מאמר שיטה

הדמיה ישירה של סידן ER עם ממוקד esterase מושרה טעינת צבע (טד)

DOI:

10.3791/50317

⸱

7 במאי 2013

 ,  ,  ,  ,  , 
1Institute for Clinical Neurobiology, University of Wuerzburg, 2Department of Synapses - Circuits - Plasticity, Max Planck Institute of Neurobiology, Martinsried, 3Walter Brendel Centre of Experimental Medicine, Ludwig-Maximilians University of Munich

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ממוקד ולין מושרה טעינת צבע (טד) תומכת בניתוח של דינמיקת חנות סיד תאיות על ידי דימות פלואורסצנטי. השיטה מתבססת על המיקוד של Carboxylesterase רקומביננטי לreticulum endoplasmic (ER), שבו משפר את הסרת המסכות המקומית של סינטטי נמוכה זיקת Ca 2 + צבעי חיווי בלומן ER.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ויזואליזציה של דינמיקת סידן חשובה להבין את תפקידו של הסידן בפיזיולוגיה תא. כדי לבחון את דינמיקת סידן, Ca 2 + דדי ניאון סינטטיים הפכו פופולריים. כאן אנו מדגימים TED (= טעינת צבע מושרה ממוקד-esterase), כדי לשפר את שיטת השחרור של Ca 2 + צבעי חיווי בלומן ER של תאים מסוגים שונים. נכון להיום, טד היה בשימוש בשורות תאים, תאי גלייה ונוירונים במבחנה. בסיסים על TED יעיל, רקומביננטי מיקוד של פעילות carboxylesterase גבוהה ללום ER באמצעות וקטור מבנים שCarboxylesterases Express (CES). וקטורי TED האחרונים מכילים רכיב ליבה של CES2 התמזג חלבון פלואורסצנטי אדום, ובכך מאפשרים הדמיה בשני צבעים בו זמנית. הדינמיקה של סידן חופשי בחדר המיון הם צילמו בצבע אחד, ואילו את מבנה חדר המיון המקביל מופיע באדום. בתחילתו של ההליך, תאי transduced עם lentivirus. בהמשך, התאים הנגועיםזורעים מחדש על coverslips סוף סוף יאפשר הדמיה תא חי. לאחר מכן, תאי חיים מודגרת עם אסתר acetoxymethyl (AM-אסתר) טופס הזיקה נמוכה Ca 2 + מחוונים, למשל Fluo5N-AM, מאג-Fluo4-AM, או מאג-Fura2-AM. פעילות ולין בדבק ER את צד רשתות הידרופובי מהטופס הנני Ca 2 + חיווי ומורכב + צבע / Ca 2 ניאון הידרופילי נוצר ונלכדה בלומן ER. לאחר טעינת צבע, התאים מנותחים במיקרוסקופ סריקת לייזר confocal הפוך. תאי perfused ברציפות עם פתרונות כמו צלצול ואת דינמיקת סיד ER הן ישירות דמיינו ידי הדמיה זמן לשגות. שחרור סידן מחדר המיון מזוהה על ידי ירידה בעוצמת הקרינה באזורים של עניין, בעוד שהמילוי של חנות סיד ER מייצר עלייה בעוצמת הקרינה. לבסוף, השינוי בעוצמת ניאון לאורך הזמן נקבע על ידי חישוב ΔF / F 0.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

על מנת לפתור את התגובות פיסיולוגיות של סידן לחדר המיון, פיתחנו אסטרטגיה חדשה על מנת לשפר את ההשמנה של צבעים רגישים סינטטיים סידן לחדר המיון. השיטה מאפשרת ניטור הישיר, שאינו מפריע בזמן אמת של סידן ER החופשי בנוכחות של סידן תאי.

פונקציה ואיתות של סידן ER

אותות סידן נמצאים בסוגים שונים של תאים, תאי שרירים למשל, נוירונים ותאי גלייה ומגוון הפונקציות שלהם מתיווך התכווצות שרירים למעורבות בהעברה הסינפטית בלמידה ובזיכרון 1,2. שינויים בריכוז הסידן חופשי הם עניין מדעי גבוה בגלל סידן הוא מעורב בוויסות של שעתוק הגנים, התפשטות תאים, רגישות עצבית, מוות של תאים ותא אחרים מאותת אירועים 1-7. כל אותות הסיד הסלולריים אלה מחוברים באופן פונקציונלי ולתרום לתאיים סיד8-10 דינמיקת חנות.

תכונה משותפת בין כל אותות סידן היא הזרימה של סידן בין המרחב תאי, cytosol ואברונים, בעיקר ER ומיטוכונדריה. זה גורם לשינויים דינמיים בריכוז סידן בתוך אברונים אלה, החשים ידי רכיבי איתות שונים. באופן כללי, ריכוז הסידן בטווחי ER בין 100-800 מיקרומטר, בcytosol ריכוז הסידן הוא קרוב ל -100 ננומטר, ובמרחב תאי הוא הריכוז סביב 1-2 מ"מ. בהתאם לכך, יש כוח מניע כימי גבוה לזרימת הסידן לקראת cytosol 2,9,10.

את אותות סיד ER-derived נחקרו לרוב תלויים בגירוי של קולטני G-חלבון בשילוב (GPCR), אשר לאחר מכן מפעילים פוספוליפאז C (PLC). המועצה המחוקקת הפלסטינית בתורו מייצרת אינוזיטול 1,4,5-trisphosphate (IP 3) 1. על הכריכה של 3-IP לreceptor (IP 3-Rec, איור 1) בחדר מיון הקרום, יוני סידן משתחררים מחדר מיון הלום. מבחינה היסטורית, שחרור סידן 3 בתיווך ה-IP מחדר המיון היה ראשון - גם אם בעקיפין - שנמדד בתאי לבלב acinar ידי Streb et al בשנת 1983 11.. פרסום זה הציע בפעם הראשונה מפל איתות מעורב אצטילכולין, פוספוליפאז C, ו-IP 3. בדרך זו של שחרור סידן שמכונה בדרך כלל שחרור סידן-Induced 3-IP (IiCR) (איור 1). הפעלת קינאז תלויה של Cγ פוספוליפאז ידי קישורי tyrosin קינאזות קולט הפעולה של גורמי גדילה וגורמי neurotrophic לחדר מיון לאחר שסידן איתות IP 3 גובה 12. בנוסף לIiCR, גובה סידן עשויה להיות מתווך על ידי כניסת סיד ionotropic, למשל דרך ערוצי מתח מגודרת סידן (Ca V), ושחרור סידן-Induced סיד הבא (CiCR) על ידי ryanodine מחדשceptors (RyR). IiCR וCiCR קשורים מבחינה פיזיולוגית לכניסת סידן מופעל חנות (SOCE). SOCE כולל פעולה של STIM (מולקולת האינטראקציה סטרומה), שהוא חיישן לשחרור סידן ER. STIM הוכח לעורר כניסת הסידן תאית באמצעות ערוצים חולפים קולט פוטנציאלי (TRP) 13, 14 Orai ערוצי סידן ואפילו מתח מגודרת ערוצי סידן 15 (איור 1). אובדן של סידן ER הוא חולץ על ידי הפעולה דינמי של reticulum סיד ATPase sarco-endoplasmic (SERCA), אשר באופן פעיל משאבות סידן בחזרה לחדר המיון. חסימת SERCA עם תרופות כגון thapsigargin חושפת אובדן מתמשך של סידן לתא ER cytosolic. סיד "דליפה" ER זו נגרמת על ידי נקבוביות מתחמי intramembrane ER כגון חלבון המורכב Sec61 16,17 (איור 1).

