רומן<em&gt; Ex vivo</em&gt; שיטת תרבות ללב העכבר העוברית

סיכום

מחקרים התפתחותיים בעכבר הם הקשו על ידי חוסר הנגישות של העובר במהלך הריון. על מנת לקדם את התרבות לטווח הארוך של הלב העוברי בשלבים מאוחרים של הריון, פיתחנו פרוטוקול בו הלב נכרת הוא בתרבית Matrigel חצי מוצק, לדלל.

תקציר

מחקרים התפתחותיים בעכבר הם הקשו על ידי חוסר הנגישות של העובר במהלך הריון. לפיכך, פרוטוקולים לבודד ואיברים בודדים התרבות של עניין חיוניים כדי לספק שיטה של ​​שתי אסטרטגיות הטיפול החדשניות לדמיין שינויים בפיתוח ומאפשרים. על מנת לקדם את התרבות לטווח הארוך של הלב העוברי בשלבים מאוחרים של הריון, פיתחנו פרוטוקול בו הלב נכרת הוא בתרבית Matrigel חצי מוצק, לדלל. מצע זה מספק מספיק תמיכה כדי לשמור על המבנה תלת ממדים, אבל הוא גמיש מספיק כדי לאפשר המשך התכווצות. בקיצור, לבבות הם נכרת מן העובר והניחו בתערובת של Matrigel הקר דילול 01:01 עם מדיום גידול. לאחר Matrigel המדולל מתמצק, מדיום גידול מתווסף למנת התרבות. לבבות עקורים מאוחר ככל יום עוברי 16.5 היו מעשיים עבור ארבעה ימים שלאחר נתיחה. ניתוח של מקלעת כלילית מראה כי שיטה זו אינהלשבש את התפתחות כלי דם כלילית. לפיכך, אנו מציגים שיטה חדשנית לתרבות לטווח הארוך של לב עוברי.

מבוא

בשנים האחרונות, העכבר המהונדס כבר את מערכת המודל העיקרית לחקר התפתחות מומי לב. עם זאת, אורגניזמים מודל אחרים, כגון דג הזברה, שהוכחו יש יתרונות משמעותיים על פני העכבר. שלושה יתרונות עיקריים של דג הזברה הם הנחת החיצונית של ביצים, על מנת להקל על גישה לעוברים; שקיפות האופטית של העוברים, מה שמאפשרת הדמיה קלה של התפתחות לב, ואת הקלות של יישום טיפולים מולקולריים קטנים כדי לווסת את התפתחותו של העובר ^1. לפיכך, הפיתוח של טכניקת התרבות שאפשרה צמיחת רחם לשעבר של איבר עוברי הייתי לעקוף, לפחות בחלקו, את המגבלות כיום חוו על ידי חוקרים לומדים תהליכי התפתחות בעכברים מהונדסים.

מערכות תרבות לב לשעבר vivo פותחו בשניהם חומוס ועובר עכבר המאפשרים טיפול עם מולקולות קטנות וניתוח של איך אונטערשיידאזורים שונים שממפים של לב תקשורת ^2-6. לכל עכבר תרבות לב, לב שנלקח מעוברים עד עוברי (E) יכול להיות ממוקמים בגיל 12.5 במדיום התרבות עם או בלי נדנדה ^2,3,5. באמצעות טכניקה זו, לב עוברי טופח בהצלחה לשקילות של E13.5, ולב בתרבית עם נדנדה נשמר כל עוד שלושה ימים (החל משעת E10.5) ^3. עם זאת, מחקרים לא דיווחו התרבות המוצלחת של לב מעוברים מבוגרים יותר. כמו כן, ניסויי הצלה היו מוגבלים להחלת הסוכן הטיפולי ברחבי העולם לתרבות בינונית ^2.

מערכת התרבות פרוסה, שבלבם הם נכרת, מוטבעים, ומחולק באמצעות vibratome, גם נוצלה לשני לבבות צעירים יותר, כגון E12.5 לבבות עכבר חומוס ולבבות בשלב 36 (כ E16 בעכבר) המבורגר-המילטון ^2,4,6, ומעלה את לב, כמו שלאחר לידה ומבוגרים עכבר שעותearts ולבבות אדם מבוגר ^7,8. בעוד שהניתוחים העובריים מנוצלים בדרך כלל סעיפי ^2,4-150 מיקרומטר עבים, עובי סעיף יכול להיות גדול כמו 500 מיקרומטר ללא עדות למחסור בחמצן ^8. תרבויות פרוסה אלה קוימו כל עוד חודשים בתרבות, עם רוב פרוסות שמירת contractility לאורך תקופה זו ^9. בהשוואה למחקרים בcardiomyocytes מבודד, תרבויות פרוסה אלה מאפשרים שיתוף התרבות של cardiomyocytes עם סוגי התאים השכנים שלהם ולספק שיטה יעילה לניתוח vivo לשעבר. עם זאת, תרבויות אלה דורשים משוכללים יותר ההגדרה מאשר פשוט הצבת לב במדיום התרבות (למשל הטבעת הלב החי עבור חתך בvibratome), וכל ניתוח הוא כמובן מוגבל לחלק של הלב בתוך הקטע.

