דפוסי שיתוף תרבות נייד באמצעות מערכות מימיות שני שלבים

Summary

מערכות מימיות שני שלבים שמשו בו זמנית לאוכלוסיות רבות הדפוס של תאים. השיטה מהירה וקלה זה עבור דפוסי תא מנצלת את הפרדת פאזות של תמיסות מימיות של גליקול dextran ופוליאתילן ומתח interfacial שקיים בין שני פתרוני הפולימרים.

Abstract

טכנולוגיות דפוסים סלולריים, כי הם מהירים, קלים לשימוש ובמחיר סבירים שתידרשנה לפיתוח העתידי של מבחני תפוקה גבוהות סלולריים, פלטפורמות לחקר אינטראקציות תא סלולריים ומערכות רקמות מהונדסות. פרוטוקול מפורט זה מתאר שיטה ליצירת שיתוף תרביות של תאים באמצעות פתרונות ביולוגיים של dextran (DEX) ופוליאתילן גליקול (PEG) ששלב נפרד בשילוב ריכוזים מעל סף. תאים יכולים להיות תבנית במגוון תצורות המשתמשות בשיטה זו. דפוסי הדרת תא יכולים להתבצע על ידי הדפסת טיפין של DEX על מצע ומכסה אותם עם תמיסה של תאים המכיל PEG. מתח interfacial נוצר בין שני פתרוני הפולימר גורם לתאים לנפול סביב החלק החיצוני של טיפת DEX וליצור קרחת עגולה שיכול לשמש למבחני הגירה. איים סלולריים יכולים להיות תבנית על ידי מחלק שלב DEX תא עשיר לפתרון PEG או על ידי כיסוי DEXאגל עם פתרון של PEG. עמיתים לתרבויות יכולות להיוצר באופן ישיר על ידי שילוב של הדרת תא עם דפוסי האי DEX. שיטות אלה הן תואמות עם מגוון רחב של גישות טיפול נוזל, כולל micropipetting הידני, וניתן להשתמש בו עם כמעט כל סוג תא חסיד.

Introduction

מערכות של שתי שכבות מימיות (ATPSs) טופס כאשר פתרונות של שני פולימרים אינם תואמים מעורבבים בריכוזים גבוהים מספיק. הפרדת שלב מושפע ממגוון של גורמים, הכוללים את המשקל המולקולרי וקוטביות של הפולימרים, הטמפרטורה של הפתרונים, pH והתוכן יוני של ¹ הממס ^{המימי, 2.} הנקודה שבה שני פתרוני הפולימר הנפרדים נקבעים על ידי מאפייני physiochemical של מערכת השלב נבחר, אך בדרך כלל מתרחשת בריכוזי פולימר נמוכים (פחות מ 20% wt / wt) תחת הלא denaturing תנאים, המאפשרת ATPSs לשמש לביוטכנולוגיה יישומים ^3-9.

עד כה, ATPS הנחקר ביותר בהרחבה היא מערכת dextran (DEX) פוליאתילן גליקול (PEG) /. את ATPS נוצר על ידי פולימרים זולים וביולוגיים אלה תואר במקור עבור הטיהור של ביומולקולות בדרך של חלוקה מולקולרית ^{2, 10.} מחיצותמתרחש כאשר מולקולות נוספות או חלקיקים שאינם תורמים למערכת השלב מעורבבות עם PEG ו DEX. בהתבסס על הזיקות היחסיות שלהם לאו DEX או PEG, המולקולות או חלקיקים תהיינה מועדפות מתגוררות בתוך אחד משני השלבים או בממשק. מאפיין נוסף של PEG / DEX ATPS הוא קיומו של מתח interfacial בין שני שלבי הפולימרים. ATPSs נוצר על ידי PEG ו DEX בדרך כלל להציג מתחי interfacial כי הם נמוכים בהרבה ממערכות נוזל נוזל אחרות שני שלבים כמו שמן ומים, אולם כוחות מתח interfacial עדיין השפעות על חלקיקים קטנים כגון וירוסים, תאים ואגרגטים חלבון ^{2 , 11-13.} לבסוף, מאחר שמשקל המולקולרי הגבוה וPEG DEX הנפרד בריכוזים נמוכים (wt / wt לזני פולימרי משקל מולקולריים גבוהים פחות מ 5%) בנוכחות ריכוזים פיסיולוגיים של מלחים, יש כמה, אם בכלל, השפעות מזיקות על תאי יונקים שולבו בתוך אלה מערכות^14-16.

