הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

בידוד, תרבות ואפיון פונקציונלי של Cardiomyoctyes מאוס למבוגרים

24.8K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/50289

⸱

24 בספטמבר 2013

 ,  ,  ,  ,  , 
1Cardiovascular Institute, Beth Israel Deaconess Medical Center, Harvard Medical School, 2Division of Cardiology, Sapienza University

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

כאן אנו מתארים את הבידוד של cardiomyoctyes עכבר המבוגר באמצעות מערכת זלוף Langendorff. תאים וכתוצאה מכך הם Ca2 +, סובלניים, חשמלי שקט ויכולים להיות מתורבת וtransfected עם אדנו או lentiviruses כדי לתפעל ביטוי גנים. הפונקציונליות שלהם יכולה גם להיות מנותחת באמצעות מערכת MMSYS וטכניקות תיקון מהדק.

תקציר

השימוש בשריר לב ראשוני (CMS) בתרבות סיפק חזק כדי להשלים מודלים עכבריים של מחלת לב בקידום ההבנה של מחלת לב שלנו. בפרט, את היכולת ללמוד הומאוסטזיס יון, פונקצית ערוץ יון, התרגשות יתר סלולרית וצימוד עירור והתכווצות ושינוייהם בתנאים חולים ועל ידי מוטציות הגורמות למחלות הובילה לתובנות משמעותיות למחל לב. יתר על כן, חוסר שורת תאים הונצחה מספיק כדי לחקות את המבוגרים CMS, ואת המגבלות של CMS בילוד (אשר חסרים רבים האופייני ביומכניקה המבנית ותפקודי של המבוגר CMS) בתרבות שהקשו על ההבנה של יחסי הגומלין המורכבים בין מסלולי איתות שלנו, תעלות יונים ותכונות התכווצות בלב המבוגר חיזוק החשיבות של לימוד שריר לב מבודד מבוגר. כאן, אנו מציגים שיטות לבידוד, תרבות, המניפולציה של ביטוי גנים על ידי adenoviral-expreחלבוני ssed, וניתוח פונקציונלי הבא של שריר לב מהעכבר הבוגר. השימוש בטכניקות אלה יסייע לפתח תובנה מכניסטית לתוך איתות מסלולים המווסתים את הרגישות סלולרית, Ca 2 + דינמיקה והתכווצות ולספק הרבה יותר רלוונטי מבחינה פיזיולוגית אפיון של מחלות לב וכלי דם.

מבוא

מודלים עכבריים למחלת לב וכלי דם ששימשו ככלים יעילים להבהרת מנגנוני מחלה בסיסיות 1,2, כמו גם לזיהוי מטרות טיפוליות אפשריות 1,3. בפרט, השימוש בשני המודלים העכבריים למחלת לב נרכשת (כמו לחץ-עומס יתר) 4,5 ומודלי עכבר מהונדסים קידמו את ההבנה של מחלות לב 6-8 שלנו. השימוש בטכניקות תרבית תאים ללמוד מפלי איתות 3,9,10 ושינויים בחלבונים בודדים העומדים בבסיס רגישות סלולרית וצימוד עירור והתכווצות בלב 11-13 ברמה של התא הבודד שמשלים in vivo המודלים העכבר. עם זאת, החוסר של שורות תאים נאותות המשקפות את מבנה CM המבוגר ותפקוד היה מגבלה משמעותית. חוקרים ביקשו להתגבר על זה על ידי לימוד חלבונים בודדים, כגון תעלות יונים, במערכות ביטוי Heterologous 14, ובעוד מחקרים אלו סיפקו לנו מידע שימושי במונחים של ביופיזיקה ערוץ יון או סחר בחלבון, ייצוג לקוי של microenvironment יליד CMS הוא מגבלה משמעותית. שנית, מאחר שרוב תאי Heterologous אלה אין לי מנגנון התכווצות בוגר, זה לא היה אפשרי ללמוד לתפקד התכווצות ואת יחסי גומלין המורכבים שבין רגישות והתכווצות הסלולריות. מסיבה זו, חוקרים פנו לתרביות תאי לב עיקריות לרבים מהמחקרים במבחנה הפונקציונליים שלהם. לבסוף, מחקרי cardiomyocyte מבודדים מאפשרים הערכה של תפקוד התכווצות ללא גורמי בלבול של הכנה רב תאית הכוללים את ההשפעה של צלקת או סיסטיק וכיוון סיבים.

שריר לב של חדר עכברוש בילוד ראשי (NRVMs) הם קלים יחסית לתרבות, יכול להיות נגוע בadenoviruses וlentiviruses לתפעל ביטוי גנים 15,nd היה בשימוש ולכן בהצלחה 1, אבל יש מגבלות משלהם. למרות שהם מספקים microenvironment פיסיולוגי 1 והיה סוס העבודה של שדה האיתות, הבדלים משמעותיים בין המורפולוגיה וארגון subcellular של NRVMs וcardiomyoctyes מבוגרים להפוך אותם למודל לקוי לחקירה והנתיבים יוניים וצימוד עירור והתכווצות בלב המבוגר . בעיקר NRVMs חסר משנה t-צינורי סופי 4. מאז Ca 2 + שטף ודינמיקה הם תלוי באופן קריטי על חולצת צינורי בוגר וreticulum sarcoplasmic (SR) מבנה 6, Ca 2 + דינמיקה ומחקרים תפקודיים של התכווצות הלב בNRVMs אינם השתקפות מדויקת של תהליכים הקריטיים אלה בשריר לב מבוגר. יתר על כן, חלק מהרכיבים של מסלולי איתות שונים בין עכברי יילודים ומבוגרים 9, ובכך לספק מגבלה אחרת ללימוד תהליכי מחלה ואניmpact על רגישות סלולרית והתכווצות בNRVMs. לבסוף, ההפצה של מכונות ההתכווצות מובילה לקיצור תא multidirectional ולא אחיד המגביל את הדיוק של מדידות ההתכווצות.

