הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

Medullary העכברוש הראשוני culturing הפנימי איסוף תאי Duct

14.5K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/50366

⸱

21 ביוני 2013

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Anchored Signalling, Max-Delbrück-Center for Molecular Medicine, 2Leibniz Institute for Molecular Pharmacology (FMP), 3Charité University Medicine Berlin

במאמר זה

הודעת תיקון

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

סיכום

ארגינין-וזופרסין (AVP) שולט בכוונון עדין של איזון מים בגוף דרך להקל על ספיגת מים על ידי תאי הכליה עיקריות. כאן, אנו מציגים פרוטוקול לגידול מדולרי פנימי עכברוש העיקרי איסוף תאי צינור המתאימים להבהרת מנגנונים מולקולריים שבבסיס ספיג חוזר של מים AVP בתיווך.

תקציר

ארגינין-וזופרסין (AVP) מאפשר ספיג חוזר של מים על ידי כליות איסוף תאים עיקריים צינור ובכך עדינות מנגינות הומאוסטזיס מים בגוף. AVP נקשר לקולטנים V2 זופרסין (V2R) על פני השטח של התאים ובכך גורם לסינתזה של cAMP. זה מגרה תהליכי איתות תאיים מובילים לשינויים בזירחון של תעלת המים aquaporin-2 (AQP2). חלבון קינאז phoshorylates AQP2 ובכך מעורר את טרנסלוקציה של AQP2 משלפוחית ​​תאיות לתוך קרום הפלזמה להקל ספיגת מים משתן ראשוני. סטיות של שחרור מAVP איתות יותרת המוח או AVP המופעל בתאים עיקריים יכולות לגרום לסוכרת תפלה מרכזית או nephrogenic, בהתאמה; רמה גבוהה בדם פלזמה AVP קשורה למחלות לב וכלי דם, כגון אי ספיקת לב כרונית ותסמונת של הפרשת הורמון antidiuretic לא הולמת.

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לcultivatiמלשד פנימי עכברוש העיקרי איסוף צינור (IMCD) תאים, שמבטא V2R וAQP2 endogenously. התאים מתאימים להבהרת מנגנונים מולקולריים שבבסיס הבקרה של AQP2 ובכך לגלות מטרות תרופה חדשות לטיפול במחלות הקשורות לחוסר ויסות של ספיגת מים AVP בתיווך. תאי IMCD מתקבלים מmedullae פנימי כליות חולדה ומשמשים לניסויים שישה עד שמונה ימים לאחר זריעה. יכולים להיות מתורבתים תאי IMCD במנות רגילות תרבית תאים, צלוחיות וצלחות מייקר כייל של פורמטים שונים, ההליך דורש רק כמה שעות, והוא מתאים למעבדות תרבית תאים סטנדרטיות.

מבוא

בתאים עיקריים צינור איסוף כליות, ארגינין-וזופרסין (AVP) שולט במים על ידי גירוי ספיג חוזר של החדרת המים ערוץ aquaporin-2 (AQP2) לתוך קרום הפלזמה. AVP נקשר לרצפטור וזופרסין סוג 2 G-חלבון בשילוב (V2R) גירוי cyclase adenylyl ובכך היווצרות cAMP. תחילתו של מפל איתות זה מובילה להפעלה של החלבון קינאז (PKA). PKA phosphorylates AQP2 בסרין 256 (S256), המהווה את הגורם העיקרי לחלוקה מחדש שלה משלפוחית ​​תאיות לתוך קרום הפלזמה. הכניסה הקרום מאפשרת ספיגה חוזרת של מים לאורך שיפוע האוסמוטי ועדינות מנגינות הומאוסטזיס מים בגוף.

Dysregulation של ספיגת מים AVP בתיווך, בשל סטיות של הפרשת AVP או גורמי איתות AVP-מופעלים או קשור למחלות קשות. ירידה נגרמה על ידי מוטציות של V2R או AQP2 ספיגת מים מובילה לסוכרת תפלה nephrogenic, בעוד שגובה מעל פני יםרמת AVP פלזמה דם ated קשורה לספיגת מים מוגזמת במחלות לב וכלי דם, כגון אי ספיקת לב כרונית ותסמונת של הפרשת הורמון antidiuretic הולמת (SIADH).