בשנת 1998, שפורסם Berridge מודל, "נוירון במסגרת מודל נוירון", אשרשעות מצביעות על תפקיד פיסיולוגי עיקרון של חדר המיון בשילוב סידן עצבי 5. מודל זה לוקח בחשבון את קיומה של מערכת קרום ER רציפה יוצרת "תמונה" תאית של קרום הפלזמה העצבי 5. מערכת קרום אוקריוטים ינארי זו טענה שהוא תנאי בסיסי לשילוב של זמן ומרחב של אותות סידן מהירים ואיטיים בתאי עצב. אותות סידן המתרחשים גם במקביל או לאחריו בקוצים או דנדריטים שונים של אותו תא העצב הם העניקו לסומה של התא או גרעין באמצעות חדר המיון, שם הם סיכם 5,18. לאחר מכן, הסכום שלהם עשוי להיות השפעה על הרגישות של הנוירון, הרגולציה של שעתוק הגנים או שילוב של מפלי איתות. לפיכך, לחדר המיון תומך בשילוב של אותות סידן. תנאי אחד למושג הזה הוא ההמשכיות של ER בתא בודד, אשר כבר נטען על ידי מספר מחקרים ואשר הוכח, לפחות לsomato-Dאזורי endritic ומרחקים קצרים תחזיות axonal 19-21. בין אם יש המשכיות ER בתוך תחזיות axonal ארוכות הוא עניין של ויכוח.

אסטרטגיות כדי למדוד את זרימת הסידן חופשי על פני קרום ER

אותות סידן מנוטרים בתדירות הגבוהה ביותר ב22,23 cytosol. לכן, הוא לא יכול בקלות להבחין אם Ca 2 + זורם לתוך cytosol מתאי או מחנויות 6,24 תאיות. כדי להתגבר על מגבלה זו, אסטרטגיות מתודולוגיות להדמית סיד ER הישירה פותחו. לסיכום, את האסטרטגיות הבאות משמשות: (1) ER-ממוקד מהונדסים גנטי חלבון אינדיקטורים 25-27 Ca 2 + אינדיקטורים זיקה נמוכה מבוססי חלבון להשתמש בחלבון bioluminescent aequorin או GFP בשילוב עם חלבון חישת סיד.. Ca 2 + אינדיקטורים אלה מהונדסים גנטי (GECIs) יכוליםלהיות ממוקד לחדר המיון עם העזרה של פפטיד אות ונשמרים באופן פעיל בחדר המיון באמצעות שימור ומוטיב אחזור. 2 + בסיס משותף ER Ca אינדיקטורים על עיקרון Cameleon והם Cameleon YC4.3 26,28; Cameleon פיצול YC7.3ER 29, וCameleon D1 30. (2) טעינת צבע מבוססת ולין ישירה של AM-אסתר נמוכה זיקת Ca 2 + אינדיקטורים 31,32. AM-נגזרים של צבעי החיווי (מג-Fura2-AM, מאג-Fluo4-AM או Fluo5N-AM) להעביר את ממברנות ביולוגיות במדינה lipophilic, בסידן חסרת רגישות. ואז, בcytosol, כמו גם בחדר המיון, esterases אנדוגניים לדבוק בקבוצת AM-אסתר ולשחרר את מחוון Ca 2 +, והותיר אחריו כמות מסוימת של צבע פעיל בcytosol ובחדר המיון. לכן, גישה זו היא שימושית בתנאים של ריכוז סידן גבוה בחדר המיון, כל עוד ריכוז הסידן cytosolic נשאר הרבה מתחת לדהמגבלת tection של הזיקה נמוכה מחוונים, במיוחד באותות סידן אופייניים (ננומטר למשל למיקרומטר הנמוך). (3) טוען AM-אסתר בשילוב עם קרום הפלזמה permeabilization 32. כל Ca 2 + מחוון cytosolic הנותרים הוסר על ידי permeabilization קרום הפלזמה עם כמויות קטנות של חומר ניקוי "קל" (למשל saponin) בחיץ מלאכותי תאי. לפיכך, את הקרומים תאיים עשויים להיות מגורה, למשל עם ה-IP 3 בחיץ תאי, ישירות דרך "נקבוביות" בקרום הפלזמה. (4) דיאליזה של cytosol תחת תצורה כל התא ומדידות בו זמניות של Ca 2 + בלומן ER וcytosol 32,33. תא טעון ראשון עם זיקה נמוכה Ca 2 + מדד (לדוגמה: מאג-Fura2- בבוקר, ratiometric, UV-אור). לאחר מכן, בעזרת תיקון פיפטה, כל שנותר CYTCa 2 + מדד נמוך הזיקה osolic הוא dialysed מתוך cytosol עם מאגר המכיל Ca 2 + מדד גבוהה זיקה (למשל Fluo-3, אור הנראה). אסטרטגיה זו מאפשרת הקלטה בו זמנית של אותות שמקורם cytosolic וחדר מיון. (5), הנגרמת ממוקד ולין טעינת צבע 8,34. Carboxylesterase (CES) הוא ממוקד ללומן של ER ומספק פעילות ולין גבוהה ללכידה יעילה של טופס AM-אסתר זיקה נמוכה Ca 2 + מחוונים.

מושרה ממוקד ולין טעינת צבע (טד)

כדי לשפר את המיקוד של זיקה נמוכה Ca 2 + אינדיקטורים ללום ER, טד היה מפותח. TED דורש ביטוי היתר של carboxylesterase ER ממוקד עכבר (CES2) (איור 2), אשר מושגת באמצעות בונה ביטוי. תאים המבטאים CES-מבנה רקומביננטי מודגרת עם טופס AM-אסתר של סידן בdicator הצבע (Fluo5N-AM, איור 2). לאחר מכן, בחדר המיון, לצבוע מומר לCa 2 + רגיש, הקרום חדיר Ca 2 + מחוון מורכב (Fluo5N/Ca 2 +) על ידי פעילות ולין הגבוהה, ולכן לוכד את הצבע בריכוז גבוה בלומן ER 8 , 34. השיטה שימושית במיוחד כדי לחקור בסידן שחרור ER דרך IiCR-המסלולים למשל באמצעות קולטנים metabotropic, purinergic או גלוטמט 8,34 ולדמיין דלדול סיד ER באמצעות "ערוצי דליפה" ישירות, למשל, לאחר מצור של 17 SERCA , 34. הניסיון שלנו נמוכה זיקה Ca 2 + מחוון Fluo5N-AM הוא כיום האינדיקטור הטוב ביותר שקיים לשימוש עם אסטרטגיית טעינת צבע TED. יש Fluo5N-AM נמוכה זיקה לCa 2 + (דיסוציאציה קבועה K D ~ 90 מיקרומטר, איור 2), הוא כמעט לא פלורסנט בצורת AM-, אבל מספק פליטת הקרינה גבוהה על Calciuמ 'מחייב 8,34. + המורכב Fluo5N/Ca 2 יכול להיות נרגש עם מקור אור סטנדרטי של ~ 490 ננומטר, אשר תואם את צבעים סטנדרטיים כגון FITC, Alexa 488, או eGFP. אותות סידן cytosolic בקושי להגיע לריכוז בטווח מיקרומטר הנמוך ולכן הם בקושי זוהו על ידי Fluo5N ב35 cytosol.

