הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

מודל עכברי של ריפוי פצע

67.8K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/50265

⸱

28 במאי 2013

 ,  ,  ,  ,  , 
1The Heart Research Institute, 2Sydney Medical School, University of Sydney , 3Cardiology Department, Royal Prince Alfred Hospital

במאמר זה

סיכום

מודל עכברי של ריפוי פצע עורי שניתן להשתמש כדי להעריך את התרכובות טיפוליות בהגדרות פיסיולוגיות וpathophysiological.

תקציר

ריפוי פצע ותיקון הם התהליכים הביולוגיים המורכבים ביותר המתרחשים בחיי אדם. לאחר פציעה, מסלולים ביולוגיים רבים להיות מופעלים. ריפוי פצעים לקוי, אשר מתרחש בחולי סוכרת לדוגמה, יכול להוביל לתוצאות חמורות שליליות כגון קטיעה. יש, אם כן, תמריץ להגדיל לפתח סוכני רומן המקדמים תיקון פצע. הבדיקות אלה היו מוגבלות למודלים של בעלי חיים גדולים כמו חזירים, שהם לעתים קרובות לא מעשיים. עכברים מייצגים את המודל האידיאלי קליני, כפי שהם חסכוני ונוחים למניפולציה גנטית, המאפשרת לחקירת מכניסטית. עם זאת, ריפוי פצעים בעכבר הוא שונה בהמהות לזה של בני אדם כפי שהוא מתרחש בעיקר דרך הצמצום. המודל העכברי שלנו מתגבר על זה על ידי שילוב של קיבוע באזור הפצע. על ידי קיבוע הפצע, תהליך התיקון הוא לאחר מכן תלוי באפיתליזציה, התרבות תאים ואנגיוגנזה, אשר משקפות באופן הדוקתהליכים ביולוגיים של ריפוי פצע אדם. בעוד הדורש עקביות וטיפול, מודל עכברי זה אינו כרוך בטכניקות כירורגיות מסובכות ומאפשר בדיקות חזקות של חומר מבטיח שעשויים, למשל, לקדם או לעכב אנגיוגנזה דלקת. יתר על כן, כל עכבר פועל כשליטה שלה כמו שני פצעים מוכנים, מה שמאפשר את היישום של שניהם במתחם ומבחן השליטה ברכב באותו בעל חיים. לסיכום, אנו מדגימים מודל מעשי, קל ללמוד, וחזק של ריפוי הפצע, שהיא דומה לזו של בני אדם.

מבוא

ריפוי פצע לקוי אחראי לתחלואה ותמותה בעולם משמעותית, זה נכון במיוחד עבור הסובלים מסוכרת 1,2. בבני אדם, ריפוי פצע הוא רצף של תהליכים, שבו יש חפיפה משמעותית 3. מייד התהליכים דלקתיים, פציעה הבאות הם יזמו. תאים דלקתיים לשחרר גורמים המעודדים את התהליכים של תא התפשטות, הגירה ואנגיוגנזה. לאחר היווצרות רקמה חדשה epithelialization מחדש ויש שלב של שיפוץ שכרוך גם אפופטוזיס וארגון מחדש של חלבוני מטריצה ​​כגון קולגן.

המורכבות של ריפוי פצע לא יכולות כרגע להיות משוכפלת במבחנה וזה מחייב שימוש במודלים של בעלי חיים. נכון להיום, לימודי ריפוי פצעים היו מוגבלים למודלים של בעלי חיים גדולים, כמו חזירים, על מנת להבטיח כי תהליכי הריפוי הם שווי ערך ודומים לבני אדם. עם זאת, שימוש האנימה גדולהLS למחקרים מסוג זה יכול להיות קשה לבית והם לא תמיד מעשיים 4. עכבר המעבדה מייצג מודל חיה חסכוני, שניתן בקלות מניפולציות גנטית לחקירת מכניסטית 5-7. עם זאת, פצעים עכבריים לרפא בצורה שונה לאדם ב, בעיקר בשל התהליך של התכווצות 8. מדובר בין השאר, בשל שכבה תת עורית נרחבת משורטטת שריר נקראת carnosus מרפד שהוא במידה רבה חסר בבני אדם. בעכברים, שכבת שריר זה מאפשר לעור להעביר באופן עצמאי של השרירים העמוקים יותר והוא אחראי להתכווצות המהירה של הפציעה הבאה עור.