המשמעות של ספיגת מים AVP בתיווך נובעת לא רק מההשלכות שלה במחלה. טרנסלוקציה-Induced AVP של שלפוחית ​​AQP2 נושאים ולאיחוי עם קרום הפלזמה מייצגת תהליך exocytic קפדנות מחנה תלוי, אשר כיום אינה מובנת היטב. דוגמאות אחרות לexocytosis מחנה תלוי הן הפרשת רנין בכליה וH + הפרשה בבטן. לכן, הבהרת מנגנונים מולקולריים השולטים AQP2-טרנסלוקציה בתאי הכליה עיקריות לא רק עוזרת להבנת תהליכים מולקולריים דומים בסוגי תאים אחרים, אלא גם עשויה לסלול את הדרך לטיפולים חדשים לטיפול במחלות הקשורות להפרעות בספיגת מים AVP בתיווך .

Elucidating AQP2 שליטה מנגנונים דורש איסוף מודלים תא עיקריים דביק. לשם כך מספר שורות תאי כליות יונקים שונים זמין. עם זאת, המודלים האלה יש כמה חסרונות. במערכות סלולריים רבות את רמת החלבון של AQP2 היא נמוכה (טבלת 1; M1, HEK293, COS-7, MDCK, LLC-PK1) 1-10, אחרים ectopically overexpress אדם (MCD4, WT10) 11,12 או עכברוש (CD8) 13 AQP2. בMCD4 וCOS-7 תאים רצפטור V2 לא בא לידי ביטוי. למיטב ידיעתנו אין קו תא קבוע כמודל זמין, הנגזר מאיסוף הצינור הלשדי הפנימי כליות, את אותו חלק של הכליה בי AQP2 הביטוי הוא נפוץ ביותר, אבל מצינור 1,11,13-16 קליפת המוח האיסוף . מודלים תא כאלה הם למשל mpkCCD הונצח בשימוש נרחב (לדוגמה 17) או את 14 קווים שהוקמו לאחרונה mTERT-CCD הסלולרי. שתי שורות תאי endogenously המפורש AQP2 וV2R אבל מאז הם הנגזריםצינור איסוף קליפת המוח הקרוב לוודאי מכיל proteome שונה לעומת לשדי פנימי איסוף צינור (IMCD) תאים. הם חייבים להביע למשל Na שונה + מערכות תחבורה.

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לתאי IMCD עיקריים תרבות המבטאים V2R וAQP2 endogenously. מודל זה, אם כן, מייצג באופן קרוב ביותר את המצב הפיזיולוגי בצינור איסוף הכליות. כביסוס התרבות דורש רק תקן מעבדות אחרות ציוד מעבדה יכולות בקלות לאמץ את הגישה הזו.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. הכנה

  1. מכין את מנות התרבות
    1. הפשירו קולגן סוג IV O / N ב 4 ° C ולפזר אותו בחומצה אצטית 0.1% סטרילית. הנפח להשתמש תלוי בסוג ובמספר המנות שבתאים שנזרעו. השתמש 2 מיקרוגרם / 2 ס"מ.
    2. דגירה מנות לפחות במשך שעה 1 ב RT ולשטוף פעמיים עם מים מזוקקים (א tridest).
    3. לאפשר את הכלים לייבוש כמו שצריך.
  2. תוספת של מדיום
    1. הגדל את רמת הגלוקוז עד 4.5 גר '/ ל' על ידי הוספה גרם גלוקוז 1.75 עד בינונית 500 מ"ל. כדי להתאים את המדיום ל600 mosmol, להוסיף 100 מ"מ NaCl ואוריאת 100 מ"מ, כדי להגדיל את osmolarity ב -200 mosmol ו100 mosmol, בהתאמה.
    2. הוסף חומצות 1% שאינם חיוני אמינו, 1% ultroser, DBcAMP 500 מיקרומטר, 20 nystatin U / מ"ל ​​ו0.25 מיקרוגרם / מיליליטר גנטמיצין (1:200 דילול של פתרון מניות עם ריכוז של 50 מיקרוגרם / מ"ל) עד ​​600 מדיום DMEM mosmol טרי ביום ההכנה.

  3. פתרון אנזים
    1. הוסף מ"ג / מיליליטר hyaluronidase 1 ו -2.2 collagenase מ"ג / מ"ל ​​לDPBS המכיל 0.25 מיקרוגרם / מ"ל ​​גנטמיצין וnystatin. להכין 1 מ"ל של תמיסת אנזים זה לעיכול של medullae 2 הכליות פנימית. הפתרון חייב להיות מעוקר על ידי סינון ומאוחסן ב50 צינורות מ"ל פלקון.