כדי לשפר את הביצועים של TED, כמה מבני וקטור רקומביננטי פותחו (איור 3). במקור, וקטורי TED המבוססים על רצף הקידוד של CES2 (Refseq הצטרפות מספר NM_145603, CES2c) והביצועים הטובים ביותר TED הוא ציין עם ביטוי יציב של מבני CES. וקטורים חדשים TED להביע את רכיב ליבה של CES2 התמזג חלבון פלואורסצנטי האדום TagRFP-T2 36. יש הווקטורים האלה יש יתרון כי הם יכולים לשמש כדי לזהות transduced תאים ולהשתמש בקרינה האדומה כבקרה פנימית לנורמליזציה של שינויים בFluo5N/Ca 2 + הקרינה. הקרינה האדומה מציעה גם את האפשרות לדמיין את החלוקה המבנית של חדר המיון והשינויים בדינמיקת ER בתנאי גירוי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מציג TED יחול על שורות תאים, נוירונים בהיפוקמפוס ותאי גלייה בקליפת המוח. TED ביצועים הטובים ביותר כאשר וקטורי TED באים לידי ביטוי ביציבות, למשל על ידי וקטורי lentiviral. סקירה סכמטי של שיטת TED מוצגת באיור 4.

1. הכנת פתרונות

את פתרונות הבאים צריכים להיות מוכנים לפני שמתחילים ויכולים להיות מאוחסנות כפי שצוין. בדרך כלל אנו משתמשים בזכוכית מעוקרת וחומר פלסטי ומים autoclaved.

  1. הכן HEPES שרינגר (מ"מ): 125 NaCl, KCl 3, 25 HEPES, 2 MgSO 4 H 2 O 0.7, 2 CaCl 2, 1.25 אא 2 PO 4 H 2 O, 10 glucose.H 2 א '. ללא סיד HEPES שרינגר מורכב (מ"מ): 127 NaCl, KCl 3, 25 HEPES, 2 MgSO 4 H 2 O 0.7, 1.25 אא 2 PO 4 H 2 O, 10 glucose.H 2 O ו 0.1 EGTA.. ללא גלוקוז פתרונות הדמיה אלה יכולים בדואר מאוחסן ב 4 ° C. הכמות הנדרשת של D-גלוקוז הוא הוסיף טרי לפני השימוש.
  2. לניתוח TED בנוירונים בהיפוקמפוס, מלאכותי נוזל השדרתי (ACSF) מומלץ. ACSF מורכב (מ"מ): 127 NaCl, 23 NaHCO 3, 3 KCl, 2.5 NaHPO 4 H 2 O, D-25 glucose.H 2 O, 2 CaCl 2, 2 MgCl 2 0.7 H 2 0 ב DDH. 2 0.
  3. הכן Fluo5N-AM לריכוז של 5 מ"מ. כדי לעזור solubilization להוסיף 8.9 μl של Pluronic 20% F-127 (ב DMSO, לאחסן בטמפרטורת חדר, מוגן מפני לחות ואור) עד 50 מיקרוגרם של lyophilized Fluo5N-AM. אז solubilize Fluo5N-AM באמצעות sonicator מים אמבטיה במשך לפחות 2 דקות. חנות aliquots של 0.5 μl ב -20 ° C, מוגן מפני אור ולחות.
  4. הכן אנטגוניסט ואגוניסט מניות בהתאם לצורך. לדוגמה: א) 10 מ"מ-ATP או ADP (בH 2 O, הפעלת metabotropic של קולטני purinergic), ב) 10 מ"מ carbachol בH 2 O (אגוניסטשל הקולטן muscarinic אצטילכולין), ג) חומצת 30 מ"מ cyclopiazonic (רו"ח) DMSO (חוסם של SERCA), ד) DHPG 50mm ב PBS (אגוניסט קולטן הגלוטמט metabotropic לmGluR אני וmGluR 5), ה) גלוטמט 10 מ"מ בגובה thapsigargin 2 O, F) ionomycin 1 מ"מ DMSO (ionophore), ז) 5 מ"מ DMSO (חוסם גבוהה זיקה של SERCA). aliquots החנות ב -20 ° C.
  5. וקטורי lentiviral: פרוטוקול זה כולל את השימוש של חלקיקי וקטור ביטוי TED lentiviral. הייצור והאחסון שלהם הוא לא חלק מפרוטוקול זה. אנו משתמשים בוקטורי lentiviral של בני הדור השני להעברת Carboxylesterases רקומביננטי לשורות תאים, תאי גלייה ונוירונים. הבסיסים שלנו lentiviral המערכת בביטוי הווקטור 37 FUGW, ופלסמידים אריזת pCMVΔR8.91 או psPAX2 וpseudotyping פלסמיד pMD2.G 38,39. זהירות: קחו בחשבון שהעבודה עם וקטורים רקומביננטי lentiviral inactivating עצמי מחייבת זהירהשיקול של הנחיות biosafety. במדינות רבות, וקטורים אלו מסווגים כקבוצת סיכון Biohazard 2. לקבלת מידע נוסף עיין בhttp://www.addgene.org/lentiviral/.

2. הכנה וזיהום נגיפי של נוירונים ביפוקמפוס עכבר

  1. לשטוף coverslips זכוכית בצלחת פטרי זכוכית של 20 ס"מ קוטר (לכל צלחת 100 coverslips) 1x באתנול 70% לכ 30 דקות. לבסוף, מוסיף 100% אתנול (PA) למשך 2 דקות. הסר אתנול שייר ויבש coverslips מתחת למכסת מנוע סטרילי.
  2. הכן את שני סוגים שונים של מדיה לתרבויות נוירון היפוקמפוס: (א) בינוני Neurobasal עם B27 01:50, (ב) בינונית מלא: בינוני Neurobasal עם B27 1:50, Glutamax 1:100, וN2 תוספת 1:100. תסנין סטרילי התקשורת ולאחסן אותם בתא החממה עד לשימוש.
  3. יום אחד לפני לנתיחה, את coverslips מוכן על ידי הצבת coverslip מ"מ אחד סטרילי 10 הראשונה בכלגם מצלחת תרבית תאי 4 היטב. לאחר מכן, בזהירות מעיל כל coverslip עם 80-100 μl 0.1% פולי-L-ליזין ולאחסן את הכלים באינקובטור במשך הלילה.
  4. ביום של ניתוח ותרבות תא, מתחיל בשטיפת שלוש הפעמים coverslips עם 100 HBSS μl ולהעביר את מדיום Neurobasal 100 μl לכל coverslip. מניחים את הכלים לחממה לאיזון (למשל בזמן הנתיחה של עכברים).