לאחרונה, את מאפייני interfacial ואפקטי חלוקת ATPSs יושמו על ידי המעבדה שלנו עבור דפוסי תא ^{14, 16-20.} זו הושגה פתרון DEX צפוף על מצעי תרביות תאים בנוכחות PEG ידי micropatterning. כאשר תאים שולבו שלב PEG, הם מנועים מלהיכנס לטיפי דקס עקב מתח interfacial PEG / DEX ^20. כאשר תאים הם בדוגמת בשלב DEX, הן נשמרות על פני השטח של מצע תרבית התאים במתח ובמחיצות ^{16, 17, 19} interfacial.

בניגוד לשיטות אחרות לדפוסי תא, תא דפוסי ATPS קלים ללימוד ודורשים ידע בסיסי על הפולימרים עצמם, והיכולת לבצע תרבית תאים ולהשתמש micropipettor בלבד. שיטות אחרות לדפוסי תא כרוך לעתים קרובות בציוד והכשרה מיוחדים שאינם מתורגמים בקלות לדואר מדעי חיים. לדוגמה, כמה שיטות (microcontact הדפסת הדפסה או הזרקת דיו) תאי דפוס בעקיפין על ידי יישום דפוסים של ביומולקולות הדבקה הסלולרית למצע תרבות שלאחר מכן ישמשו כאתרים לקובץ מצורף תא ^{21, 22.} למרות גישות עקיפות שימושיות לכמה סוגי תאים, הם דורשים רמה גבוהה של מיומנות משתמש וציוד מיוחד כדי להמציא כלי הדפוסים, ויכולים חסרי ייחוד בהתאם לסוג הדפוס / biomolecule המסוים של התאים. לחלופין, ניתן להפקיד תאים עם סגוליות דפוס גבוהות בדרך של גישות דפוסים ישירים הכוללות מינרית זרימת דפוסים, שכפול והדפסת דיו ^23-26. עם זאת, שיטות אלו דורשות גם מומחיות משתמש וציוד מיוחד, ויכולות לפגוע בתאים בתהליך ההדפסה. למרות שגישות אלו בדרך כלל לייצר דפוסים מדויקים של תאים, לדפוסי תא להיות כלי שימושי בתחום מדעי החיים, זה חייב להיות חסכוניnd פשוט ליישום.

כאן אנו מדווחים פרוטוקול מפורט ליצירת תרביות תאים בדוגמת באמצעות ATPSs המתואר ביישומים שלנו שפורסמו בעבר. שימוש micropipettors בלבד, משתמשים יכולים ליצור אזורים סלולריים הדרה או איים סלולריים עבור מבחני הגירה. זו מושגת בדרך של מתח interfacial PEG / DEX כי גם שומר תאים בשלב DEX או מוציא תאים הופקדו בשלב PEG מDEX. על ידי סריקת שתי טכניקות דפוסי יסוד אלה, ניתן במהירות כדי לייצר עמיתים לתרביות של תאים כמו תאי כבד פיברובלסטים שיתוף תרבויות. שיטות דפוסים, פרמטרי ATPS ותוצאות צפויות מתוארות בפירוט.