השימוש בשריר לב למבוגרים מבודד מספק לכן מערכת מידול מדויקת יותר במבחנה. הצמיחה יוצאת דופן של ידע מתאפשרת על ידי המניפולציה הגנטית של עכברים מדגישה את החשיבות של השגת שריר לב מבודד פונקציונלי מעכברים. למעשה, האפיון של CMS למבוגרים מבודדים ממודלי עכבר יש לשפוך אור על אירועים ביולוגיים ופתולוגיים רבים. CMS מבודד ממודלי עכבר מהונדסים איפשר ללימודים מהרווח או אובדן התפקוד של חלבונים על תכונות ההתכווצות של תאים בודדים 2,16, והכדאיות במודלים של מחלה כגון איסכמיה / reperfusion 17,18, ובכך משלים את המידע שנצבר ב מחקרי vivo עלעכברי se. שימוש במבוגרים מבודדים CMS ממודלים עכבריים למחלת לב נרכש 3,19,20 (כגון עומס יתר לחץ רוחבי אב העורקים נגרם התכווצות, כי יתר לחץ דם מחקה או היצרות מסתם אאורטלי) או פעילות גופנית 5,21 (לדוגמנות היפרטרופיה פיזיולוגית) מאפשר לבדיקה של האינטראקציה של מפלי איתות מעורבים בתהליכים אלה עם רגישות סלולרית וצימוד עירור והתכווצות ברמה של התא הבודד. יתר על כן, היכולת לתפעל ביטוי גנים באמצעות ביטוי מונע adenoviral גן במבוגרים CMS מאפשרת לנו את ההזדמנות לנתח את המרכיבים של מסלולי איתות מורכבים.

מנקודת מבט של אלקטרו, מתח כל התא וניסויים מהדק הנוכחיים על מבוגרים מבודדים CMS היו קריטיים בהבהרת אופי והנתיבים יוניים בתחילת מחקר ובמצבי מחלה שונות. בגלל המבנה המורכב של קרום התא וההגנה של מחזור ההפרשבמבני פיגומים בין המבוגרים CMS וNRVMs או שורות תאי Heterologous, את יכולת תיקון תאים בוגרים נותנת ייצוג טוב יותר של ההשפעות של חלבונים מסוימים בממברנה, חלבונים מבניים, ושותפים באינטראקציה ערוץ יון ברכיבי אלקטרו של הלב המבוגר.

למרות יתרונות בולטים כגון בלימוד cardiomyocytes העכברי מבוגר, בידוד וculturing cardiomyocytes עכברים הבוגר כבר מאתגר, דוחק את הצורך בתיאור שיטתי ומדויק של המתודולוגיה לבודד את שריר לב עכבר קיימא ולשמור אותם בתרבות כדי לאפשר מניפולציה גנטית נוספת באמצעות ויראלי וקטורים. מחקרים קודמים השתמשו גם CMS המבוגר עכבר חריפות מבודדת או מבוגר חולדה בתרבית CMS. זה האחרון קל יותר לתרבות מאשר עכבר מבוגר CMS, ורוב ניסויי מניפולציות ביטוי גנים במבחנה השתמשו מבוגר CMS חולדה. מחקרים מעטים שינו בהצלחה וחקרו functiביטוי onal גן במבוגרי עכבר CMS, הצגת מגבלה גדולה בהיקף של ניסויים. לכן, כאן אנו מציגים בפירוט מתודולוגיות כגון, שונה מחקירות קודמות, לבידוד 7,8,22, תרבות 3,10,15,23, זיהום adenoviral 11-13,15, וניתוח פונקציונלי של cardiomyoctyes חדרית עכבר מבוגר. תוצאות פרוטוקול הבידוד הזה בCa 2, cardiomyocytes להתרגש + הסובלני שיש לנו בהצלחה בתרבית למשך עד 72 שעה וtransiently transfected עם adenovirus. הפונקציונליות של תאים מבודדים אלה ניתן להעריך באמצעות מערכת MMSYS ההדמיה 14,24 ומהדק תיקון, שגם יידון.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. בידוד Cardiomyocyte

חומרים (איור 1)

Microdissecting מלקחיים
מלקחיים רקמות
מלקחיים עוצר דמום עדינים
מלקחיים עוצר דמום
Microdissecting מלקחיים, משוננים, מעוקלים
מספריים הפעלה, ישר
מספריים הפעלה, מעוקל
15 צינורות מיליליטר פלקון (5)
60 מ"מ צלחת פטרי
בופר פוספט (PBS)
גודל נקבובית 400 מיקרומטר - רשת ניילון
משפך קטן
מצופה שעווה, משי קלוע 4-0, 19 מ"מ, 7-10 סנטימטר
מחט ללא תת עורי, קצה קהה, 24 G או מחט מסחרית האכלת בעלי חיים (24 ​​x 1 ב, W/1-1/4)
נתרן הפרין
תערובת קטמין / xylazine
פיפטות פסטר
OptiVision ביתור משקפי
מערכת IonOptix MMSYS

הערה: אם culturing תאים, ראה סעיף 2 בתרבית תאים לפני תחילת פרוטוקול זה.

