הכנת כרומוזום מתאים בתרבית

סיכום

יכולים להיות מבודדים הכרומוזומים מתאי חיים כגון לימפוציטים או fibroblasts עור, ומאורגניזמים כולל בני אדם או עכברים. הכנות כרומוזום אלה יכולים להיות מנוצלים נוספים עבור ה-G-פסים שיגרתי ונהלים ציטוגנטית מולקולריים כגון הקרינה הכלאה באתרו (FISH), הכלאה השוואתית גנומית (CGH), וkaryotyping ספקטרלי (SKY).

תקציר

ניתוח כרומוזום (ציטוגנטית) נמצא בשימוש נרחב לגילוי של חוסר יציבות כרומוזום. כאשר אחריו ה-G-פסים וטכניקות מולקולריות כגון הקרינה הכלאה באתרו (FISH), יש assay זה את היכולת רבת עוצמה לניתוח תאים בודדים לסטיות שכוללות רווחים או הפסדים מחלקים של הגנום ושחלופים מעורבים כרומוזומים אחד או יותר. בבני אדם, מומים כרומוזום מתרחשים בכ 1 לכל 160 לידה חי ^1,2, 60-80% מכלל הפלות ^3,4, 10% מלידה מתות ^2,5, 13% מאנשים עם מחלת לב מולדת ^6, 3-6% מהמקרים בעיות פוריות ^2, ואצל חולים רבים עם עיכוב התפתחותי ומומים מולדים ^7. ניתוח ציטוגנטית של ממאירות משמש באופן שגרתי על ידי חוקרים וקלינאים, כמו תצפיות של פגמים בכרומוזומים משובטים הוכחו יש גם משמעות דיאגנוסטית ופרוגנוסטית ^8,9.60; בידוד כרומוזום לא יסולא בפז עבור ריפוי גנטי ומחקר בתאי גזע של יצורים כוללים פרימטים ומכרסמים ^10-13 לא אנושיים.

יכולים להיות מבודדים הכרומוזומים מהתאים של רקמות חיות, ובכלל זה לימפוציטים בדם, fibroblasts עור, amniocytes, שליה, מח עצם, ודגימות גידול. כרומוזומים מנותחים בשלב metaphase של מיטוזה, כאשר הם מרוכזים ביותר, ולכן בצורה ברורה יותר לעין. הצעד הראשון של טכניקת בידוד כרומוזום כרוך השיבוש של סיבי הכישור ידי דגירה עם Colcemid, כדי למנוע את התאים מפני שתמשיך לשלב anaphase שלאחר מכן. לאחר מכן טופלו התאים עם פתרון hypotonic והשתמרו במצב הנפוח שלהם עם המקבע של Carnoy. לאחר מכן התאים נפלו על שקופיות ואז יכולים להיות מנוצל עבור מגוון רחב של נהלים. G-banding כרוך טיפול טריפסין ואחרי צביעה עם Giemsa כדי ליצור אור אופייני ופסים כהים. אותו יחסי הציבורocedure לבודד את הכרומוזומים יכול לשמש להכנת תאים להליכים כגון הקרינה הכלאה באתרו (FISH), הכלאה השוואתית גנומית (CGH), וkaryotyping ספקטרלי (SKY) ^14,15.

מבוא

ניתוח כרומוזום הוא טכניקה קונבנציונלית מנוצל ברחבי העולם כדי לאבחן חוסר יציבות כרומוזום ושחלופים שמובילות להפרעות גנטיות ^ו1,2,8,9 ממאירות. בנוסף, ברזולוציה גבוהה יותר לאבחון והמחקר של מומים גנטיים חוקתיים והסרטן רכשה ניתן להשיג עם השילוב של הנהלים הקלאסיים ציטוגנטית ומתודולוגיות ציטוגנטית מולקולריות כגון הקרינה הכלאה באתרו (FISH), הכלאה גנומית השוואתית (CGH) , וkaryotyping ספקטרלי (SKY) ^14,15. לאחרונה, טכניקות אלה כבר נוצלו להערכה של חוסר יציבות כרומוזום קשור עם מחקר בתאי גזע. מומים Karyotypic כגון aneuploidy של תאים לטווח ארוך בתרבית עוברית (ES) ותאי גזע בוגרים של אורגניזמים שונים שדווחו על ידי מ....

פרוטוקול

1. קציר כרומוזום של תאים חסידים

1. פרוטוקול סטנדרטי
   1. לגדל תאים בהתאם לתנאי culturing התא ספציפיים. כאשר התאים הגיעו שלב לוגריתמים (confluency 80%), להוסיף 10 μl / מיליליטר של Colcemid לבקבוק תרבית תאים. מינימום של 2 x 10 ⁶ תאים מומלץ.
   2. דגירה תאים ב 37 מעלות צלזיוס ב5% CO ₂ באינקובטור במשך 45 דקות. באמצעות פיפטה סטרילית, להעביר מדיה מהתאים לתוך צינור חרוטי 15 מיליליטר. ....

תוצאות

ממרחי metaphase איכות גבוהה חיוניים לניתוח כרומוזום. Assay מוצלח מניב כרומוזומים אשר פרוסים היטב ומורפולוגיה כרומוזום המתאימה. כרומוזומים כראוי התאגדו-G מכילים את האור האופייני ודפוסי פסים כהים.

איור 1. כרומוזומליות התפשטות.......

דיון

יש לנו מנוצלים בהליך הנוכחי לבידוד כרומוזום מהתאים של אורגניזמים שונים, לרבות סוגים שונים של תאים המתקבלים מאדם, קופי רזוס, חולדות, עכברים ^ו11,20-22. הפרוטוקול הסטנדרטי מסופק, אבל צעדי מפתח מסוימים ומשתנים ייתכן שיצטרכו להיות מותאמים לסוגים השונים של תאים אלה. כמה צעדים ספציפיים הם קריטיים בשני ההכנה כרומוזומליות ו-G-banding כדי להבטיח את האיכות הטובה ביותר האפשרית של התוצאות. אחד מהמשתנים אשר יכול להשפיע על assay הוא זמן הדגירה Colcemid. פחות מידי הזמן בColcemid תשואות.......

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
KaryoMAX Colcemid	Gibco	15212-012
HBSS Buffer	Gibco	24020-117
0.5% Trypsin EDTA 10x	Gibco	15400-054
Permount	Fisher Scientific	SP15-100
טבליות חיץ "GURR"	Gibco	10580-013
Geimsa Stain	Ricca Chemical Company	3250-16
צנטריפוגה 5810	אפנדורף
מתנול	קלדון מעבדה כימיקלים	6700130
חומצה אצטית קרחונית	Krackeler Scientific Inc.	11-9508-05