2. טיפוח של Medullary פנימי עכברוש הראשוני איסוף צינור (IMCD) תאים

כל נהלי הטיפול בבעלי החיים הם להתבצע בהתאם לחקיקה פדרלית והמקומית.

  1. לטשטש בחולדות CO 2 (בתיבה רוויה עם CO 2) או isoflurane (U-400 אלחוש יחידה, Univentor בע"מ, מלטה; זרימת אוויר 350-400 מ"ל / דקה עם 2-2.5% isoflurane). לערוף את החיות לדימום המאפשר זיהוי של גבול שבין הפנימי לבנבן והלשד החיצוני הכהה יותר מדויק. בנוסף, הדימום ממזער את מספר אריתרוציטים בודדים. הסר כליות ולשטוף אותם בDPBS סטרילית השלים עם גנטמיצין וnystatin (ראה לעיל) על קרח. כל צעדים נוספים הם להתבצע בתנאים סטריליים ספסל נקי.
  2. העבר את הכליות מפתרון DPBS על לדחוס סטרילי כדי להסיר נוזל מוגזם. הסר את הקפסולה כליות שומן עם מלקחיים ומספריים סטריליים.
  3. לאחר שהכליות עדיין קבועות ברטייה, לחתוך מעט ליד ציר האורך של הצד החיצוני (קליפת המוח). הקפד לא לחתוך לגמרי, אבל כדי להשאיר אותו בחתיכה אחת, מחובר באגן הכליה.
  4. עם מספריים מעוגלים לנתח medullae הפנימי לבנבן, שמוקפים בלשד החיצוני נצנץ רוזה בזהירות. לאסוף אותם בDPBS, המכיל גנטמיצין וnystatin בצלחת תרבות 60 מ"מ על קרח.
  5. לאחר שכל medullae מבודד ונאסף על קרח, להפחית את עוצמת הקול של DPBS לרמה שבה הם פשוט מכוסים במאגר. השתמש בסכין גילוח סטרילית לחתוך לקוביות של medullae 5מ"מ 3.
  6. ממסים ולעגל את הקצה החד של פסטר פיפטה סטרילית על ידי מחזיק אותו לזמן קצר לתוך להבה. ודא פיפטה היא מקוררת לפני שתמשיך.
  7. מעבירים את ההשעיה הרקמות ל50 צינורות מ"ל פלקון המכילים פתרון אנזים סטרילי מוכן טרי עם hyaluronidase וcollagenase (ראה 1.3.1) על ידי השימוש בפיפטה פסטר המעוגלת. סגור את המכסה בחוזקה ולדגור על 37 מעלות צלזיוס תחת תסיסה מתמשכת (220 סל"ד) באמבטיה רגילה שולחן מים עבור 1.5 - 2 שעות.
  8. לטחינה דקה של ההשעיה, פיפטה את התערובת מעלה ומטה מספר פעמים עם סיבוב פיפטה פסטר (ראה לעיל) ועד להשעיה הופכת עכור הומוגנית.
  9. צנטריפוגה ההשעיה למשך 5 דקות ב 300 XG ו16 ° C. בטל supernatant, resuspend את הכדור באופן יסודי בDPBS, המכיל גנטמיצין וnystatin ו צנטריפוגות שוב. חזור על שלב שטיפה זה פעם אחת.
  10. Resuspend התאים במדיום וזרעם לג בתוספת באופן מלאמנות ulture ו / או צלחות גם מיקרו כייל. הכנת 2 medullae (בעלי החיים 1) תניב תאים יספיקו לצלחת תרבות 60 מ"מ.
  11. לאחר 24 שעות, לשטוף תאים פעמיים עם 600 mosmol DMEM ולהוסיף מדיום חדש. במהלך השבוע הבא יש לשטוף את התאים 2-3 פעמים (איור 1). 6-8 ימים לאחר זריעה, תאי IMCD יכולים לשמש לניסויים. זכור לדגירה אותם במדיום בלי DBcAMP וnystatin למשך 24 שעות לפני תחילת הניסוי. אחרת AQP2 יהיה ממוקם באופן בלעדי בקרום הפלזמה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