בתור

אנו מבצעים הניסויים שלנו עם עכברים בהתאם להנחיות איחוד אירופיות, כפי שאושרו על ידי הטיפול בבעלי החיים המוסדיים הוועדה שלנו וניצול.

  1. הסר את המוח המוחלט ולנתח את hippocampi ילטרלי.
  2. מוציא בזהירות את כל קרומי המוח ורקמות אחרות מאשר היפוקמפוס היפוקמפוס ומקום אחד כל אחד בצינור 1.5 מ"ל המכיל 450 HBSS μl. אחסן את הרקמה על קרח עד מספר מספיק של hippocampi כבר מבודד.

התרבות סלולרי

  1. הוסף 50 μl 1% טריפסין (וורטינגטון) על צינור אחד ודגירה אותם באמבט מים 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. לנער את הצינורות מדי פעם. כדי לעצור את תגובת מערכת העיכול, להוסיף 50 מעכב טריפסין 1% μl לצינור אחד ולהפוך את הצינור מספר פעמים.
  2. העבר את כל הרקמה של עד 5 hippocampi לאחד צינור פלקון 15 מיליליטר הימנעות העברת הנוזל. הוסף B27 בינונית (א) לנפח סופי של 5 מ"ל.
  3. Triturate הרקמות באמצעות אש מלוטשת זכוכית פיפטה פסטר על ידי pipetting למעלה ולמטה בזהירות זהירות:. למנוע בועות אוויר!
  4. ספין עם XG 400 במשך 3 דקות, לשאוב supernatant ו resuspend התא גלולה ב 5 מ"ל B27 בינוני (א).
  5. Triturate הרקמה שוב עם פיפטה הזכוכית, ולאחר מכן פעמיים בעזרת קצה מסנן פלסטיק μl 1000. לבצע את זה כפי שמתואר בצעדים 2.9 ו 2.10.
  6. לאחר צנטריפוגה האחרונה, resuspend התא גלולה ב 2 מ"ל מלא mediuמ '(ב) וtriturate תאים עם קצה מסנן פלסטיק μl 200. כדי להפריד בין גושי תאים שנותרו מהשעית התא בודד, בואו גושי תאים להתיישב ל1-2 דקות.
  7. ספירת תאים ולחשב את המספר הכולל של תאים נחוצים לזיהום נגיפי. עבור TED הדמיה להשתמש 25,000 תאים לכל coverslip 10 מ"מ.
  8. ציפוי 25,000 הלא transduced תאים נוספים כשליטה מומלץ בשלב זה.

זיהום ויראלי

  1. מעבירים את ההשעיה התא לזיהום נגיפי לתוך צינור טרי 15 מ"ל פלקון ו צנטריפוגות במשך 3 דקות ב 400 x גרם.
  2. לשאוב supernatant ו resuspend התאים במדיום μl 300 (ב)
  3. הוסף כמות מתאימה של חלקיקי וקטור ביטוי זיהומיות lentiviral TED ולתת צינור פלקון לעמוד בטמפרטורת חדר במשך 10 דקות.
  4. מלא את הצינור עם מדיום מלא (ב) לנפח הסופי הנחוץ לציפוי (100 μl עבור כל 10 מ"מ coverslip), לשאוב את המדיום מcoverslip, ולמקם 100 השעיה תא μl מייד על כל coverslip.
  5. מניחים את המנות לתוך החממה עד שכל התאים נרגעו (כ 2 שעות) ולמלא בקפידה את המנות עד שהם מכילים מדיום מ"ל 2 (ב).
  6. בואו נוירונים לגדול במשך שבוע אחד לפחות. להחליף 50% מבינוניים בכל שבוע.

3. תרבות וויראלי הדבקה של תאי גלייה קליפתיים עכבר

הכנה

  1. התחל על ידי הכנת בסיס גליה בינונית (1:1 תערובת של DMEM/F12 עם 10% FCS, 5% HS, 1% פניצילין / סטרפטומיצין, 0.45% גלוקוז) וציפוי של בקבוק תרבות תא T75 עם 4 מ"ל 0.5 ng / ml פוליפוני -DL-ornithine hydrobromide (פורנו) (בדילול ב150 מ"מ פתרון חומצה בור, pH 8.35). לאחר דגירה על 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 2 או במשך הלילה, לשטוף את בקבוק תרבית תאי שלוש פעמים עם HBSS ולהוסיף מצע המכיל B27 01:50 ו10 ng / ml EGF גליה הבזליים מ"ל 18. לאזן את בקבוק תרבית התאים בחממה (HR עד 3).
<עמ 'הכיתה> Dissection = "jove_step"
  1. אנו מבצעים הניסויים שלנו עם עכברים בהתאם להנחיות איחוד אירופיות, כפי שאושרו על ידי הטיפול בבעלי החיים המוסדיים הוועדה שלנו וניצול.
  2. מנתחים את המוח של אחד עכבר P5-P7 ולהסיר את ההיפוקמפוס וקרומי המוח משני האונות כמתואר ב2.5.
  3. לנתח את קליפת המוח הקדמית, לחתוך אותו לכמה חתיכות קטנות ולאסוף אותם בצינור 1.5 מ"ל המכיל HBSS. אחסן את הצינור על קרח ולהמשיך לחלק תא התרבות.

תרבית תאים

  1. להעביר את כל הרקמות מהצינור לצינור פלקון 15 מ"ל באמצעות פיפטה זכוכית מלוטשת אש.
  2. הוסף מדיום בסיסי לנפח סופי של 5 מ"ל וtriturate הרקמה על ידי pipetting למעלה ולמטה מספר פעמים עם טפטפת זכוכית מלוטשת אש. לאחר צנטריפוגה XG 300 במשך 3 דקות, לשאוב את המדיום, וresuspend התא גלולה במדיום בסיסי 5 מ"ל.
  3. חזור על שלב 3.5 פעמיים.
  4. לאחר thiצנטריפוגה Rd, resuspend התא גלולה ב 2 בינוני גליה הבזליים מ"ל המכילים B27 (1:50) ו10 ng / ml EGF.
  5. Titruate שוב ולהעביר את ההשעיה התא לבקבוק תרבית תאי T75 המוכן ולתת לתאים לגדול במשך 3-4 ימים.

כביסה של תאי גליה (לאחר 3-4 ימים בתרבות):

  1. לשטוף את תאי פעם אחת עם 10 מ"ל PBS ונמרץ הקש או פגע בעדינות את הבקבוק כמה פעמים עם היד שלך, כשהוא אוחז אותו בחוזקה ביד השנייה. על ידי פסולת תא שלב זה וצבירי תאים יוסרו מן התרבות.
  2. לשאוב PBS ולהוסיף בינוני גליה בסיס טרי המכיל B27 (1:50) ו10 ng / ml EGF. יתר על כן לטפח את התרבות במשך 5-7 ימים עד שהתאים מגיעים 80% confluency.