כדי להתגבר על מגבלה זו, ניתן להתאים את ריפוי פצע עכברי לשכפל ריפוי פצע אדם על ידי שימוש בסד (איור 1) 8,9. בסרטון הזה אנחנו מדגימים את המודל העכברי הפצע החורץ שמבטל התכווצות פצע והדוק יותר קרובות לתהליכים האנושיים של מחדש epithelialization והיווצרות רקמה חדשה. במודל זה שני חתכים בעובי מלא הכוללים carnosus מרפדים נוצרים על dorsum, אחד בכל צד של קו האמצע של העכבר. סד סיליקון ממוקם סביב הפצע עם הסיוע של דבק ולאחר מכן הקיבוע מאובטח עם תפרים. כל עכבר משמש כשלט משלו, עם פצע אחד מקבל טיפול ושליטה ברכב האחר, ובכך להפחית מספרים של בעלי חיים. בעקבות יישומים אקטואליים, הלבשה אוטמת שקופה מוחלת. ניתן להסיר את החבישה בעת צורך ליישומים נוספים אקטואליים ו / או מדידה של אזור הפצע 10,11. בהשלמת ניסויים, סגירת פצע, אדריכלות ומידת neovascularization המורפולוגי ניתן להעריך על ידי אימונוהיסטוכימיה. זה גם יכול להיות מנוצל חסכוני וקל לביצוע מודל להערכת ריפוי פצע בהקשר של סוכרת או pathophysiologies האחרים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. הכנת סדים ותחבושות occlusive

  1. מדורג 10 מ"מ חוגים ביריעות סיליקון בעובי 0.5 מ"מ ומספריים שימוש או ביופסיה כדי ליצור דיסקי סיליקון.
  2. מרכז מ"מ ביופסיה 5 באמצע מעגל 10 מ"מ ולחץ בחוזקה כדי ליצור חור ליצירת "סופגנייה", כמו דיסק שישמש כסד.
  3. מדורג 10 מ"מ על עיגולים שקוף הלבשה אוטמת כגון Opsite ומספריים להשתמש כדי ליצור תחבושות מעגליות.

2. חיות ניסוי

  1. השג אישור ועדת אתיקה לבעלי חיים כל הניסויים שיבוצעו.
  2. השתמש בעכברים ממין זכר C57BL/6J 8 שבועות ישנים (22-26 גרם) ממגדל מסחרי (למשל מעבדות ג'קסון).
  3. שמור על עכברים בתנאים סטנדרטיים של 21 מעלות צלזיוס ומחזור 12 שעות אור בחושך עם גישה החופשית למזון ומים.
  4. (אופציונלי): סוכרת יכולה להיגרם ב6 עד 7 עכברים ישנים שבוע על ידי בולוס intraperitoneal injection של 165 מ"ג / ק"ג streptozotocin (בחיץ ציטרט, pH 4.5), עם היפרגליקמיה אושר על ידי ניטור רמת סוכר בדם רגיל (AccuChek Glucometer). עכברים סוכרתיים עשויים להיות polyuria וכן המצעים שלהם ייתכן שיהיו צורך לשנות בתדירות גבוהה יותר כדי למנוע רטיבות והמשקולות שלהם צריכים להיות תחת פיקוח הדוק.

3. הרדמה והכנה אופרטיבית

  1. לגרום להרדמה כללית באמצעות 5% isoflurane ב 100% חמצן (קצב זרימה 1 ליטר / דקה) ולשמור על הרדמה באמצעות 1-3% isoflurane.
  2. להבטיח את הרפלקסים פדלים העמוקים של העכבר מדוכא ומניח את העכבר בעמדה פגיע.
  3. הכן את אזור הניתוח על ידי הסרת פרווה עם קוצץ מבסיס הצוואר עד 3 ס"מ בהמשך הגב ובין השכמות שתי כתפיים.
  4. יישום אור הקרם מקריח יכול להיות מיושם על לא יותר מ 2 דקות. מטליות גזה רטובות יכולות לשמש כדי להבטיח את כל השמנת ופרווה שנותרה מוסר.
  5. לנגב את העור עםספוגית אלכוהול ושני יישומים של 10% povidone-יוד (פולידין) ולעטוף את העכבר.

4. כריתה וקיבוע של פצע

  1. ייצוג בתרשים של מודל ריפוי פצעים העכברי מוצג באיור 1.
  2. השתמש סטרילי 4 מ"מ ביופסיה להתוות שתי תבניות עגולות לפצע משני צדי קו האמצע של העכבר ברמה של הכתפיים (ראה איורים 2a-2b).
  3. שימוש במלקחיים משוננים להרים את העור באמצע המתווה והמספריים איריס כדי ליצור פצע בעובי מלא המשתרע דרך הרקמה התת עורית (איורים 2 ג-2D), כולל carnosus מרפדים (2E איור), והבלו פיסה העגולה של רקמה.
  4. חזור על התהליך עבור הפצע בצד השני של קו האמצע (איור 2F).
  5. הסר ציפוי מגן פלסטיק מכל צד של סד סיליקון.
  6. החל cyanoacrylate דבק (למשל דבק סופר או דבק מגע דבק) בצד אחד של סד סיליקון.
  7. מרכז סד על הפצע (איור 2G) ועוגן הסד עם 6-0 תפרי ניילון הופסק כדי להבטיח מיצוב (איור 2H).
  8. חזור על תהליך קיבוע על פצע האחר.
  9. אם יש צורך בנקודת הזמן זו, להחיל המתחם הטיפולי להיבדק (μl עד 100) לפצע אחד (איור 2i), ושליטה ברכב לצד השני.
  10. לכסות את הפצע עם תחבושת אוטמת שקופה (לדוגמה, OpSite) (איור י 2-2k).
  11. שליט ממוקם מתחת לסדים ונלקח photomicrograph (איור 2L).

