (2007).
  3. Ljunger, E., et al. Chromosomal abnormalities in first-trimester miscarriages. Acta Obstet. Gynecol. Scand. 84 (11), 1103-1107 (2005).
  4. Kwinecka-Dmitri, B., et al. Frequency of chromosomal aberrations in material from abortions. Ginecol. Pol. 81 (12), 896-901 (2010).
  5. Reddy, U., et al. Stillbirth classification—Developing an international consensus for research: Executive summary of a national institute of child health and human development workshop. Obstet. Gynecol. 114 (4), 901-914 (2009).
  6. Pierpoint, M., et al. Genetic basis for congenital heart defects: Current knowledge. Circulation. 115 (23), 3015 (2007).
  7. Kaneshiro, N., Zieve, D. Down Syndrome: Trisomy 21. PubMed Health. , (2010).
  8. Cin, P. D. Current Protocols in Human Genetics. , (2003).
  9. Wang, N. Methodologies in cancer cytogenetics and molecular cytogenetics. Am. J. Med. Genet. 115 (3), 118-124 (2002).
  10. Miura, M., et al. Accumulated Chromosomal Instability in Murine Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells Leads to Malignant Transformation. Stem Cells. 24 (4), 1095-1103 (2006).
  11. Izadpanah, R., et al. Long-term In vitro Expansion Alters the Biology of Adult Mesenchymal Stem Cells. Cancer Res. 68 (11), 4229-4238 (2008).
  12. Dekel-Naftali, M., et al. Screening of human pluripotent stem cells using CGH and FISH reveals low-grade mosaic aneuploidy and a recurrent amplification of chromosome 1q. Eur. J. Hum. Genet. 20 (12), 1248-1255 (2012).
  13. Moralli, D., Yusuf, M., Mandegar, M., Khoja, S., Monaco, Z. L., Volpi, E. An Improved Technique for Chromosomal Analysis of Human ES and iPS Cells. Stem Cell Rev. Rep. 7 (2), 471-477 (2011).
  14. Bayani, J., Squire, J. Traditional banding of chromosomes for cytogenetic analysis. Curr. Protoc. Cell Biol. 22, (2004).
  15. Speicher, M. R., Carter, N. P. The new cytogenetics: blurring the boundaries with molecular biology. Nat. Rev. Genet. 6 (10), 782-792 (2005).
  16. Benn, P., Delach, J. Human Lymphocyte Culture and Chromosome Analysis. Cold Spring Harb Protoc. , (2010).
  17. Muul, L. M., Heine, G., Silvin, C., James, S. P., Candotti, F., Radbruch, A., Worm, M. Measurement of Proliferative Responses of Cultured Lymphocytes, Curr. Protoc. Immunol. , (2011).
  18. Barch, M. J., Knutsen, T., Spurbeck, J. The Association of Genetic Technologists Cytogenetics Laboratory Manual. San Francisco: 3rd edition. , ACT. Houston, TX. (1997).
  19. Dewald, G. W., Ketterling, R. P., Wyatt, W. A., Stupca, P. J. Cytogenetic studies in neoplastic hematologic disorders. In Clinical Laboratory Medicine, 2nd edition. McClatchey, K. D. , Williams & Wilkens. Baltimore. 658-685 (2002).
  20. Kibe, R., et al. IL-7Rα deficiency in p53(null) mice exacerbates thymocyte telomere erosion and lymphomagenesis. Cell Death Different. 19 (7), 1139-1151 (2012).
  21. Tsien, F., Morava, E., Talarski, A., Marble, M. Phenotypic features of a boy with trisomy of 16q22-->qter due to paternal Y; 16 translocation. Clin. Dysmorphol. 4 (4), 177-181 (2005).
  22. Tsien, F., et al. Prolonged culture of normal chorionic villus cells yields ICF syndrome-like chromatin decondensation and rearrangements. Cytogenet. Genome Res. 8 (1), 13-21 (2002).
  23. McGrattan, P., Campbell, S., Cuthbert, R., Jones, F., McMullin, M., Humphreys, M. Integration of conventional cytogenetics (G-banding), comparative genomic hybridization (CGH) and interphase fluorescence in situ hybridization (i-FISH) for the detection of genomic rearrangements in acute leukemia. J. Clin. Pathol. 61 (8), 903-908 (2008).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

ColcemidCarnoyG bandingFISH
הכנת כרומוזום מתאים בתרבית
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.