פיצול, התמרה וזריעה סופית של תאי גליה:

  1. coverslips 10 מ"מ מעיל עם 100 μl פולי-D-ליזין (פתרון המלאי: 0.1%, בדילול מודעה 1/50 20 מיקרוגרם / מ"ל ​​PBS או HBSS) ו דגירהשלהם באינקובטור במשך הלילה. לשטוף coverslips שלוש פעמים עם HBSS ולהוסיף 100 בינוני גליה הבזליים μl. לאזן coverslips בחממה (3 שעות).
  2. לשטוף את תאי גלייה פעמיים עם 10 מ"ל PBS, לשאוב את PBS, ולהוסיף 3 מ"ל טריפסין (TrypLE, חי). Trypsinize תאים לתקופה של עד 1 דקות זהירות:. הימנע יתר trypsinization. בדרך כלל יותר מ -80% מכל התאים מנותקים לאחר 1 דקות ודי בכך כדי לקבל כמה מיליון של תאים בריאים.
  3. לעצור את התגובה על ידי הוספת 10 מיליליטר מדיום גליה בסיסית, להעביר את ההשעיה תא צינור פלקון 15 מ"ל, צנטריפוגות ב XG 300 במשך 3 דקות. לשאוב supernatant ו resuspend התא גלולה ב 5 בינוני גליה הבזליים מ"ל.
  4. שוב, ספין ולשאוב כמתואר בשלב 3.15, אז תאי resuspend ב 5 מ"ל בינוני גליה בסיסית.
  5. העבר את המספר הדרוש של תאים לצינור 1.5 מ"ל. 10 4-2x10 4 תאי גלייה מספיקים לאחד coverslip 10 מ"מ. בדרך כלל, את ההשעיה כרךUme לtransduce תאים לאחד 4 היטב צלחת היא פחות מ 200 μl. הוסף כמות מתאימה של חלקיקי וקטור ביטוי TED lentiviral לתאי דגירה אותם על RT במשך 10 דקות. ואז למלא את ההשעיה עם מדיום גליה בסיס להיקף הזריעה (100 μl לכל coverslip).
  6. זרעי μl 100 של תאים נגועים לכל coverslip ודגירה של בערך 2 שעות, ולאחר מכן להוסיף בינוני גליה בסיסית המכילים B27 01:50 ו10 ng / ml EGF לנפח סופי של 2 מ"ל.
  7. לתנאי התרבות אידיאליים להשתמש בתאים לניסויים ביום 3-7 לאחר ציפוי.

4. דור ותרבות של שורת תאי כתב

שורות תאי כתב TED הוקמו על הבסיס של הלה, BHK21, HEK293 וSH-SY5Y. כאן אנו מספקים פרוטוקול לתאי הלה, אבל הפרוטוקול עשוי להיות מועברים לכל שורת תאים אחרות גם כן.

דור של קו תא הלה יציב

  1. פיצול קו פראי סוג הלה תא והעברת 100,000 גאמות בהיקף של 200 μl לצינור 1.5 מ"ל.
  2. הוסף כמות מתאימה של חלקיקי וקטור ביטוי TED lentiviral לצינור ודגירת ההשעיה תא וירוס במשך 10 דקות ב RT. לאחר מכן את תאי זרע בנפח כולל של מדיום מ"ל 2 (DMEM, 10% FCS, 1% פניצילין סטרפטומיצין /) בצלחת 30 מ"מ ו דגירה במשך 3 ימים.
  3. אחרי הכביסה פעם עם PBS, לשאוב בינוניות ומוסיף 500 טריפסין μl (TrypLE, 02:03 PBS). דגירה של כ. 3 דקות ולאחר מכן לעצור את התגובה על ידי הוספת מדיום מ"ל 3. מעבירים את ההשעיה לתוך צינור פלקון 15 מ"ל ו צנטריפוגות ב XG 400 במשך 3 דקות.
  4. Resuspend התא גלולה ב 200 בינונית μl ושוב להדביק את התאים עם חלקיקי lentiviral כפי שמתואר ב4.2. לאחר מכן, תאי זרע בתרבית תאים בקבוקון T25 במדיום 10 מ"ל.
  5. לגדל תאים עד confluency של 60-80% הוא הגיע. ואז לפצל את התרבות.

שורות תאי כתב TED

  1. שורות תאי כתב TED ניתן לשמוראד בכל מדיום סטנדרטי, למשל DMEM המכיל 5% או 10% FCS ו -1% פניצילין / סטרפטומיצין משמש.
  2. צלחת מספר מתאים של תאים בצלחת 4 היטב המכילה 10 coverslips סטריליים מ"מ (ראה לעיל), למשל 10,000 עד 20,000 תאים לכל coverslip.
  3. לגדל תאים לפחות יומיים לפני השימוש בהם לTED הדמיה.

5. הכנה לנוהל הדמית החיה במיקרוסקופ הפוכה

    1. Prewarm HEPES שרינגר לטמפרטורת חדר ולהוסיף D-גלוקוז.
    2. Prewarm ACSF (ללא Ca 2 + ו Mg 2 +) לטמפרטורת חדר ולהוסיף D-גלוקוז. לאוורר את ACSF עם carbogen במשך 5 דקות. ואז 1 מ 'של פתרונות מניות CaCl 2 וMgCl 2 להוסיף לריכוזים סופיים של 2 מ"מ כל אחד.
  2. התחל את המיקרוסקופים ההדמיה חיים וכל תוכנות מחשב.
  3. התחל זלוף בחדר הדמיה "דמה" ולאזן את מערכת הרכבת התחתית.
  4. Prewarm דוד מוטבע הפתרון וחדר ההדמיה בבמת מיקרוסקופ. תקן את חדר ההדמיה בהוספת חימום.
  5. לאזן את המערכת כדי 32-37 מעלות צלזיוס לפני שאתם מתחילים את הליך טעינת צבע זהירות:. כדי למנוע זרימה מקרית של פתרון זלוף למערכת מיקרוסקופ אנו משתמשים בקשרי שיער סביב המטרות ויריעות סיליקון אלסטומרי (1 מ"מ) כדי להגן על הבמה מיקרוסקופ.

6. טעינת צבע של כל אחד מסוגי התאים

  1. Resuspend aliquot 1 של Fluo5N-AM (ראה 1.3) בפתרון הדמיה 100 μl prewarmed (HEPES שרינגר או ACSF).
  2. Solubilize Fluo5N-AM בפתרון ההדמיה (HEPES שרינגר או ACSF) בsonicator מים אמבטיה במשך 90 שניות.
  3. השתמש טרי 4 - או צלחת והעברת פתרון 24 גם 400 μl prewarmed הדמיה לאחד טוב. הוסף פתרון לצבוע לאותו גם לבוא ל500 μl של פתרון 5 מיקרומטר.
  4. במקום coverslip בזהירות עם תאים (לדוגמה:10-18 מ"מ קוטר) בבאר, תאים פונים כלפי מעלה.
  5. דגירה לתקופה מתאימה של זמן בתרבית תאים באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס (בינתיים להכין הגדרות הדמיה בשלב המיקרוסקופ). פעמים צבע לטעינה אופייניות הן לתאי עצב ותאי גליה 7-15 דקות ולשורות תאים 10-20 דקות.