הערה: כל העכברים טופלו במתקן מכשול והקריב על פי תקנות שאושרו IACUC, שיטות עבודה, ונהלים.

הערה: לפני תחילת ההליך, המערכת כולה צריכה להיות שחומם מראש על מנת להבטיח כי כל האלמנטים של מערכת Langendorff (איור 2 א, איור 3) הם חיממו ל37 מעלות צלזיוס, כדי לאפשר פעילות collagenase נכונה ומלאה.

  1. הזרק עכברים בוגרים (~ 12 שבועות) עם 150 יחידות USP הפרין נתרן לתוך חלל הבטן.
  2. הרדימי עם הזרקה של תערובת קטמין / xylazine במינון משקל תלוי (טבלה 1).
    1. 80:12 מ"ג / קילוגרם קטמין: מתכון xylazine: 2.6 מיליליטר קטמין (100 מ"ג / מיליליטר) + 0.4 מיליליטר xylazine (100 מ"ג / מיליליטר) + 37 מיליליטר PBS. סופי: קטמין = 6.5 מ"ג / מיליליטר; xylazine = 1 מ"ג / מיליליטר
  3. לאבטח את העכבר מסומם למשטח ההפעלה, בלו, הלב, ואת המקום לתוך צלחת של טמפרטורת חדר PBS או מלוח 0.9% (איור 1J). PHYמלוח siologic מאפשר הלב שלם לחוזה להבלטה טובה יותר של דם בתא וזיהוי קל של אב העורקים לפני צעד 1.6. עכברים נבדקו כדי לוודא שהם בהרדמה עמוקה באמצעות אובדן של רפלקס האחורי איבר הבוהן קמצוץ והאטה בקצב נשימה לפני תחילתה של פתיחת בית החזה.
  4. השתמש במשקפי מגן OptiVision לנתח (איור 1 א) כדי לזהות ולחשוף את אב העורקים. הסרת הרקמה סביב אב העורקים, אם כי היא עושה להקל על ויזואליזציה של כלי השיט, אינה הכרחית לאופטימיזציה של בידוד התא אם שורש האאורטה נראה בבירור.
  5. ראש המשאבה עם חיץ זלוף (טבלה 2). טמפרטורה צריכה להיות מוחזק על 37 מעלות צלזיוס לאורכו של ההליך באמצעות מבוקר, מחזור אמבט מים (איור 2 ד).
  6. הר הלב על מנגנון Langendorff (איור 2 א). שימוש בשני מלקחיים מיקרו לנתח (איורים 1D-E), יחסי ציבורIME אב העורקים סביב המחט שאינה תת עורי, בוטה הסוף (24 G) עם שפופרת סיליקון בקצה הדיסטלי. לחלופין מחט מסחרית האכלת בעלי חיים (24 ​​x 1 ב, W/1-1/4) יכולה לשמש. שפופרת סיליקון על מחט 24 G או מחט הזנת בעלי החיים תאפשר לאבטחת התפר מעל החריץ. הנח את אב העורקים על המחט כמו גרב. (איור 2 ג).
    1. הערה: חשוב להיות בטוח כי בסופו של המחט נשען באב העורקים עולים, באופן אידיאלי בדיסטלי שורש אב העורקים לinnominate הנכון, אבל שזה לא להאריך דרך שסתום אב העורקים לתוך החדר השמאלי, כפי שזה יהיה קשה להגביל את יכולתם של המאגרים לינקבו ביעילות דרך הלב דרך העורקים הכליליים.
  7. אבטח את הלב למחט על ידי קשירת אורך קטן של משי תפירה (ארוך 7-10 סנטימטר) (איור 1K) סביב החלק העליון של אב העורקים, להבטיח כי העניבה היא ברמה של אב העורקים עולים, מתחת לarter innominate תקיןy, אבל הוא מעל לקצה של המחט.
  8. מנמיכים את הלב לתוך הפנים של הזכוכית החרוט (איור 2 ב) כדי לעזור לשמור על טמפרטורת סביבה מתאימה.
  9. Perfuse הלב עם חיץ זלוף במשך 5 דקות בקצב של 1 מיליליטר / דקה ומהדק את תזרים תא זכוכית כדי לאפשר perfusate לאסוף בזכוכית חרוטי ומעטפת הלב. סכמטי ללעכל את הלב מוצג באיור 3.
    1. בשלב זה אתה צריך לראות את היקף גידול הלב. בנוסף, דם ברקמת לב יוחלף perfusate, גורם לחיוורון רקמות.
  10. שחרר את מהדק יצוא לניקוז perfusate. עצור את המשאבה כדי להעביר את צינורות ממכל חיץ זלוף למכל אנזים החיץ (2E איור). הפעל מחדש את המשאבה להתחיל תנקבו לב עם חיץ אנזים (טבלה 2) בשעה 1 מיליליטר / דקה. הצמד את תזרים שוב כדי לאפשר לחיץ האנזים למעטפהלב.
    1. כאן, כמו האנזים מרוסס הלב ולעכל את רקמת חיבור, הלב יהפוך חיוור והשלמות המבנית תקטן.
    2. כדי לקבוע מתי לחתוך את החדרים מהלב מתעכל, להרים את הלב מהזכוכית בצורת חרוט, בעדינות לסחוט את הלב עם מלקחיים ולאסוף כמה טיפות של perfusate בצלחת פטרי קטן ולבדוק אם או לא תאים בודדים יורדים .
    3. למתחילים כדאי לחבר את קו זלוף עם מד לחץ. כאשר הלב הוא מקבל מתעכל במהירות הלחץ יירד, כרקמת חיבור אינה מחזיקה בהתנגדות. מד הלחץ הוא גם שימושי עבור הטירון כדי להבטיח שעמדתה של המחט היא מעל לשסתום אב העורקים ולא בחדר. לחץ נמוך יציין כי המחט היא בתא חדרית ולחץ גבוה מצביע על כך שהמחט נוגעת בשסתום.
  11. חותכים את חדרי לב מהלב לתוך צלחתמלא של חיץ העברה (א) (טבלה 2) כאשר לחץ חדרית מתחיל לרדת באופן דרמטי, או כאשר אתה מסוגל לראות את תאים בודדים בperfusate. זה בדרך כלל לוקח ~ 7-10 דקות.
  12. שוב באמצעות מלקחיים לנתח מיקרו (איור 1 ג), ברר בחדרים לחתיכות קטנות כדי לנתק. עיכול מוצלח יעזוב כמעט ולא גושים מוצקים של רקמה לאחר מיותר, עם רוב של הרקמה הופכים אמורפי על דיסוציאציה.
    1. כדי לנתק עוד יותר את הרקמות, פיפטה הפתרון / יציאה באמצעות פיפטה פסטר מפלסטיק (איור 4) שממנו טיפ נחתך בזווית ~ 45 °. שינוי זה משמש כדי להגדיל את השטח הגמור הפנימי של קצה פיפטה ובכך להקטין את כמות לחץ גזירה על התאים כמו הרקמה triturated.
    2. לפני לנתח את הרקמה עם המלקחיים זה אפשרי להפריד את התאים הבודדים ובנפרד לנתק פרוזדורים, חדר שמאלי או righתאי חדרית לא.
  13. לאבטח את רשת הריבוע (איור 1M) למשפך קטן (איור 1 ליטר) באמצעות מהדק ולמקם את מנגנון הסינון הזה לתוך צינור פלקון 15ml (איור 1I).
  14. השתמש פיפטה פסטר שונה כדי להסיר את פתרון תא מצלחת ולסנן את התמיסה לתוך צינור פלקון.
  15. אפשר התאים חיים כדי ליישב לתחתית של התחתית (שקיעת תא חי צריכה לקחת 2-4 דק ').
  16. 2.5ml aliquot של כל אחד מארבעת פתרונות סידן (לוח 3) ל 4 צינורות נפרדים בז 15ml.
  17. שוב באמצעות פיפטה פסטר סטנדרטית, להסיר בזהירות את התא גלולה מהחלק התחתון של הצינור ולהעביר את התאים הראשונים של הפתרונות בסידן.
  18. אפשר התאים להתיישב לתחתית של התחתית וחזור על שלב 1.17 בפתרונות סידן שלאחר מכן עד שהתאים נמצאים בפתרון האחרון.
  19. אל תתנו לתאים להתיישב בfourtפתרון סידן שעות. שווי הצינור ולהפוך אותו על צדו.