הגידול המוצלח של תאי IMCD עכברוש עיקריים יביא בשכבת מחוברות 6-8 ימים לאחר הזריעה (איור 2). למנת תרבות 60 מ"מ יש כ 6 x 10 6 תאים. התאים בחוזקה לדבוק במנות התרבות, שכן אלה היו מצופים בקולגן הסוג IV, מרכיב קרום במרתף 18. לכן, תאי IMCD לא לנתק גם במספר הליכי שטיפה יסודי. עד 80% מהתאים בתרבית ולהביע V2R AQP2 endogenously. אלה הם תאים העיקריים, ואילו התאים חסרי AQP2 נחשבים תאי intercalated, תאים שאינם IMCD נגזרים מגפיים דקיקים של הלולאה של Hen...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

אנו מציגים פרוטוקול מפורט להכנה וculturing של תאי IMCD עכברוש ראשוניים. גישת תשואות של עד 21 ס"מ 2 של תאים מחולדה אחת 20. הניסוי דורש ציוד תרבית תאים סטנדרטי ויכול להתבצע על ידי אדם אחד בתוך כ 6 שעות. לכן, גישה זו היא מתאימה כמו שיטת מעבדה סטנדרטית.

ניתן זורעים תאי IMCD עכברוש עיקריים במנות התרבות של גודל שונה, הנעים בין 96 ל -60 צלחות גם מנות מ"מ. עם זאת, לצמיחה ב384 פורמט גם ההלי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי Forschungsgemeinschaft דויטשה (DFG; KL 1415/3-2 וKL 1415/4-2).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
קולגן סוג IV עכברBD Biosciences356233
HyaluronidaseSIGMAH6254
קולגנאז מסוג CLS-IIBiochrom AGC2-22
DMEM +GlutMAX Invitrogen GIBCO21885108
NystatinSIGMAN4014
Ultroser GCytogen15950-017
חומצות אמינו לא חיוניות (NEA)Biochrom AGK0293
GentamicinInvitrogen GIBCO15710
DBcAMPBIOLOGD009