קריטי: זמן ולצבוע ריכוז צבען טעינה תלוי בסוג התא, צפיפות תאים, וניסוי הצרכים ספציפיים! פעמים דגירה ארוכות בנוכחותו של הצבע עלולות להזיק לתאים, תאי עצב ותאים ראשוניים במיוחד גליה יסודיים וזו היא קריטית ליכולת התגובה לגירויים פיסיולוגיים. פעמים דגירה ארוכה (30 דקות לדוגמה) תהיה שימושיות רק עבור ניסויי לוקליזציה סיד ER לחקור את התפלגות הסידן חדר מיון במבנים קטנים, למשל subcellular neurites קנס או קוצים. בניסויים מסוימים, תערובת של מדיום 1/3 צמיחה עם פתרון הדמיה עשויה לעזור להגן על תאים במהלך Fluo5N-AMטעינה.

  1. באופן מיידי, להעביר את coverslip לתרבות תא אחר המכילה גם פתרון הדמיה (HEPES שרינגר או ACSF) ולהתחיל הרכבה התאים לחדר ההדמיה.

7. הדמיה של תא חי ER-סידן עם לייזר הפוך סריקת מיקרוסקופ confocal

  1. השתמש במברשת צבע כדי למרוח משחה ואקום גבוהה לחדר הדמיה. יש צורך בגריז לקבע את coverslip התחתון של חדר זלוף. אנו משתמשים בתאי הדמיה מתוצרת עצמית במשך 10-12 coverslips מ"מ עם נפח קטן, ובכך מאפשרים מהירויות זלוף גבוהות של עד חיץ חילופי פי 15 לדקה. תא זלוף זמין מסחרי במשך 18 מ"מ coverslips, ניתן לרכוש ממכשירים וורנר (RC-49FS). אולם זו גם מאפשר גירוי תחום של תאי עצב.
  2. תרים את coverslip עם התאים Fluo5N הטעון ולהוסיף טיפה קטנה של פתרון הדמיה (50-100 μl) על גבי התאים כדי לשמור על התאים מכוסים בפתרון הדמיה.הפעל את coverslip במהופך ולעגן את התאים לתוך חדר ההדמיה. ללחוץ את coverslip לדבק סיליקון, השתמש מקלון צמר גפן (למשל Q-טיפים).
  3. למחות חיץ שייר מהחלק התחתון של coverslip הזכוכית עם ניצני כותנה זהירות:. נגב בזהירות משם שאריות לחות בעת שימוש ב- מטרת שמן עם צמצם מספרי גבוה עבור הדמיה ברזולוציה גבוהה. מלח שיורי מוסר הטוב ביותר על ידי מים. כתם מקרי של שומן ניתן להסיר עם אצטון או אתנול טהור.
  4. חילופי קאמרי "דמה" הדמיה עם חדר ההדמיה הניסיוני. לשטוף את התאים למשך 5-10 דקות על ידי זלוף הרציף.
  5. שטוף תאים במשך 5 - 10 דקות על ידי זלוף הרציף.
  6. לבחירת תא להשתמש בכמות מינימאלית של תאורת לייזר, שיעור גבוה סריקה (2-4 הרץ), גודל תמונה קטן, ורווח גבוה.
  7. זהירות: לבחירת תאי Fluo5N שכותרתו לא משתמשת בעודף תאורת אור או ישירה עם epifluorescenאור לא. תאורה בהירה של Fluo5N/Ca 2 + מתחמים גורם לאובדן המוחלט של הקרינה ER-ספציפית בתוך 2-4 שניות (איור 5).
  8. הגדרת מיקרוסקופ פי הניסוי המתוכנן. להתמצאות, הגדרות יציגים להדמיה עם וקטורי TED שונים מוצגות בטבלה 1. לליזר הפוך מיקרוסקופיית confocal, אנו משתמשים במיקרוסקופ אולימפוס IX81 בשילוב עם מערכת confocal 1000 FluoView כי הוא מצויד בלייזרי דיודה (473 ננומטר, 15 מגה ואט; 559 ננומטר, 20 MW) ומערכת גלאי רפאים.
  9. בתחילת מסמך ניסוי התאים של עניין על ידי X ברזולוציה גבוהה, ערימות תמונת YZ.
  10. לבצע X, yt הדמיה לפקח דינמיקת סיד ER תחת תנאי הניסוי הספציפיים. הגדרות אופייניות עבור המערכת שלנו מופיעות בטבלה 2.
  11. לעקוב אחר שינויים בסידן ER תחת זלוף הרציף עם פתרון הדמיה. שעיר חליפין חיץ אופייניים הם דוארxemplarily: (א) שטיפת תא וחנות דלדול ידי SERCA בלוק: 1.5 מ"ל / דקה, (ב) גירוי ה-ATP / DHPG: 3 מ"ל / דקה.
  12. לרכוש תמונות דיגיטליות מעדיפים עם 12-bit (4096 ערכים אפורים). הדמיה מקבילה של Fluo5N/Ca 2 + ו RFP, תמונות של 8 ביט (256 ערכים אפורים) עשויים להציל את המערכת מפני הצפת נתונים.
  13. אחסן תמונות תא לחיות סדרת זמן (x, יט) או ערימות תמונת 3D (X, YZ) (לחלוקה תאית של Fluo5N/Ca 2 + מתחמים) בפורמט תואם ImageJ (למשל TIFF).

8. עיבוד תמונה וניתוח נתונים

  1. פתח את מחסנית התמונה בתכנית ImageJ. במקרה של ססגוניות הדמיה, לפצל את ערוצי RGB כאשר נשאלים על ידי ImageJ.
  2. זהה את האזור שלך (ים) של עניין (ROI) על ידי בחינה מדוקדקת של ערימות התמונה (לדוגמה, עם עזרה של עצמת כפונקציה של זמן עלילה)
  3. השתמש בתוסף מנתח זמן הסדרה לקרוא את עוצמת פיקסל הממוצעת בהחזר על השקעה (F גלם). תלויגרם בכוונה, לצייר סביב ROIs או לחדר מיון המלא או אזורים קטנים של חדר המיון לדוגמא המיון של הדנדריטים של אזורי פריפריה סלולרי. כמו כן כולל החזר על השקעה 1-3 באזורים ללא תאים לרקע חיסור.
  4. חשב את ממוצע הקרינה הרקע (נ ב) על ידי חישוב ערך הקרינה הממוצע של ההחזר על ההשקעה של הרקע ולחסר ב F ערך הרקע מערכי F הגלם כדי לקבל את ההחזר על ההשקעה ערך F.
  5. חישוב F 0, שהיא הקרינה הבסיסית של התאים, על ידי חישוב הערך הממוצע של עשרה עד 30 ערכי ניאון לכל החזר על השקעה במצב מנוחה.
  6. לחשב את השינויים היחסיים רקע תוקנו בקרינה על ידי ΔF / F 0 על ידי נוסחה:

figure-protocol-1

  1. שינויים יחסיים נוכחים בלזרוחNCE כעקבות עם ΔF / F 0 לציר ה-Y והזמן לציר ה-X.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מספק גישה ללא הפרעה להדמיה ישירה של סידן חדר המיון ללא תשלום. הזיקה נמוכה הסינטטי Ca 2 + האינדיקטורים שפורסמו ונלכדו בלומן ER בעזרת ER ממוקד, פעילות אנזים רקומביננטי ולין. טעינה משופרת של 2 + Ca צבעי החיווי ללום ER מאפשרת הדמיה ישירה ומהירה של דינמיקת חנות סיד ER.