2. תרבית תאים

  1. לפני הבידוד, UG צלחת 1 / laminin מיליליטר טבעי העכבר על coverslips זכוכית והדגירה במשך שעה לפחות 1 ב 37 מעלות צלזיוס ו -2% CO 2. כמו כן מאפשר ציפוי שלך ותקשורת והתרבות (לוח 4) כדי לחמם באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס, 2% CO 2. זה מאפשר CO 2 המומס בתקשורת כדי לאזן.
    1. אל תסיר את הראש מהתקשורת. פשוט לשחרר את הראש, כדי למנוע זיהום.
  2. אפשר התאים המבודדים כדי גלולה בחלק התחתון של צינור פלקון.
  3. הסר את גלולה באמצעות פיפטה סטנדרטית פלסטיק פסטר ו resuspend בכמות המתאימה של ציפוי תקשורת.
  4. פלייט התאים על coverslips מצופה laminin בצלחת בגודל המתאימה ודגירה ב37 מעלות צלזיוס, 2% CO 2 למשך לפחות 30-60 דקות, כדי לאפשר לתאים לדבוק coverslips.
  5. ** אם transfecting עם adenovirus, לדלל את הנגיף בכמות מתאימה של תקשורת ציפוי ולהחליף את תקשורת ציפוי בצלחת עם התקשורת המכיל וירוס. בואו הווירוס לדגור על התאים במשך שעה 2 ב37 מעלות צלזיוס, 2% CO 2. **
  6. הסר את המדיה ציפוי מהמנה ולהחליף עם תקשורת ותרבות.
  7. לשנות בזהירות את התקשורת והתרבות בכל יום, כדי שלא להפריע לתאים על coverslips.