בהתחשב במגבלות שתוארו לעיל ללב עכבר עוברי culturing והשפע של עכברים מהונדס אווהilable למחקר, פיתחנו מערכת לשעבר vivo עכבר לב התרבות דומה למערכת תרבות ריאות vivo לשעבר שפותחה על ידי ויבר, מערכת et al. ¹⁰ התרבות מאפשרת תרבות לטווח ארוך והדמיה של זרימת הדם הכליליים שיפוץ בתוך כל לב עכבר עוברי. בנוסף, השימוש בMatrigel מאפשר חרוזים שיתקיימו במקום סמוך ללב, ובכך לספק טיפול מקומי עם סוכנים טיפוליים. ניתן לבצע ניסויים אלה בנקודות זמן התפתחות שונות כדי להשוות את ההשפעה של טיפול שניתן בתהליך כגון היווצרות עורקים כלילית. בגלל מולקולות קטנות יכולות לנטרל באמצעות Matrigel, מערכת זו התרבות יכולה לשמש גם לאזורי התרבות גזורים של הלב אחד ליד שני כדי לקבוע אם אנשי קשר ספציפיים תאי תאים נחוצים לתהליכים התפתחותיים מסוימים או אם איתות paracrine מאזור אחד למשנהו צורך בכך.

מערכת זו התרבותהוא פשוט יחסית, ובניגוד למערכת התרבות הפרוסה, עושה שימוש בחומרים כימיים תרבות הבסיסיות ולהגדיר קופצים, כי הם זמינים ברוב המעבדות. בקיצור, לב עוברי בתרבית ניכר בMatrigel לדלל, המספק תמיכה מוצקה למחצה. תמיכה זו היא מספיק כדי לשמור את המורפולוגיה תלת ממדית של הלב בעת גם מאפשר ללב חוזה. באמצעות מערכת זו, ניתן לשמור על לב שלם מעוברי עכברים מבוגרים יותר (E14.5-E16.5) בתרבות לתקופה של עד ארבעה ימים. מקלעת כלילית כולו נשמר, שלא כמו בתרבויות פרוסה, כך שכל רמזי איתות המתרחשים באזורים שונים של הלב להישאר בהווה. יתר על כן, צבעי ניאון לחיות תאים יכולים לחלחל Matrigel כדי לאפשר הדמיה של הלב החי, והוא יכול להיות ממוקמים חרוזים חלבון מצומדות ליד הלב כדי לספק מקור איתות מקומי. יחד, יתרונות אלו הופכים טכניקה זו שיטה אידיאלית ללימוד תהליכים התפתחותיים בembryonלב עכבר IC.

פרוטוקול

1. מוציא את הלבבות עובריים

1. להרדים את העכבר מתוזמן בהריון ביום העוברי הרצוי באמצעות טכניקת המתת חסד מאושרת. כל הניסויים אושרו על ידי הטיפול בבעלי החיים המוסדיים ועדת שימוש באוניברסיטת צפון קרוליינה בצ'אפל היל.
2. נדיבות לרסס את הנקבה עם אתנול 70% לפני הניתוח. פתח חלל הבטן של הנקבה כדי לאחזר והבלו קרן הרחם.
3. הנח את קרן הרחם בצלחת פטרי שמכילה תמיסת מלח קר 1x פוספט שנאגרו (PBS) ולשטוף במידת הצורך. גזור לפתוח קרן הרחם דרך קו האמצע לחשוף את שקי העובריים המצורפים.
4. גזור לפתוח השק עוברי ולאחזר עובר. הנח את העובר בצלחת פטרי שנייה עם PBS הקר. להחזיר את צלחת פטרי עם קרן הרחם לקרח.
5. לערוף את העובר כדי לשפר את הגישה לקיר החזה. אם genotyping יש צורך, הסר אותו ולהציל את הזנב בצינור Eppendorf מונח על קרח.
6. עםהעובר על הגב שלה, לחתוך לפתוח את דופן בית החזה כדי להמחיש את הלב וריאות. בהתאם לבמה, קיר החזה עשוי להיות שקוף.
7. רם בזהירות את הלב באמצעות מלקחיים ולחתוך את כלי בהמשך. לאחר מכן, לחתוך מעל כלי הגדול כדי לשחרר את הלב. אם יש צורך, להסיר רקמות זרות.
8. מניחים את הלב באחד טוב של צלחת 24 גם מלאות PBS הקר ומניח את הצלחת על קרח.
9. חזרו על השלבים הקודמים עד שכבר נכרת לב מכל העוברים.