Protocol

1. אפיון מערכת שלב: ספים הקובע להפרדת שלב

1. הכן את פתרונות המכילים PEG ו DEX במאגר הרצוי או בינוני תרבית תאים כפי שמוצגים באיור 1 (נקודות סגולות) ב15 מ"ל או 50 צינורות חרוטי מ"ל. להלן, PEG ו DEX יתייחסו לPEG 35 kDa ו 500 דקס kDa, אולם ריכוזים קריטיים ישתנו בהתאם לשני הפולימרים המשמשים. רשום את המסה של PEG ו DEX בכל פתרון. פתרוני פולימר-ריכוז גבוה עשויים להימשך מספר שעות כדי להמס. Vortexing יכול לשמש לפתרוני סרום חינם. לתקשורת המכילה חלבונים או סרום, הנח את הצינורות על במה רועדת עד ששני פולימרי המסה מלאה. רשום את המשקל של חומרים המשמשים להמסה של הפולימרים ולרשום את הריכוזים הראשוניים.
2. לאחר הפולימרים הם התמוססו באופן מלא, את הפתרונים שאמורים להופיע מעוננים. זה הסימן הראשון שהפרדת פאזות התרחשה. כדי לאשר זאת, לאפשרפתרוני פולימר למנוחה במצב אנכי בטמפרטורת חדר למשך 20 דקות. צנטריפוגה ב 1000 XG ניתן להשתמש כדי להאיץ את תהליך הפרדת פאזות. השלב התחתון יהיה צפוף יותר DEX עשיר והשלב העליון יהיה PEG עשיר.
3. לאט להוסיף חיץ או מדיה נוסף לחצוצרות. מרווחים קטנים יש להשתמש כדי שלא לעבור את נקודת הפרדת פאזות.
4. כאשר התמיסה מתבהרת וכבר לא מפרידה בין שלב שאחרי צנטריפוגה, הסף להפרדת פאזות כבר הגיע. רשום את המשקל הסופי של הצינור.
5. שימוש במשקולות נרשמו הקודמות לפולימרים, יחד עם המשקל הסופי לאחר הוספת תקשורת, לקבוע wt% / wt של כל שני פולימרים שבהפרדת השלב כבר לא מתרחשת.
6. עלילת ערכים אלה כ% PEG wt / wt על ציר y ו% wt / wt DEX על ציר x. עלילה זו, המכונית עקומה binodal, ניתן להשתמש בו כדי לקבוע את ריכוז הסף להפרדת פאזות לconcentrati השונהתוספות של PEG / DEX במדיום תרבות תאים ספציפיים.

2. תצורת 1: דפוסי הרחקה (96 גם פורמט פלייט)

1. הכן את הפתרונים נפרדים של 5.0% wt / wt PEG ו 12.8% wt / wt DEX במדיום תרבות תא. השתמש בפתרוני ATPS של לפחות פעמים בנקודה הקריטית כדי להבטיח שATPS נשאר לאחר הפולימרים לאזן בכבוד זה לזה. יש כמות קטנה של שטף של DEX לשלב PEG העשיר ולהיפך, לכן, משום שעבד בסמוך לריכוז הקריטי יכול לגרום לאובדן של מערכת השלב כירידת ריכוזים מתחת לנקודה קריטית. כמו כן, העברת צלחת תרבית תאים לחממה ולחות הטמפרטורה מבוקרת יכולה לשנות את מאפייני שני שלבים ולבצע את שני פתרוני בליל. הערה: תאים מסוימים עשויים לתפקד טובים יותר עם ניסוחי ATPS אחרים. ניסוחים מקובלים עשויים להיות נבחרו בהתבסס על עקומות binodal נקבעו מהחלק 1.
2. לקצור את התאים שישמשו להדרת פאטrning. קבע את המספר / ריכוז הכולל של תאים זמינים. אופציונלי: לתייג את התאים עם CellTracker או תוויות שאינן ציטוטוקסיות אחרות למיקרוסקופ פלואורסצנטי.
3. גלולת התאים וresuspend הגלולה בנפח מתאים של 5.0% PEG כדי להשיג את המספר הרצוי של תאים להדרה. לדוגמה, אחד טוב של 96-צלחת גם דורש 37,500 תאי פיברובלסטים להיות resuspended ב200 μl של PEG לייצר מפגש ביום המחרת. הרחב את המספרים הללו כמתאימים לסוגי תאים אחרים וגדלי מצע תרבות.
4. שימוש micropipettor, לוותר על 0.5 טיפי μl של DEX על מצע תרבית תאים יבש. טיפי נפח גדולות יותר לייצר אזורי הדרה גדולות יותר. טיפין החל בגודל 0.1 עד μl 1 מומלצות לmicropatterning הדרה. אופציונלי: טיפי דקס ניתן להפקיד 24 שעות לפני הזמן ואפשרו להתייבשות בטמפרטורת חדר. זה יכול לייצר דפוסים נקיים יותר.
5. לוותר 200 μl של השעית תא PEG לתוך tהוא גם כדי לכסות את טיפי דקס.
6. מקום בחממת humidified עבור 12 שעות על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO _2. ודא כי הספלון אינו מוטה במהלך טיפול ושהוא נמצא על מדף חממת רמה, כדי למנוע שיבוש הדפוסים.
7. הסר את פתרון PEG ולשטוף שלוש פעמים עם 200 μl של מדיום התרבות.
8. הוסף מדיום התרבות טרי ולחזור לחממה.
9. לפקח על התרבויות מעת לעת כדי לבחון תנועת תא לאזור ההרחקה.