באמצעות הליך זה, תאים היו תרבותיים בהצלחה עד 72 שעה. ניתן למצוא תמונות של תאים בתרבית וGFP transfected באיור 5.

3. מערכת MMSYS

  1. כוח מערכת MMSYS להבטיח כי מנורת הקשת היא יזם ראשון.
  2. חבר את הצינורות מהמשאבה לכניסה המתאימה ושקעים של חדר MMSYS (איור 6).
  3. ראש המערכת עם מאגר סידן (ב) (טבלה 2).
  4. הנח apprcoverslip זכוכית opriately בגודל לתוך התא ולהדק (איור 6E). רוב תאי MMSYS להשתמש גם מ"מ 22 או 25 מ"מ coverslips המרובע. התייעץ עם המדריך למשתמש MMSYS שלך כדי לקבוע את coverslip המתאים לחדר שלך.
  5. העבר 500 μl של פתרון תא צינור Eppendorf קטן.
  6. הוסף 0.5 μl Fura2-AM (פתרון מניות של מיקרוגרם / μl 1) לצינור הקטן של תאים ולאפשר להם לדגור בחושך על RT במשך 5-7 דקות. זה מאפשר Fura2-AM ל" עומס "לתוך התאים באמצעות דיפוזיה פסיבית מהירה דרך קרום התא.
    1. בואו פורע-2 התאים הטעונים גלולה לחלק התחתון של הצינור, ולשטוף את הפורע העודף עם 500 μl של B. חיץ סידן
  7. כבה את האורות בחדר.
  8. בעזרת פיפטה פסטר סטנדרטית, הירידה 1-2 טיפות (תלוי בריכוז התאים) של הפתרון "הטעון" התא למרכז החדר (איור 6 ג) ולאפשר לתאי To להתיישב על coverslip למשך 5 דקות.
    1. הצפיפות של התאים בתא צריכה להיות כזה שניתן לראות בתאים שאינם חופפים אחת בקלות בפלטפורמת רכישת נתונים MMSYS.
  9. יתחיל בזהירות לזרום חיץ סידן (ב ') דרך החדר.
  10. להעלות את טמפרטורת החדר עד 37 ° C.
    1. חשוב: אל תפעיל את מנגנון החימום עד שהזרימה כבר יזם. זה יכול לגרום נזק חמור לthermocoupler המשוב (איור 6 א).
  11. ודא שהחדר מחובר לMyoPacer באמצעות חוטי חיבור (איור 6) ולהתחיל לפסוע התאים 5 הרץ ב1.5x סף צעדה לתאים.
  12. בחר תא שפועם בתדר הנכון ולהעביר אותו לתוך הפתח המסגור.
  13. התאם את ממדי צמצם מצלמה ומסגור, כך שכל התא נמצא במרכז החלון, בבימויו בצורה אופקית, עם ap sarcomeresהורה.
    1. לאורך תא להתאים את אדום וירוק (ימין ושמאל) אינדיקטורים דיודת אור לקצה של התא. כוון את הניגודיות כדי לייעל את הניגוד בשחור / לבן בקצוות של התא. עיין במדריך לIonoptix לפרטים נוספים.
  14. מניחים את התיבה בשטח של התא המכיל sarcomeres מוגדר היטב ולהתאים את הפוקוס כדי לייעל את השיא של ספקטרום ההספק (אדום). גם להתאים את הבהירות של מיקרוסקופ כדי לייעל את חלון החלקה הכחול ומידע ניגוד שחור.
  15. התאם את סורגי סף הירוקים כדי ללכוד כמה שיותר מספקטרום הכוח האדום (שיא) ורקע מעט ככל האפשר.
  16. להתחיל בהקלטה.
  17. אחרי מספיק נתונים כבר נרשמו, לחץ על "השהה" כדי לעצור את ההקלטה באופן זמני, והבטחה כי לא הפוקוס ולא הממדים של חלון הצפייה משתנים, לעבור השלב של מיקרוסקופ כדי שטח של coverslip שבו לא תאים או חומר תאי יכולים להיות ראה. לןGTH של הקלטה משתנה בהתאם לפרוטוקול הניסוי של החוקר.
    1. הערה: לחיצה על "עצור" יהיה לסיים את ההקלטה וללא רקע יוכל להיות מוקלט לתא זה.
  18. לחץ על "קורות חיים" כדי להקליט את מדידה ברקע.
  19. אחרי מספיק רקע כבר נרשם לחץ על "עצור" כדי לסיים את ההקלטה.
  20. לחץ על "קובץ >> שמור" כדי לשמור את כל העקבות לתא כי ב. קובץ zpt אחת.
  21. חזור על שלבים 3.12-3.20 עד מספיק תאים נרשמו כבר.
  22. התייעץ עם המדריך למשתמש IonOptix-MMSYS 12 לקבלת הוראות על ניתוח של הנתונים שנרשמו. הנתונים שנרשמו אופייניים לשריר לב פראי מהסוג מוצגים באיור 7.

4. הצמד תיקון

הידוק תיקון של סוגי תאים שונים תוארו גם בעבר בכתב עת זה 25-28. לכן אנו מתמקדים בכמה מבקרהפרמטרים אל להידוק תיקון מוצלח של שריר לב למבוגרים מבודדים באמצעות הפרוטוקול שלנו תאר.

