פרוטוקול לניתוח של מחזור תא חי דרוזופילה רקמות באמצעות התמקדות Cytometer אקוסטית לכוונן מתוארת. פרוטוקול זה בו זמנית מספק מידע על גודל תא יחסי, מספר תא, ה-DNA ותוכן סוג התא דרך שושלת התחקות או ביטוי רקמות ספציפי של חלבוני ניאון In vivo.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
ניתוח מחזור תא חי של
* These authors contributed equally
במאמר זה
סיכום
תקציר
cytometry הזרימה כבר בשימוש נרחב כדי להשיג מידע על תוכן ה-DNA באוכלוסייה של תאים, כדי להסיק אחוזים יחסית בשלבי מחזור תא שונים. טכניקה זו הורחבה בהצלחה לרקמות mitotic של מודל אורגניזם תסיסנית למחקרים גנטיים של ויסות מחזור תא בגוף חי. בשילוב עם ביטוי תא מסוג מסוים חלבון פלואורסצנטי ומניפולציות גנטיות, ניתן לקבל מידע מפורט על השפעות על מספר תאים, גודל תא ומחזור תא הדרגת in vivo. עם זאת שיטה לחיות תאים זו הסתמכה על השימוש בצבע התא חדיר Hoechst 33342-DNA intercalating, הגבלת משתמשי cytometers זרימה המצוידים בלייזר UV. יש לנו שונה בפרוטוקול זה כדי להשתמש בצבע חדש יותר לחיות תאי ה-DNA, ויולט DyeCycle Vybrant, תואם עם לייזר 405nm הסגול הנפוץ יותר. הפרוטוקול המובא כאן מאפשר ניתוח מחזור תא יעיל בשילוב עם תאסוג, גודלו היחסי של תאים ומידע מספר תא, במגוון רחב של רקמות תסיסנית. פרוטוקול זה מרחיב את הטכניקה שימושית במחזור תא הניתוח לרקמות תסיסנית למנתח benchtop קטן, Cytometer ההתמקדות אקוסטית לכוונן, אשר ניתן להפעיל ומתוחזק בקנה מידת מעבדה אחת.
מבוא
cytometry הזרימה יכול לשמש למדידות של כדאיות תא, גודל תא יחסי, תוכן ה-DNA וביטוי חלבון פלואורסצנטי באוכלוסיות תאים חיים. עקב השכפול של ה-DNA הגרעיני במהלך השלב-S, מידע על תוכן ה-DNA באוכלוסייה של תאים יכולים לשמש כדי להסיק אחוזים יחסית בשלבי מחזור תא שונים 1-3. שיטה זו הפכה לאבן פינה של ניתוח מחזור תא במערכות מודל משמרים ליונקים.
זבוב פירות תסיסנית הפכה מערכת מודל מצוינת לניתוחים גנטיים בvivo של ויסות מחזור תא. הכלים הגנטיים הנרחבים הזמינים בזבובים לאפשר למניפולציות רקמה אלגנטית ספציפיות ומוסדרות באופן זמני של רגולטורים מחזור תא יח....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. טוס גידול בעלי
- קרוס זבובים של גנוטיפים רצויים בבקבוקוני פלסטיק צרים עם 10 מיליליטר שמרים-גלוקוז בינוני 3 או מדיה עשירה בחלבון אחר על פי בחירתך. הכלים הנרחבים תסיסנית המהונדס הזמינים לביטוי ספציפי רקמות ושושלת התחקות עם בביטוי חלבון פלואורסצנטי vivo מתוארים בפירוט במקומות אחרים 4,5. העבר את ההורים לבקבוקונים טריים מדי יום כדי לקבל סדרה של 24 אוספי צאצאי משאבים אנושים, או לבימוי מדויק יותר, לאסוף עובר על צלחות אגר ולהעביר זחל בקע זה עתה לבקבוקוני 10 כפי שתואר. על מנת להבטיח תנאי....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