3. תצורת 2: דפוסי איילנד (פורמט פלייט 96-היטב)

1. הכן את הפתרונים של 5.0% wt / wt PEG ו 12.8% wt / wt DEX במדיום תרבות תא, כאמור לעיל.
2. לקצור את התאים שישמש לדפוסי אי. קבע את המספר / ריכוז הכולל של תאים זמינים.
3. הגלולה וresuspend התאים בנפח מתאים של 12.8% DEX כדי להשיג את הריכוז הרצוי של תאים עבור דפוסי אי. ריכוזים של 5000 לסה"נLLS / μl או פחות מומלץ לסוגי תאים מאוד חסידים. לתאים שיש להם קושי או תאים שמצרפים באופן רופף לדבוק, ריכוזים של עד 10,000 תאים / μl יכולים להיחשב.
4. עובד במהירות כדי למנוע התייבשות, פיפטה μl 0.5 טיפין של DEX על מצע תרבית תאים יבש, כמתואר לעיל. אל תאפשר טיפין לייבוש. אופציונלי: 200 μl של פתרון PEG ניתן להוסיף גם לפני הזמן. טיפי דקס אז יכולות להיות מופקדות בפתרון PEG שם הם שוקעים לתחתית ולפנות שטח התרבות. זה יכול לייצר דפוסי אי נקיים יותר.
5. לכסות את טיפי דקס עם 200 μl של PEG.
6. מקום בחממת humidified עבור 12 שעות על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO _2. ודא כי הספלון אינו מוטה במהלך טיפול ושהוא נמצא על מדף חממת רמה, כדי למנוע שיבוש הדפוסים.
7. הסר את פתרון PEG ולשטוף שלוש פעמים עם 200 μl של מדיום התרבות.
8. הוסף תרבות טריהבינוני ולחזור לחממה.
9. לפקח על התרבויות מעת לעת כדי לבחון תנועת תא והחוצה הפצה מהאיים.

4. תצורה 3: הדרת עמיתים לתרבויות (פורמט פלייט 96-היטב)