  1. באמצעות חולץ פיפטה וזכוכית בורוסיליקט (עם נימה: 1.5 מ"מ OD, מזהה 0.86 מ"מ - אורך סנטימטר 10) למשוך פיפטה שמפגינה ~ 2.0-3.0 MΩ כאשר התמלא פתרון פיפטה (לוח 5).
  2. אש פולנית קצה פיפטה בעדינות באמצעות Narishige או לטש אש אנכי אחר. ההתנגדות של פיפטה את התיקון צריכה להיות 2-4 MO לאחר ליטוש אש.
  3. הפעל את המחשב, מגבר (Axopatch 200B), ממיר AD (Digidata 1440A, אקסון מכשירים) וMicromanipulator (MP-285). להידוק תא כל תיקון, אנחנו מתחילים עם פרמטרים סטנדרטיים כפי שתואר לעיל.
  4. למבוגר מתורבת CMS, להסיר אותם מהחממה ולשטוף בעדינות את coverslip על שCMS הם מצופים עם PBS בטמפרטורת חדר.
  5. להסיר בעדינות את coverslip ולמקם אותו בחדר זלוף במיקרוסקופ ההפוכה (ניקון TE 2000).
    1. ודא כי הכניסה למערכת זלוף והשקע (שאיבה) הן רק מעל פני השטח של coverslip.
  6. התחל מרוסס עם הפתרון המתאים במיוחד סלולארי (לוח 5).
  7. למבוגרים טריים ניתקו CMS, במקום coverslip מצופה קולגן במערכת זלוף כאמור לעיל.
    1. מאז התאים יהיו בפתרון, בעדינות להחליף את הפתרון עם חיץ תאי.
  8. באמצעות פיפטה פסטר שונה (איור 4), בעדינות resuspend תאי החיץ תאי, קח aliquot ולמקם אותו על coverslip.
  9. בואו התאים לצרף ל10-15 דקות לפני תחילת זלוף כמו ב4.4.
  10. גב למלא את כל פיפטה תיקון תא עם חיץ התוך תאי באמצעות Microfil (מכשירי Precision עולם, 28 G) מחט. ודא שאין בועות אוויר בקצה פיפטה; לטפוח בעדינות על מנת לאפשר לבועות האוויר לצוף לsurface מהפתרון.
  11. צרף את פיפטה את התיקון המלא עד פיפטה בעל, על מנת להבטיח כי יש קשר בין microelectrode והפתרון הפנימי.
    1. אנו משתמשים באלקטרודות כלוריד כסף, אבל לדאוג ל'chloriding 'חוטי הכסף לפחות פעם בשבוע על ידי טבילת הלילה באקונומיקה.
  12. בעדינות להוריד את פיפטה לתוך האמבטיה, להבטיח כי את האלקטרודה האמבטיה היא שקועה כל הזמן בפתרון האמבטיה / חוץ תאי. לקזז כל פוטנציאלי צומת נוזלים בשלב זה. פוטנציאלי צומת גדולים עשויים להיות סימן של הידרדרות כלוריד כסף על האלקטרודות.
  13. מבוגרים גליליים בריאים CMS מזוהה במיקרוסקופ ומרוכז בשדה ראייה. כפי שתואר לעיל, בשילוב של העברת micromanipulator והתאמת המיקוד מאפשר לסמיכות של פיפטה את התיקון ופני השטח של CM.
    1. ברגע שהם נמצאים באותו מישור המוקד, אנו משתמשים בשילוב של ראייהנפל על קרקע פורה של התא ודופק בדיקה (זמין ב200B Axopatch).
    2. לאחר ההתנגדות של פיפטה פוחתת בחצי (המצביע על כך פיפטה נמצאת במגע עם פני השטח של התא), והתא ממשיך לחפש גלילי, אנו קובעים חותם gigaohm באמצעות שאיבה עדינה.
    3. עבור CMS, אנו מעדיפים את הפה יניקה להקים לחץ שלילי. אם gigaseal מתקבל בהצלחה, אנחנו שוב משתמשים ביניקת פה קצבית עדינה 'פריצה' לתא להקים מצב תא כל תיקון.
  14. פוטנציאל מנוחה טיפוסי של CMS בריא הם בסדר הגודל של -85 ל-90 mV. ברגע שgigaseal מתקבל, למדוד את פוטנציאל הממברנה מנוחה באמצעות מהדק הנוכחי עם I = 0 רשות.
    1. אם פוטנציאל הממברנה המנוחה הוא depolarized זה יכול להצביע על תאים פגומים או חותם עני.
  15. בגלל CMS הם תאים גדולים עם הרבה שטח פנים, תשומת לב קפדנית צריכה להיות משולמת לקיבול פיצוי, במיוחד wזרמי תרנגולת מהירות הפעלה כגון ערוץ נתרן צריך להיחקר. אם לא ניתן להשיג פיצוי קיבול הולם באמצעות נבנה בהגדרות פיצוי על הגנרטור הדופק, prepulses במתח סף תת וקוטביות הפוכה עשויה להיות מיושמת ונוכחי כתוצאה מפחית את האות המוקלטת. כגון פרוטוקול לתכנת בקלות בAxopatch.
  16. ברגע שמצב תא כל תיקון כבר נקבע, לחכות 15 דקות, כדי לאפשר איזון וכדי להבטיח את היציבות של החותם לפני תחילת מתח או פרוטוקולי מהדק הנוכחיים. אנו משתמשים בפרוטוקולים סטנדרטיים שתוארו בעבר ובכתבי עת אחרות, ולא הרחבנו עליו.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