סוגי תאים לTED

ההיתכנות של השיטה הוכח בשורות התאים,...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

את היתרונות והחסרונות של שיטת TED כבר נדונו בהרחבה בפרסומים האחרונים 34,35. בהשוואה לשיטות אחרות שתוארו לעיל, TED עוקף את הבעיה של שיבוש ומרוסס בתאים. יתר על כן, שני היבטים צריכים להדגיש. העיקרון של TED לחדר מיון סיד דורש הדמיה (1). הביטוי ממוקד של carboxylesterase הפעיל בלומן ER בעזרת בונה וקטור טד ו( 2). שחרור יעיל ומועדף של AM-אסטרים זיקה נמוכה הסינתטיים של צבעי סידן בלומן ER.

1. TED וקטור בונה

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים של Forschungsgemeinschaft BL567/3-1 דויטשה (DFG) ופרידריך באור-Stiftung. ברצוננו להודות לרוג'ר צ'יין, הווארד יוז מעבדות מכון רפואי באוניברסיטת קליפורניה, סן דייגו שספק לנו תג-RFP-T2. אנו מכירים תודה לאל דייוויד בולטימור, מכון טכנולוגי של קליפורניה בפסדינה, ודידייה Trono, אוניברסיטת ג'נבה, ג'נבה, שספק לנו פלסמידים FUGW lentiviral, וpsPAX2/pMD2.G.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
(S)-3,5-DHPG (דיהידרוקסיפנילגליצין)טוקריס0805
5';-ATP-Na2, ATP דיסודיום מלח הידרטסיגמאA26209-1G
B-27,50xInvitrogen17504-044
קרבמוילכולין כלוריד (Charbachol)SigmaC4382-1g
חומצה ציקלופיאזונית (CPA)Ascent ScientificAsc-300
דימתיל-סולפוקסיד (DMSO)SigmaD2650
DMEM עם GlutamaxInvitrogen-Gibco31966-047
PBS של Dulbecco ללא Ca/Mg 1xPAAH15-002
סרום עגל עובריInvitrogen-Gibco10270-106
Fluo-5N-AM, 10 x 50 μ gInvitrogenF14204
GlutamateAscent ScientificAsc-049
GlutamaxInvitrogen35050-038
תערובת חומרים מזינים של Ham's F12Invitrogen-Gibco21765-029
Hank's BSS(1x) ללא Ca, ללא Mg, עם פנול אדום, HBSSPAA LaboratoriesH15-010
סרום סוסיםSHD3250YKLinearis
Ionomycin Ca2+ מלחעלייה מדעיתAsc-116
עכברים EGF PreproTech315-09
N2 תוסף 100xInvitrogen17502-048
מדיום נוירו-בזאליInvitrogen-Gibco21103-049
Pluronic F127, ספיגת UV נמוכה, 2 גרםInvitrogenP6867
Poly-DL-ornithine hydrobromide PORNSigmaP8638
Poly-D-lysine hydrobromideSigmaP7280
Poly-L-LysinSigmaP2636
ThapsigarginCalbiochem586005-1mg
TryLE ExpressInvitrogen12605-028
טריפסיןוורת'ינגטוןLS-003707
מעכב טריפסיני מבית Glycine MAX (פולי סויה)SigmaT6522
<חזק>חומרים
מערכת קונפוקלית: מיקרוסקופ סריקת לייזר הפוך: FV1000 עםתצורה ספציפית למשתמשOlympus
מערכת קונפוקלית: משלב לייזר FV10 ולייזרי דיודה (405, 473, 559, 635)אולימפוסתצורה ספציפית למשתמש
מערכת קונפוקלית: ראש סריקה FV10-SPD עם גלאי ספקטרליתצורה ספציפית למשתמשאולימפוס
בקר מחמם TC-344BWarner Instruments64-0101לשליטה בפתרון קו מחמם
NIH ImageJWS Rasband, ImageJ, המכונים הלאומיים לבריאות של ארה"ב, http://rsb.info.nih.gov/ij/, 1997--2006
מטרה: UAPON20XW340 NA 0,7 WD 0,35אולימפוסN2709100
מטרה: UPLFLN40XOאולימפוסN1478700
מטרה: UPLSAPO60XO/1.35, WD=0.15אולימפוסN1480700
תא זלוף,בהתאמה
, RC-49FSוורנר אינסטרומנטסW4 64-1709
צינור זלוף: PT-49וורנר אינסטרומנטס64-1730למשאבה פריסטלטית זלוף
MiniPlus 3 (4 ערוצים)משאבת זילוףגילסוןn.a.perfusion
מחמם תמיסה מוטבע יחיד SH-27Bוורנר אינסטרומנטס64-0102נשלט על ידי בקר חימום
צינורות יניקה: ST3Rוורנר אינסטרומנטס64-1407לזילוף
תוספת חימום: Tempocontrol 37-2 דיגיטלי 2 ערוציםPeconn.a.
IX81 של תא זלוף הפוך אישית