1. הכן את הפתרונים של 5.0% wt / wt PEG ו 12.8% wt / wt DEX במדיום תרבות תא, כאמור לעיל.
2. לקצור את התאים שישמשו להדרה ודפוסי אי. קבע את המספר / ריכוז הכולל של תאים זמינים לכל סוג תא. אופציונלי: כמה זיווגים סלולריים עשויים להציג מדדי הפצה שונים באופן דרמטי. כדי למנוע את התאים שהוצאו מoverpopulating תאי דוגמת האי (במיוחד לתרבויות לטווח ארוכות), טיפול בתאים המשמשים להרחקה עם mitomycin צלזיוס במשך 2 שעות או להקרין אותם לפני הקציר. זה ימנע התפשטות. צבעי ניאון CellTracker יכולים לשמש כדי להבדיל בין שתי אוכלוסיות תאים במידת צורך.
3. גלולת התאים וresuspend הגלולה לexclusion דפוסים בנפח מתאים של PEG 5.0% כדי להשיג את המספר הרצוי של תאים, כאמור לעיל. Resuspend הגלולה לדפוסי האי בנפח מתאים של 12.8% DEX כדי להשיג את הריכוז הרצוי של תאים, כאמור לעיל.
4. שימוש micropipettor, לוותר על 0.5 טיפי μl של השעית תא DEX על מצע תרבית תאים יבש. אל תאפשר טיפין לייבוש.
5. לכסות את טיפי דקס עם 200 μl של השעית תא PEG.
6. מקום בחממת humidified עבור 12 שעות על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO _2. ודא כי הספלון אינו מוטה במהלך טיפול ושהוא נמצא על מדף חממת רמה, כדי למנוע שיבוש הדפוסים.
7. הסר את פתרון PEG ולשטוף שלוש פעמים ב200 μl של מדיום התרבות.
8. הוסף מדיום התרבות טרי ולחזור לחממה.
9. לנטר את העמיתים לתרבויות להתבונן אינטראקציה בין אוכלוסיות תאים. אופציונלית: בקרה יכולה להיות מוכנה על ידי ביצוע הרחקה או האי הדפוסים individually, על ידי תאי שיתוף התרבות שאינו מתקשרים או על ידי חסימת מסלולים של עניין אחד או שתי אוכלוסיות תאים לפני או אחרי הדפוסים.

Results

כדי לבחור שילוב מתאים של PEG ו DEX עבור דפוסי תא זה חשוב כדי לקבוע את עקומת binodal. עקומה זו משרטטת את הנקודות בן כ ATPS יכול להיוצר ויכול להשתנות לקבוצת נתונה של פולימרים המבוססות על הטמפרטורה, pH ותוכן יוני. לתאי culturing שדורשים ניסוחים בינוניים אישית ייתכן שיהיה צורך בניסוי כדי לקבוע את עקומת binodal. המטרה זו מושגת על ידי יצירת סדרה של ATPSs רחוק מbinodal ומשתנה בתוכן דקס PEG ו( איור 1, עיגולים סגולים). כאשר ATPS הוא הווה, את פתרוני הפולימר יופיעו מעוננים כ...

Discussion

שיטת micropatterning תא ATPS דורשת מומחיות מעט מאוד מעבר למיומנות בטכניקות תרביות תאים וניתן לשלוט במהירות. היתרונות של גישה זו הם שהוא זול, מהיר ותואם עם מגוון רחב של סוגי תאים ותבניות תרבות. מסיבות אלה, הפרוטוקול שלנו יש לאמץ בקלות על ידי מדעני חיים, במיוחד אלה שלומדים התפשטות תאים, הגירה וchemotaxis, ואת ההשפעה של אינטראקציות juxtacrine ואוטוקריני בין אוכלוסיות תאים. המבחנים שהוצגו כאן ניתן לכמת בקלות ברמת אוכלוסיית התא באמצעות נהלי ניתוח תמונה סטנדרטיות, זמינים בתוכנות כגון Im...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
מגיב	יצרן
Dextran 500.000 kDa	Pharmacosmos, דנמרק
35,000 kDa פוליאתילן גליקול	סיגמה אולדריץ, סנט לואיס, מיזורי
הלה	ATCC, Manassas, VA
HepG2 C3A	ATCC, Manassas, VA
NIH 3T3	ATCC, Manassas, VA
מעקב סלולרי	Invitrogen, Carlsbad, CA
DMEM	Gibco, קרלסבד, קליפורניה
RPMI	Gibco, קרלסבד, קליפורניה
F12	Gibco, קרלסבד, קליפורניה
סרום שור עוברי	Gibco, קרלסבד, קליפורניה