הבידוד של תוצאות cardiomyoctyes מבוגרים בתאים בצורת מוט, מפוספסים, ושקטים (לא באופן ספונטני מכות) (איור 5 א). תאים מתים ייראו מעוגלים ולא פסים יהיו נוכחים. תאי רגיעה יכולים להיות מתורבתים וtransfected עם adenovirus כדי לתפעל ביטוי גנים (5B דמויות ו5C). לאחר 24 שעות של תרבות, את המורפולוגיה של תאי חיים לא משתנות, הם עדיין Ca 2 +, סובלני, והם יכולים להיות בקצב על ידי גירוי תחום. בהליך המוצע, תשואה של תאי קיימא 80-90% יכולה להיות מושגת.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

בדו"ח זה, שתארנו את הטכניקות הדרושות לבידוד מוצלח ותרבות של המבוגרים CMS מלב העכבר. הטכניקה שלנו מאפשרת למחקר הבא של פונקצית CM ורגישות תוך שימוש בשיטות שתוארו לעיל. הפרמטר הקריטי ללימוד פונקציונלי של המבוגרים CMS הוא הבריאות ואיכות CMS המבודד. כפי שתואר לעיל, הטכניקות שלנו מאפשרות לתשואה גבוהה של תאים פונקציונליים הניתנים למניפולציה של ביטוי גנים באמצעות זיהומי adenoviral / lentiviral בתרבות, וניתוח של רגישות סלולרית ותפקוד התכווצות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
נתרן כלוריSigmaS7653
אשלגן כלוריSigmaP9333
מגנזיום כלורידSigmaM8266
HEPESSigmaH3375
נתרן פוספט מונו-בסיסיSigmaS8282
D-גלוקוז מינימוםSigmaG8270
טאוריןסיגמאT0625
2,3-בוטנדיון מונוקסייםסיגמאB0752
קולגנאז Bרוש מדע יישומי11088807001
קולגנאז Dרוש מדע יישומי11088858001
פרוטאז XIV מ- Streptomyces griseusSigmaP5147
אלבומין מסרום בקרסיגמאA2153
סידן כלורידסיגמאC8106
מדיה חיונית מינימליתסיגמא51411C
תמיסת אלבומין מסרום בקרסיגמאA8412
L-גלוטמיןסיגמאG3126
פניצילין-סטרפטומיציןסיגמאP4333
אינסולין-טרנספרין-נתרן סלניט מדיה תוסףSigmaI1884
צזיום כלורידסיגמא289329
GlutamateSigmaG3291
Adenosine 5'-triphosphate מלח מגנזיוםSigmaA9187
אתילן גליקול-ביס(2-amin– thylether)-N,N,N',N'-חומצה טטראצטיתSigmaE3889
תמיסת צזיום הידרוקסידSigma232041
תמיסת Tetraethylammonium hydroxideSigma86643
OptiVisor משקפת זכוכית אופטיתDohegan Optical Company Inc.מלקחיים לרקמות N/A
, 5.5 אינץ', 1x2 שינייםRoboz ScientificRS-8164
מלקחיים מולוני - 4.5 אינץ' (11.5 ס"מ) עקומה קלה ארוכה, משוננת Roboz ScientificRS-8254
Dumont #3 מלקחיים, Dumostar, גודל קצה 0.17 x 0.10 מ"מRoboz ScientificRS-4966
Packer מלקחיים יתושים 5 אינץ' ישרשטוח Roboz ScientificRS-7114
מספריים מיקרו חיתוך 4.5 אינץ' מעוקל חד / חד Roboz ScientificRS-5917
מספריים מיקרו חיתוך 3.5 אינץ' ישר חד / חד 20 מ"מRoboz ScientificRS-5907