תרשים 2 מציג תוצאות עבור נציג אגף מדגם הזחל, להביע GFP במחצית האחורית של הרקמה, תוך שימוש בתבנית ה-GFP סיפק. תוצאות דומות מתקבלות עם אותו סוג הרקמה ודפוס ביטוי למכרז באמצעות סיפק RFP התבנית (איור 3 א). את התבניות שסופקו והמתחים (טבלה 2) מתאימות לניתוח עיני זחל (איור 3), מוח וכנפיים, כמו גם עיניים גלמי, מוח (איור 3D) וכנפיים. Histograms של גודל תא יחסי הניתן על ידי קשירת קשר FSC לאוכלוסיות בשערי 5 ו 6 גם יכול להיות.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
הפרוטוקול המתואר כאן מאפשר ניתוח של מחזור התא, גודל תא יחסי ומספר תא היחסי ברקמות חיים תסיסנית בשלבי התפתחות שונים. כאשר ניתוח זה הוא בשילוב עם ביטוי תא מסוג מסוים חלבון פלואורסצנטי או שושלת התחקות, ניתן לקבל מידע מפורט על תגובות הסלולר מחזור תא דיסקרטי או הפרעות צמיחה. כהוכחה של עיקרון, אנחנו שיבשו קפאון במוח זבוב גלמי בהבעת רגולטורים מחזור תא G1-S בשיבוטי תא שכותרתו GFP, מה שמוביל לשכפול הדנ"א חריג בשלב ההתפתחותי שבי תאי מוח הם בדרך כלל מעל 90% G1 נעצר (איו.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים אין לחשוף.
תודות
אנו מודים לאאידה דה לה קרוז לפיתוח והוראת הפרוטוקול המקורי לגרסה זו מבוססת 10. לעבוד במעבדה Buttitta נתמך על ידי מענק NIH GM086517.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות | ||||||||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 12x75 מ"מ פוליסטירן עגול-תחתון 5 מ"ל מבחנה | BD Falcon | 352058 | צינורות 5 מ"ל | ||||||||||||
| Attune מיקוד אקוסטי | טכנולוגיות חיים / תצורת Applied Biosystems | 4445315 | כחול / סגול | ||||||||||||
| Attune Cytometer Software (גרסה 1.2.5) | Life Technologies/ Applied Biosystems | Free | PC בלבד | ||||||||||||
| Attune חרוזי מעקב אחר ביצועים (5 x 106 חרוזים/מ"ל) | Life Technologies/ Applied Biosystems | 4449754 | למבחן ביצועים יומיומי | ||||||||||||
| Dumont #5 מלקחיים Inox | Fine Science Tools | 11251-20 | |||||||||||||
| צלחות עובר 30 מ"מ x 12 מ"מ | מדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית | 70543-30 | כלי חיתוך זכוכית | ||||||||||||
| Eppendorf Thermomixer | Eppendorf | 022670051 | |||||||||||||
| תמיסת טריפסין-EDTA (10x) | Sigma | T4174 | |||||||||||||
| Vannas-Tü מספריים אביב bingen | כלי מדע עדינים | 15003-08 | ישר 5 מ"מ קצה חיתוך | ||||||||||||
| Vybrant DyeCycle סגול | כתמים טכנולוגיות חיים/ Invitrogen | V35003 | |||||||||||||
| טבלה 1. ריאגנטים ומכשירים נדרשים. | |||||||||||||||
תמיסת כתמי DNA חיה (10 מ"ל): 1 מ"ל 10X Ca2+ Mg2+ ללא PBS (pH7.2) 10X Ca2+ Mg2+ PBS חופשי (pH7.2): 1.37M NaCl, 27 מ"מ KCl, 100 מ"מ Na2HPO4 (דו-בסיסי), 20 מ"מ KH2PO4 (monobasic) מותאם ל-pH 7.2 | |||||||||||||||
טבלה 2. הגדרת סף ומתח עבור הניתוח באיור 2. |
מקורות
- Nunez, R. DNA measurement and cell cycle analysis by flow cytometry. Curr. Issues Mol. Biol. 3, 67-70 (2001).
- Rabinovitch, P. S. DNA content histogram and cell-cycle analysis. Methods Cell Biol. 41, 263-296 (1994).
- Ashburner, M., Roote, J.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