מקורות

  1. Stoos, B. A., Naray-Fejes-Toth, A., Carretero, O. A., Ito, S., Fejes-Toth, G. Characterization of a mouse cortical collecting duct cell line. Kidney International. 39, 1168-1175 (1991).
  2. Graham, F. L., Smiley, J., Russell, W. C., Nairn, R. Characteristics of a human cell line transformed by DNA from human adenovirus type 5. The Journal of general virology. 36, 59-74 (1977).
  3. Gluzman, Y. SV40-transformed simian cells support the replication of early SV40 mutants. Cell. 23, 175-182 (1981).
  4. Ala, Y., et al. Functional studies of twelve mutant V2 vasopressin receptors related to nephrogenic diabetes insipidus: molecular basis of a mild clinical phenotype. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 9, 1861-1872 (1998).
  5. Richardson, J. C., Scalera, V., Simmons, N. L. Identification of two strains of MDCK cells which resemble separate nephron tubule segments. Biochimica et Biophysica Acta. 673, 26-36 (1981).
  6. Chen, Y., et al. Aquaporin 2 Promotes Cell Migration and Epithelial Morphogenesis. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. , (2012).
  7. Perantoni, A., Berman, J. J. Properties of Wilms' tumor line (TuWi) and pig kidney line (LLC-PK1) typical of normal kidney tubular epithelium. In vitro. 15, 446-454 (1979).
  8. Katsura, T., et al. Constitutive and regulated membrane expression of aquaporin 1 and aquaporin 2 water channels in stably transfected LLC-PK1 epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92, 7212-7216 (1995).
  9. Hull, R. N., Cherry, W. R., Weaver, G. W. The origin and characteristics of a pig kidney cell strain, LLC-PK. In vitro. 12, 670-677 (1976).
  10. Nedvetsky, P. I., et al. Reciprocal regulation of aquaporin-2 abundance and degradation by protein kinase A and p38-MAP kinase. J. Am. Soc. Nephrol. 21, 1645-1656 (2010).
  11. Iolascon, A., et al. Characterization of Two Novel Missense Mutations in the AQP2 Gene Causing Nephrogenic Diabetes Insipidus. Nephron Physiology. 105, p33-p41 (2007).
  12. Deen, P. M., et al. Aquaporin-2 transfection of Madin-Darby canine kidney cells reconstitutes vasopressin-regulated transcellular osmotic water transport. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 8, 1493-1501 (1997).
  13. Valenti, G., Frigeri, A., Ronco, P. M., D'Ettorre, C., Svelto, M. Expression and functional analysis of water channels in a stably AQP2-transfected human collecting duct cell line. The Journal of Biological Chemistry. 271, 24365-24370 (1996).
  14. Steele, S. L., et al. Telomerase immortalization of principal cells from mouse collecting duct. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 299, F1507-F1514 (2010).
  15. Bens, M., et al. Corticosteroid-dependent sodium transport in a novel immortalized mouse collecting duct principal cell line. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 10, 923-934 (1999).
  16. Hasler, U., et al. Long term regulation of aquaporin-2 expression in vasopressin-responsive renal collecting duct principal cells. The Journal of Biological Chemistry. 277, 10379-10386 (1074).
  17. Miller, R. L., Sandoval, P. C., Pisitkun, T., Knepper, M. A., Hoffert, J. D. Vasopressin inhibits apoptosis in renal collecting duct cells. American Journal of Physiology. Renal Physiology. , (2012).
  18. Kleinman, H. K., et al. Basement membrane complexes with biological activity. Biochemistry. 25, 312-318 (1986).
  19. Storm, R., Klussmann, E., Geelhaar, A., Rosenthal, W., Maric, K. Osmolality and solute composition are strong regulators of AQP2 expression in renal principal cells. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 284, 189-198 (2003).
  20. Maric, K., Oksche, A., Rosenthal, W. Aquaporin-2 expression in primary cultured rat inner medullary collecting duct cells. Am. J. Physiol. 275, 796-801 (1998).
  21. Liebenhoff, U., Rosenthal, W. Identification of Rab3-, Rab5a- and synaptobrevin II-like proteins in a preparation of rat kidney vesicles containing the vasopressin-regulated water channel. FEBS Lett. 365, 209-213 (1995).
  22. Lorenz, D., et al. Cyclic AMP is sufficient for triggering the exocytic recruitment of aquaporin-2 in renal epithelial cells. EMBO Rep. 4, 88-93 (2003).
  23. Tamma, G., et al. The prostaglandin E2 analogue sulprostone antagonizes vasopressin-induced antidiuresis through activation of Rho. J. Cell Sci. 116, 3285-3294 (2003).
  24. Maric, K., et al. Cell volume kinetics of adherent epithelial cells measured by laser scanning reflection microscopy: determination of water permeability changes of renal principal cells. Biophys. J. 80, 1783-1790 (2001).
  25. Gonzalez, A. A., et al. Angiotensin II stimulates renin in inner medullary collecting duct cells via protein kinase C and independent of epithelial sodium channel and mineralocorticoid receptor activity. Hypertension. 57, 594-599 (2011).
  26. Chou, C. L., et al. Regulation of aquaporin-2 trafficking by vasopressin in the renal collecting duct. Roles of ryanodine-sensitive Ca2+ stores and calmodulin. The Journal of Biological Chemistry. 275, 36839-36846 (2000).
  27. Uawithya, P., Pisitkun, T., Ruttenberg, B. E., Knepper, M. A. Transcriptional profiling of native inner medullary collecting duct cells from rat kidney. Physiological Genomics. 32, 229-253 (2008).
  28. Tchapyjnikov, D. Proteomic profiling of nuclei from native renal inner medullary collecting duct cells using LC-MS/MS. Physiological Genomics. 40, 167-183 (2010).
  29. Stefan, E., et al. Compartmentalization of cAMP-dependent signaling by phosphodiesterase-4D is involved in the regulation of vasopressin-mediated water reabsorption in renal principal cells. J. Am. Soc. Nephrol. 18, 199-212 (2007).
  30. Klussmann, E., et al. An inhibitory role of Rho in the vasopressin-mediated translocation of aquaporin-2 into cell membranes of renal principal cells. J. Biol. Chem. 276, 20451-20457 (2001).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תיקון


Formal Correction: Erratum: Culturing Primary Rat Inner Medullary Collecting Duct Cells
Posted by JoVE Editors on 8/28/2013. Citeable Link.

A correction was made to Culturing Primary Rat Inner Medullary Collecting Duct Cells. There was an error with an author's name. The author's last name had a typo and was corrected to:

Enno Klussmann

instead of:

Enno Klussman

תגיות

תאי IMCD ראשוניים של חולדהבידוד מהמדולה הפנימיתעיכול אנזימטי של רקמהפרוטוקול תרבית תאיםסיגנלציה של ארגינין ואזופרסיןטרנסלוקציה של אקוואפורין-2ביטוי של רצפטור V2ציפוי קולגןאנליזה של Western Blotמיקרוסקופיה של אימונופלורסצנציה
Medullary העכברוש הראשוני culturing הפנימי איסוף תאי Duct
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.