הרבייה מכאנית מושרה גירוי סיד גל בmonolayers הסלולרי: דוגמה לתאי אנדותל קרני שור

סיכום

Ca אינטר ^{2 +} גלים מונעים על ידי ערוצי צומת גאפ וhemichannels. כאן, אנו מתארים שיטה למדידת Ca אינטר ^{2 +} גלים בmonolayers הסלולרי בתגובה לגירוי מכאני מתא בודד מקומי והיישום שלה כדי לחקור את המאפיינים והרגולציה של ערוצי צומת גאפ וhemichannels.

תקציר

תקשורת בין תאית היא חיונית לתיאום של תהליכים פיסיולוגיים בין תאים במגוון רחב של איברים ורקמות, ובכלל זה המוח, הכבד, הרשתית, השבלול וכלי הדם. בהגדרות ניסוי, אינטר Ca ^{2 +} גלים יכול להיות שהושרו על ידי יישום גירוי מכאני לתא בודד. זה מוביל לשחרור של מולקולות האיתות תאיות IP ₃ ו Ca ^{2 +} שיזמו את ההתפשטות של Ca ^{2 +} גל מעגלי מתא מגורה מכאני לתאים השכנים. את המסלולים המולקולריים המרכזיים השולטים ² התפשטות אינטר ⁺ גל Ca מסופקים על ידי ערוצי צומת פער עד להעברה הישירה של _3-IP ועל ידי hemichannels דרך שחרורו של ה-ATP. זיהוי והאפיון של המאפיינים והרגולציה של connexin שונה וisoforms pannexin כערוצי צומת גאפ וhemichannels מותר על ידי quantification של התפשטות Ca אינטר ^{2 +} גל, siRNA, ושימוש במעכבים של ערוצי צומת גאפ וhemichannels. כאן, אנו מתארים שיטה למדידה אינטר Ca ^{2 +} גל בmonolayers של תאי האנדותל בקרנית עיקריים עמוסים Fluo4-AM בתגובה לגירוי מכאני מבוקר ומקומי עורר על ידי עיוות חריפה, קצר טווח של התא כתוצאה נגיעה של קרום התא עם micropipette זכוכית micromanipulator שליטה בקוטר קצה מיקרומטר פחות מ 1. אנו גם מתארים את הבידוד של תאים ראשוניים שור קרנית האנדותל והשימוש בו כמערכת מודל להערכת פעילות Cx43-hemichannel ככוח מונע לאינטר Ca ^{2 +} גלים דרך שחרורו של ה-ATP. לבסוף, אנו דנים בשימוש, יתרונות, מגבלות וחלופות של שיטה זו בהקשר של ערוץ צומת פער ומחקר hemichannel.

מבוא

תקשורת בין תאית ואיתות חיונית לתיאום של תהליכים פיסיולוגיים בתגובה לאגוניסטים תאיים ברמה ^1,2 כל האיבר והרקמה. הדרך הישירה ביותר של תקשורת בין תאית נוצרה על ידי ההתרחשות של צמתים פער. צמתים פער הם לוחות של ערוצי צומת גאפ, שהם ערוצים חלבוניים שהוקמו על ידי העגינה הראש בראש של שתי connexin (CX) hemichannels של תאים סמוכים ^3,4 (איור 1). צמתים פער לאפשר המעבר של מולקולות איתות קטנות עם משקל מולקולרי של פחות מ -1.5 kDa, כולל Ca ^{2 +} או ה-IP של ₃ ^5, מה שגרם וויסות Ca ^{2 +} שחרור מהחנויות תאיות של התאים השכנים ⁶ (איור 2). ערוצי צומת פער מוסדרים היטב על ידי אינטראקציות חלבון ותוך מולקולאריים ועל ידי תהליכי איתות תאיים, כמו שינוי והחיזורזירחון ^7. GJS להקל על התגובה מתואמת של תאים מחוברים, ובכך מתנהג כמו כימי וsyncytium חשמל. לדוגמה, הפצה של פוטנציאל פעולת לב על פני myocytes פרוזדורים וחדרים מתווכת על ידי ערוצי ⁸⁵ GJ מבוסס CX. CXS יש לא רק תפקיד כערוצי צומת פער, אלא גם ליצור hemichannels מזווג, ובכך מתפקד כערוצים בקרום בדומה לערוצים רגילים יון ^8-10 (איור 1). Hemichannels להשתתף באיתות בין תאים שכנים paracrine על ידי שליטה בחילופי יונים ומולקולות איתות בין סביבת התוך תאית ו.