2. תרבות Set-up

1. בברדס למינרית, לשלב Matrigel קר ומדיום התרבות הרצויה (למשל 10% בסרום שור העובר (FBS) בהשתנה Dulbecco נשר בינוני (DMEM)) בביחס 1:1. לא מדיום התרבות מראש החם.
2. שמירת Matrigel לדלל על קרח, פיפטה μl 500-1,000 של הפתרון המדולל היטב של צלחת תרבות 24 גם כי הוא נשמר גם על קרח.
3. במכסת המנוע, להרים בזהירות ומניח נכרתלב בטוב של צלחת התרבות המכילה Matrigel תוך שמירה על צלחת התרבות על קרח.
4. אם הכיוון של הלב המשובץ הוא קריטי: נדיבות לרסס מיקרוסקופ הפוכה ומרחב הסובב עם 70% אתנול. במכסת המנוע, הנח את הלב נכרת בטוב של צלחת התרבות המכילה Matrigel בעודו על קרח. לאחר מכן, הנח את הצלחת על מיקרוסקופ ובמהירות אוריינט הלב נכרת כMatrigel מתחיל לחזק.
5. מניחים את צלחת התרבות בhumidified 37 ° C חממה (5% CO ₂₎ ולאפשר Matrigel לבסס לכ -30 דקות.
6. הוסף מדיום התרבות מחומם מראש 1 מ"ל לכל המכיל גם לב.
7. לבבות יכולים להישאר בתרבות במשך לפחות ארבעה ימים. שינוי התרבות בינונית כל יומיים מומלץ.

3. קיבעון ויזואליזציה

1. אם תרצה, להוסיף צבע לחיות תאי ניאון (למשל Syto-16) כדי להמחיש את הלב החי. צילום יהיהמוגבל לצד של הלב, כי הוא גלוי הבוסס על המיקום שבו הוא משובץ.
2. אם ניתוחים שלאחר culturing (למשל כל הדמיה הר או חתך) יבוצעו, להסיר את מדיום התרבות ולהחליף עם 4% פורמלדהיד קר. מניחים את הצלחת על קרח למשך 30 דקות.
3. לאחר פורמלדהיד והקרח הקרים לקדם את פירוקה של Matrigel, החלף את המקבע (וMatrigel) עם פורמלדהיד הטרי ולתקן לבבות הלילה בשעה 4 ° C.
4. שטוף את לבם עם חיץ (למשל PBS או טריס) ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס עד ניתוח נוסף.

תוצאות

באמצעות טכניקה זו, הלב שומר מורפולוגיה תלת הממדים ונותר בת קיימא, כפי שצוין על ידי התכווצויות המשיכו (סרט 1). התכווצויות אלה הן באופן עקבי יותר בולטות בפרוזדורים מאשר בחדרי הלב. בעקבות התרבות, ניתן לתקן את לב ומעובד או אימונוהיסטוכימיה או היסטולוגיה לבחון ביטוי סמן ספציפי או מבנים. איור 1 א מציג את הבסיס של החדרים ועורקים גדולים של לב עוברי בעכבר שהיה בתרבית למשך 24 שעות, קבוע, ומעובד ל אימונוהיסטוכימיה לתייג האנדותל. micrographs confocal אלו מראה...

דיון

מערכת התרבות הנוכחית מהווה יתרונות משמעותיים למחקרי לב עכבר עובריים. מערכת זו התרבות משמרת contractility שריר הלב ומקלעת כלילית, עם סימנים מוגבלים של נמק, גם לאחר ארבעה ימים בתרבות. יתר על כן, המטריצה ​​מוצקה למחצה מספקת מספיק תמיכה כדי לשמור על המורפולוגיה תלת ממדית של הלב תוך מתן אפשרות לפיתוח גמישות לחוזה וגם להחזיק חרוזים מצופים במקום במהלך התרבות. למרות התמיכה הזאת, מטריצה ​​זו היא חדירה לצבעי ניאון כגון Syto 16, המאפשרת ניאון ניתוח של הלב החי.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
REAGENTS
עכברים			לניתוח בשלב העניין העוברי
PBS (1x)
DMEM	Cellgro
FBS	Sigma-Aldrich	F2442
גורם גדילה מופחת מטריג'ל	BD Bioscience	356231
Syto-16	Invitrogen	S7578	משמש לפי ההוראות ב-13
צלחת תרבית 24 בארות	פישר סיינטיפיק	07-200-84
<חזק>ציוד
מיקרוסקופ סטריאוסקופי	Nikon	SMZ645
חממת תרבית תאים	Thermo	3110

בהריון מתוזמן