6. ניהול לאחר ניתוח

  1. Carprofen (5 מ"ג / ק"ג) אחת ליום מנוהל באמצעות הזרקה תת עורית-להקלה על כאב שלאחר הניתוח.
  2. אחרי החיות הניתוח הן בכלוב בנפרד ושמרו על חום מ 'ATS עד התאושש באופן מלא.
  3. לפקח חיות פעמיים ביום למשך גילויים של כאב וירידה במשקל. הבחנו לא מוצג התנהגות בוטה של ​​כאב או ירידה במשקל.

7. מדידת פצע וטיפול

  1. הפצע יכול להימדד מדי יום.
  2. לגרום להרדמה כללית באמצעות 5% גז isoflurane (זרימת שיעור 1 ליטר / דקה), ולאחר מכן להבטיח את הרפלקסים התחושתיים העמוקים של העכבר מדוכאת באמצעות 1-3% isoflurane.
  3. בעדינות לקלף את רוטב occlusive עם מלקחיים.
  4. השתמש מחוגה כירורגיות כדי למדוד את קוטר הפצע. אנחנו לוקחים את הממוצע של שלוש מדידות לאורך X, Y ו-Z הציר (איורים 2 מ-2o), כמו גם photomicrograph לשימוש עתידי (איור 2).
  5. אופציונלי: בשלב זה את החיה ניתן להעריך לזלוף הדם באמצעות לייזר דופלר imager (איור רבעון 2).
  6. יישום מחדש של המתחם הטיפולי ושליטה ברכב יכול להיות ביצועיםתרופה בשלב זה.
  7. הלבשה אוטמת שקופה נקיות היא מחדש מיושמת ואת החיות כל הזמן חם עד שהתאוששו באופן מלא.
  8. הערה: אם סדים אינם מאובטחים כראוי את הפצע בקלות יהיה חוזה (איור 2 יח).

8. ניתוח היסטולוגית

  1. להרדים את העכברים לאחר 10 ימים עם מנת יתר של הרדמה.
  2. בעזרת מלקחיים ולהב סכין מנתחים להסיר את התפרים ובזהירות לקלף את הקיבוע.
  3. השתמשו במספרי איריס ליצור כריתה רחבה, מלאה מסביב ומתחת לאזור הפצע ודגירת הרקמות בparaformaldehyde 4% בופר פוספט (PBS) בשעה 4 ° C למשך הלילה.
  4. העברת רקמות לסוכרוז 17% בפתרון PBS עבור 24 שעות נוספות על 4 מעלות צלזיוס ולאחר מכן להסיר פתרון עודף על ידי מספיג בזהירות על רקמות ומקום במתחם והקפאת אוקטובר ב -80 ° C.
  5. Hematoxylin ומכתים eosin יכולים לשמש כדי לחזות את המבנה ופער פצע אפיתל. Neovascularisation ניתן להעריך על ידי מנתח immunohistochemical כדי לקבוע את מספר הנימים (באמצעות גורם Willebrand פון).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

עקומת סגירת פצע נקבעה על ידי חישוב הקוטר הממוצע של הפצע ולבטא את התוצאות באחוזים, כלומר 100 - (יום 0 קוטר / קוטר X יום). בניסוי זה מתחם טיפולי (או שליטה ברכב) יושם יומי לפצע. המתחם הטיפולי סגירת פצע מאוד מואצת (איור 3). חשוב לציין כי הסדים חייבים להישמר לתקופת הניסוי, כהסרת סדים תוביל להתכווצות פצע מהירה (איור 2 יח) ולסטות מהדפוס של ריפוי הפצע נצפה בבני אדם.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

זהו מודל עכברי ניסויי של ריפוי פצע עורי. תכונה משמעותית של מודל זה היא השימוש בסדי סיליקון כדי למנוע התכווצות פצע כך שהיווצרות הרקמה חדשה epithelialization מחדש ועלול להתרחש, מה שהופך אותו דומה לתהליך המתרחש בבני אדם. מודל זה הוא תכליתי וניתן להשתמש בו כדי להעריך את ריפוי פצע (למשל בסוכרת) הגדרות הן פיסיולוגיות וpathophysiological. המודל עשוי לשמש גם כדי להעריך את פוטנציאל ריפוי פצע או הרפוי אנגיוגנזה בהגדרה חסכונית. עם כל עכבר מתנהג כמו שליטה משלו, מספרי בעלי החיים הם מז...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים אין לחשוף.