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Berridge, M. J., Bootman, M. D., Roderick, H. L. Calcium signalling: dynamics, homeostasis and remodelling. Nature reviews. Molecular Cell Biology. 4, 517-529 (2003).
  2. Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. The versatility and universality of calcium signalling. Nature reviews. Molecular Cell Biology. 1, 11-21 (2000).
  3. Agulhon, C., et al. What is the role of astrocyte calcium in neurophysiology. Neuron. 59, 932-946 (2008).
  4. Augustine, G. J., Santamaria, F., Tanaka, K. Local calcium signaling in neurons. Neuron. 40, 331-346 (2003).
  5. Berridge, M. J. Neuronal calcium signaling. Neuron. 21, 13-26 (1998).
  6. Grienberger, C., Konnerth, A. Imaging calcium in neurons. Neuron. 73, 862-885 (2012).
  7. Neher, E., Sakaba, T. Multiple roles of calcium ions in the regulation of neurotransmitter release. Neuron. 59, 861-872 (2008).
  8. Jaepel, J., Blum, R. Capturing ER calcium dynamics. European Journal of Cell Biology. 90, 613-619 (2011).
  9. Verkhratsky, A. Physiology and pathophysiology of the calcium store in the endoplasmic reticulum of neurons. Physiological Reviews. 85, 201-279 (2005).
  10. Burdakov, D., Petersen, O. H., Verkhratsky, A. Intraluminal calcium as a primary regulator of endoplasmic reticulum function. Cell Calcium. 38, 303-310 (2005).
  11. Streb, H., Irvine, R. F., Berridge, M. J., Schulz, I. Release of Ca2+ from a nonmitochondrial intracellular store in pancreatic acinar cells by inositol-1,4,5-trisphosphate. Nature. 306, 67-69 (1983).
  12. Choi, J. H., Ryu, S. H., Suh, P. G. On/off-regulation of phospholipase C-gamma 1-mediated signal transduction. Advances in Enzyme Regulation. 47, 104-116 (2007).
  13. Clapham, D. E. TRP channels as cellular sensors. Nature. 426, 517-524 (2003).
  14. Cahalan, M. D. STIMulating store-operated Ca(2+) entry. Nature Cell Biology. 11, 669-677 (2009).
  15. Soboloff, J., Madesh, M., Gill, D. L. Sensing cellular stress through STIM proteins. Nature Chemical Biology. 7, 488-492 (2011).
  16. Erdmann, F., et al. Interaction of calmodulin with Sec61alpha limits Ca2+ leakage from the endoplasmic reticulum. The EMBO Journal. 30, 17-31 (2011).
  17. Schäuble, N., et al. BiP-mediated closing of the Sec61 channel limits Ca(2+) leakage from the ER. The EMBO Journal. , (2012).
  18. Park, M. K., Choi, Y. M., Kang, Y. K., Petersen, O. H. The endoplasmic reticulum as an integrator of multiple dendritic events. The Neuroscientist : a review journal bringing neurobiology, neurology and psychiatry. 14, 68-77 (2008).
  19. Cooney, J. R., Hurlburt, J. L., Selig, D. K., Harris, K. M., Fiala, J. C. Endosomal compartments serve multiple hippocampal dendritic spines from a widespread rather than a local store of recycling membrane. The Journal of Neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 22, 2215-2224 (2002).
  20. Holbro, N., Grunditz, A., Oertner, T. G. Differential distribution of endoplasmic reticulum controls metabotropic signaling and plasticity at hippocampal synapses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 15055-15060 (2009).
  21. Terasaki, M., Slater, N. T., Fein, A., Schmidek, A., Reese, T. S. Continuous network of endoplasmic reticulum in cerebellar Purkinje neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91, 7510-7514 (1994).
  22. Barreto-Chang, O. L., Dolmetsch, R. E. Calcium imaging of cortical neurons using Fura-2 AM. J. Vis. Exp. (23), e1067(2009).
  23. Lang, S., Schäuble, N., Cavalie, A., Zimmermann, R. Live cell calcium imaging combined with siRNA mediated gene silencing identifies Ca(2)(+) leak channels in the ER membrane and their regulatory mechanisms. J. Vis. Exp. (53), e2730(2011).
  24. Rudolf, R., Mongillo, M., Rizzuto, R., Pozzan, T. Looking forward to seeing calcium. Nature reviews. Molecular Cell Biology. 4, 579-586 (2003).
  25. Mank, M., Griesbeck, O. Genetically encoded calcium indicators. Chemical Reviews. 108, 1550-1564 (2008).
  26. Miyawaki, A., et al. Fluorescent indicators for Ca2+ based on green fluorescent proteins and calmodulin. Nature. 388, 882-887 (1997).
  27. Montero, M., et al. Monitoring dynamic changes in free Ca2+ concentration in the endoplasmic reticulum of intact cells. The EMBO Journal. 14, 5467-5475 (1995).
  28. Griesbeck, O., Baird, G. S., Campbell, R. E., Zacharias, D. A., Tsien, R. Y. Reducing the environmental sensitivity of yellow fluorescent protein. Mechanism and applications. The Journal of Biological Chemistry. 276, 29188-29194 (2001).
  29. Ishii, K., Hirose, K., Iino, M. Ca2+ shuttling between endoplasmic reticulum and mitochondria underlying Ca2+ oscillations. EMBO Reports. 7, 390-396 (2006).
  30. Palmer, A. E., Jin, C., Reed, J. C., Tsien, R. Y. Bcl-2-mediated alterations in endoplasmic reticulum Ca2+ analyzed with an improved genetically encoded fluorescent sensor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 17404-17409 (2004).
  31. Hofer, A. M., Machen, T. E. Technique for in situ measurement of calcium in intracellular inositol 1,4,5-trisphosphate-sensitive stores using the fluorescent indicator mag-fura-2. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90, 2598-2602 (1993).
  32. Solovyova, N., Verkhratsky, A. Monitoring of free calcium in the neuronal endoplasmic reticulum: an overview of modern approaches. Journal of Neuroscience Methods. 122, 1-12 (2002).
  33. Solovyova, N., Veselovsky, N., Toescu, E. C., Verkhratsky, A. Ca(2+) dynamics in the lumen of the endoplasmic reticulum in sensory neurons: direct visualization of Ca(2+)-induced Ca(2+) release triggered by physiological Ca(2+) entry. The EMBO Journal. 21, 622-630 (2002).
  34. Rehberg, M., Lepier, A., Solchenberger, B., Osten, P., Blum, R. A new non-disruptive strategy to target calcium indicator dyes to the endoplasmic reticulum. Cell Calcium. 44, 386-399 (2008).
  35. Blum, R., Verkhratsky, A., Petersen, O. H. Calcium imaging of intracellular organelles: endoplasmic reticulum. 43, Humana Press. (2010).
  36. Shaner, N. C., et al. Improving the photostability of bright monomeric orange and red fluorescent proteins. Nature Methods. 5, 545-551 (2008).
  37. Lois, C., Hong, E. J., Pease, S., Brown, E. J., Baltimore, D. Germline transmission and tissue-specific expression of transgenes delivered by lentiviral vectors. Science. 295, 868-872 (2002).
  38. Zufferey, R., et al. Self-inactivating lentivirus vector for safe and efficient in vivo gene delivery. Journal of Virology. 72, 9873-9880 (1998).
  39. Zufferey, R., Nagy, D., Mandel, R. J., Naldini, L., Trono, D. Multiply attenuated lentiviral vector achieves efficient gene delivery in vivo. Nature Biotechnology. 15, 871-875 (1997).
  40. Li, D., Herault, K., Oheim, M., Ropert, N. FM dyes enter via a store-operated calcium channel and modify calcium signaling of cultured astrocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 21960-21965 (2009).
  41. Blum, R., Petersen, O. H., Verkhratsky, A. Calcium measurement methods. Verkhratsky, A., Petersen, O. H. Vol. Neuromethods 43 (Springer protocols), Humana Press. 147-167 (2010).
  42. Tian, L., et al. Selective esterase-ester pair for targeting small molecules with cellular specificity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 4756-4761 (2012).
  43. Samtleben, S., Blum, R. Improved vectors for direct ER calcium imaging with targeted-estersase induced dye loading. , In preparation (2012).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

ERTEDCES2Delta F Over F Zero

מאמרים קשורים