מקורות

  1. Chlopcikova, S., Psotová, J. Neonatal rat cardiomyocytes-a model for the study of morphological, biochemical and electrophysiological characteristics of the heart. Biomedical Papers. , (2001).
  2. Rosenthal, N., Brown, S. The mouse ascending: perspectives for human-disease models. Nat. Cell Biol. 9, 993-999 (2007).
  3. Ballou, L. M., Lin, R. Z. Rapamycin and mTOR kinase inhibitors. J. Chem. Biol. 1, 27-36 (2008).
  4. Brette, F., Orchard, C. T-Tubule Function in Mammalian Cardiac Myocytes. Circ Res. , (2003).
  5. Sakata, Y., Hoit, B., Liggett, S., Walsh, R. Decompensation of pressure-overload hypertrophy in G?q-overexpressing mice. Circulation. , (1998).
  6. Lieu, D. K., et al. Absence of Transverse Tubules Contributes to Non-Uniform Ca 2+Wavefronts in Mouse and Human Embryonic Stem Cell-Derived Cardiomyocytes. Stem Cells and Development. 18, 1493-1500 (2009).
  7. Lim, H., De Windt, L., Mante, J., Kimball, T. Reversal of cardiac hypertrophy in transgenic disease models by calcineurin inhibition. J. Mol. Cell Cardiol. 32 (4), 697-709 (2000).
  8. Muthuchamy, M., et al. Mouse model of a familial hypertrophic cardiomyopathy mutation in alpha-tropomyosin manifests cardiac dysfunction. Circ. Res. 85, 47-56 (1999).
  9. Müller, J. G., et al. Differential regulation of the cardiac sodium calcium exchanger promoter in adult and neonatal cardiomyocytes by Nkx2.5 and serum response factor. J. Mol. Cell. Cardiol. 34, 807-821 (2002).
  10. Epstein, F., Hunter, J. Signaling pathways for cardiac hypertrophy and failure. New England Journal of Medicine. 341 (17), 1276-1283 (1999).
  11. Snopko, R., Aromolaran, A., Karko, K. Cell culture modifies Ca 2+ signaling during excitation-contraction coupling in neonate cardiac myocytes. Cell Calcium. , (2007).
  12. Ranu, H., Terracciano, C., Davia, K. Effects of Na+/Ca2+-exchanger overexpression on excitation-contraction coupling in adult rabbit ventricular myocytes. J. Mol. Cell Cardiol. 34 (4), 389-400 (2002).
  13. Kaab, S., Nuss, H. B., Chiamvimonvat, N., O'Rourke, B., Pak, P. H., Kass, D. A., Marban, E., Tomaselli, G. F. Ionic mechanism of action potential prolongation in ventricular myocytes from dogs with pacing-induced heart failure. Circ. Res. 78 (2), (1996).
  14. Splawski, I., et al. Variant of SCN5A sodium channel implicated in risk of cardiac arrhythmia. Science. 297, 1333-1336 (2002).
  15. Zhou, Y., Wang, S., Zhu, W. Culture and adenoviral infection of adult mouse cardiac myocytes: methods for cellular genetic physiology. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 279 (1), 429-436 (2000).
  16. Sussman, M., Lim, H., Gude, N., Taigen, T. Prevention of cardiac hypertrophy in mice by calcineurin inhibition. Science. , (1998).
  17. Heinzel, F. R., et al. Impairment of diazoxide-induced formation of reactive oxygen species and loss of cardioprotection in connexin 43 deficient mice. Circ. Res. 97, 583-586 (2005).
  18. Li, X., Heinzel, F. R., Boengler, K., Schulz, R., Heusch, G. Role of connexin 43 in ischemic preconditioning does not involve intercellular communication through gap junctions. J. Mol. Cell. Cardiol. 36, 161-163 (2004).
  19. Rockman, H. A., Ross, R. S., Harris, A. N., Knowlton, K. U., Steinhelper, M. E., Field, L. J., Ross, J., Chein, K. R. Segregation of atrial-specific and inducible expression of an atrial natriuretic factor transgene in an in vivo murine model of cardiac hypertrophy. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 88, 8277-8281 (1991).
  20. Nakamura, A., Rokosh, D. LV systolic performance improves with development of hypertrophy after transverse aortic constriction in mice. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 281 (3), 1104-1112 (2001).
  21. Boström, P., et al. A PGC1-?-dependent myokine that drives brown-fat-like development of white fat and thermogenesis. Nature. 481, 463-468 (2012).
  22. Liao, R., Jain, M. Isolation, culture, and functional analysis of adult mouse cardiomyocytes. Methods Mol. Med. 139, 251-262 (2007).
  23. Volz, A., Piper, H. M., Siegmund, B., Schwartz, P. Longevity of adult ventricular rat heart muscle cells in serum-free primary culture. J. Mol. Cell. Cardiol. 23, 161-173 (1991).
  24. Guatimosim, S., Guatimosim, C., Song, L. -S. Methods in Molecular Biology. 689, Humana Press. 205-214 (2010).
  25. Yang, J., Delaloye, K., Lee, U. S., Cui, J. Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes. J. Vis. Exp. (47), e2269(2011).
  26. Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. Patch Clamp Recording of Ion Channels Expressed in Xenopus Oocytes. J. Vis. Exp. (20), e936(2008).
  27. Arman, A. C., Sampath, A. P. Patch Clamp Recordings from Mouse Retinal Neurons in a Dark-adapted Slice Preparation. J. Vis. Exp. (43), e2107(2010).
  28. Wen, H., Brehm, P. Paired patch clamp recordings from motor-neuron and target skeletal muscle in zebrafish. J. Vis. Exp. (45), e2351(2010).
  29. Maier, S., Westenbroek, R. An unexpected role for brain-type sodium channels in coupling of cell surface depolarization to contraction in the heart. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99 (6), 4073-4078 (2002).
  30. Shroff, S. G., Saner, D. R., Lal, R. Dynamic micromechanical properties of cultured rat atrial myocytes measured by atomic force microscopy. Am. J. Physiol. 269, 286-292 (1995).
  31. Domke, J., Parak, W. J., George, M., Gaub, H. E., Radmacher, M. Mapping the mechanical pulse of single cardiomyocytes with the atomic force microscope. European Biophysics Journal. 28, 179-186 (1999).
  32. Smith, B. A., Tolloczko, B., Martin, J. G., Grütter, P. Probing the Viscoelastic Behavior of Cultured Airway Smooth Muscle Cells with Atomic Force Microscopy: Stiffening Induced by Contractile Agonist. Biophysical Journal. 88, 2994-3007 (2005).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

בידוד, תרבות ואפיון פונקציונלי של Cardiomyoctyes מאוס למבוגרים
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.