תודות

המחברים מבקשים להודות לתמיכת מימון הבריאות הלאומית והמועצה למחקר רפואי (NHMRC) של אוסטרליה (פרויקט גרנט ID: 632,512). לואיז דאן נתמכה על ידי מלגת קריירה מוקדמת NHMRC וכריסטינה Bursill על ידי מלגת קריירה קרן לב לאומית לפיתוח.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
יריעות סיליקון לחץ לאיטום בעובי 0.5 מ"מInvitrogenP18178חתוך ל"סופגניות "בקוטר חיצוני של 1 ס"מ חיצוני, קוטר פנימי 0.5 ס"מ
אגרוף ביופסיה 5 מ"מSteifelBC-B1-0500כדי לתאר את אזור הפצע שיש לכרות
מספריים Vannas 8.5 ס"מ מעוקלWorld Precision Instruments 501232לחתך וכריתת פצע
Dumonte #7b מלקחיים, 11 ס"מWorld Precision Instruments501302לאחיזת העור בעת יצירת חתך וכריתת עור
מלקחיים של Graefe, משוננים 10 ס"מWorld Precision Instruments14142כדי לסייע בהצמדת סד סיליקון לעור
מחזיק מחט, לסתות חלקות, מעוקלות, 12.5 ס"מWorld Precision Instruments14132
מלקחיים של Malis, חלקים, ישרים, 12 ס"מCodman and Shurtleff, Inc (J& המגבר; J)80-1500לתפירת טבעות הסיליקון לעור
סרגל, הדרגה של 0.5 מ"מn/a
קליפרים 0.25 מ"מ הדרגתיותדאקוורת' וקנט9-653למדידת שטח הפצע
מול סרט דבק שקוף FlexiFix. 10 ס"מ x 1 מ'סמית & אחיין66030570
רימדיל (קרפרופן)פייזר462986

מקורות

  1. Sen, C. K., et al. Human skin wounds: a major and snowballing threat to public health and the economy. Wound Repair. 17, 763-771 (2009).
  2. Sen, C. K. Wound healing essentials: let there be oxygen. Wound Repair Regen. 17, 1-18 (2009).
  3. Gurtner, G. C., Werner, S., Barrandon, Y. Wound repair and regeneration. Nature. 453, 314-321 (2008).
  4. Lindblad, W. J. Considerations for selecting the correct animal model for dermal wound-healing studies. J. Biomater. Sci. Polym. Ed. 19, 1087-1096 (2008).
  5. Grose, R., Werner, S. Wound-healing studies in transgenic and knockout mice. Mol. Biotechnol. 28, 147-166 (2004).
  6. Reid, R. R., Said, H. K., Mogford, J. E., Mustoe, T. A. The future of wound healing: pursuing surgical models in transgenic and knockout mice. J. Am. Coll. Surg. 199, 578-585 (2004).
  7. Fang, R. C., Mustoe, T. A. Animal models of wound healing: utility in transgenic mice. J. Biomater. Sci. Polym. Ed. 19, 989-1005 (2008).
  8. Wong, V. W., Sorkin, M., Glotzbach, J. P., Longaker, M. T., Gurtner, G. C. Surgical approaches to create murine models of human wound healing. J. Biomed. Biotechnol. 2011, 969618(2011).
  9. Galiano, R. D., Michaels, J. t, Dobryansky, M., Levine, J. P., Gurtner, G. C. Quantitative and reproducible murine model of excisional wound healing. Wound Repair. 12, 485-492 (2004).
  10. Galiano, R. D., et al. Topical vascular endothelial growth factor accelerates diabetic wound healing through increased angiogenesis and by mobilizing and recruiting bone marrow-derived cells. The American Journal of Pathology. 164, 1935-1947 (2004).
  11. Thangarajah, H., et al. The molecular basis for impaired hypoxia-induced VEGF expression in diabetic tissues. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 13505-13510 (2009).
  12. Raza, A., Bayles, C., Biebel, D. Investigation of Bacterial Growth and Moisture Handling Properties of Transparent Dressings: 3M Tegaderm Transparent Dressing, 3M Tegaderm HP Transparent Dressing, and Opsite IV3000 Transparent Dressing. Smith and Nephew Report. , (1998).
  13. Chung, T. Y., Peplow, P. V., Baxter, G. D. Testing photobiomodulatory effects of laser irradiation on wound healing: development of an improved model for dressing wounds in mice. Photomed. Laser Surg. 28, 589-596 (2010).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

מודל עכברי של ריפוי פצע
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.