בסוגי תאים רבים (כמו תאי אפיתל, תאי osteoblastic, האסטרוציטים, תאי אנדותל, וכו ') ואיברים (כמו מוח, כבד, רשתית, שבלול וכלי דם), אינטר Ca ^{2 +} גלים הם יסוד לתיאום של תגובות תאיות ^{11. עליות בCa 2 + רמות תאיות בתא מסוים אינן מוגבלות לתא זה, אבל להפיץ לתאים השכנים בסביבה, וכך לבסס Ca אינטר 2 + גל 12,13. Ca 2 + אלה אינטר גלים חשובים לויסות פיזיולוגית נורמלית של שכבות תאים כsyncytium וdysregulation נקשר עם תהליכי pathophysiological 11. באנדותל ואפיתל קרני, קבוצות שונות 14-24, כולל 25-33 משלנו, חקרו את המנגנונים ואת התפקידים של תקשורת בין תאית. בתאים שאינם נרגשים, כמו תאי אנדותל בקרנית, שני מצבים שונים של תקשורת בין תאית להתרחש 28,29, כלומר פער תקשורת בין תאית junctional ותקשורת בין תאית paracrine. תקשורת בין תאית junctional פער כרוכה בחילופים ישירים של מולקולות איתות דרך צמתים פער 7. פער juncתקשורת בין תאית tional היא קריטית לשמירה על הומאוסטזיס רקמות, השליטה התפשטות תאים, והקמה מסונכרנת תגובה ללחץ תאי 10,34,35. במספר פתולוגיות, צימוד צומת פער מצטמצם עקב פגום CXS, ומשפיע על פער תקשורת בין תאית 36 junctional בזאת. זה מדגיש את החשיבות והשפעה של תקשורת בין תאית junctional פער באורגניזמים תאיים. בניגוד לתקשורת בין תאית junctional פער, תקשורת בין תאית paracrine אינה תלויה בפרד תאי תאים, שכן היא כוללת את שחרורו של שליחים תאיים diffusible (איור 2). סוגים שונים של מולקולות איתות משתחררים בחלל החוץ התאי על ידי תאי איתות. המולקולה לאחר מכן הועברה לתא היעד שבו הוא זוהה על ידי חלבון קולטן ספציפי. כתוצאה מכך מורכבת קולט האותות גורם לתגובה תאית, אשרהוא הופסק על ידי הסרת האות, איון או הפחתת רגישות. שליחים תאיים lipophilic פורסם איתות לחדור את הקרום ולפעול על קולטני תאיות. בניגוד לכך, שליחים הידרופילי לא לחצות את קרום הפלזמה של התא להגיב, אבל לפעול כיגנד שנקשר לחלבוני פני שטח, הביעו הקולטן, אשר לאחר מכן להעביר את האות לסביבה תאית. שלוש משפחות עיקריות של חלבונים פני תא קולטן להשתתף בתהליך הזה: קשור יון ערוצים, אנזים צמוד וצמוד לחלבון G. מולקולת השליח שוחרר יכולה לפעול על הקולטנים של אותו התא (autocrine), על תאי המטרה בסמיכות (paracrine), או על תאי היעד רחוקים שדורשים מערכת הדם (האנדוקרינית).}

בסוגי תאים רבים, כולל קרנית האנדותל ^28,29, ה-ATP הוא אחד הגורמים העיקריים paracrine הידרופילי, המניעים את ההתפשטות של אינטר Ca ^{2 +} גלים ^37-40. משךעיוות מכאנית ing, היפוקסיה, דלקת או גירוי על ידי סוכנים שונים, ניתן לשחרר ATP מהתאים בריאים ^41-44 בתגובה למאמץ גזירה, מתיחה, או נפיחות האוסמוטי ^44,45. מנגנוני ה-ATP-הפצה אחרות כבר הניחו, כולל exocytosis לפוחי ⁴⁴ ושפע של מנגנוני הובלה, כגון ה-ATP מחייבים קלטות (ABC) מובילים, ערוצי אניון מתח התלויים plasmalemmal ^46, P2X7 ערוצי קולט ^47,48, כמו גם connexin hemichannels ^49-52 וpannexin hemichannels ^43,49,53. ATP תאי יכול להיות במהירות הידרוליזה לADP, AMP ואדנוזין ^54,55 ידי ectonucleotidases שנמצאים בסביבה תאית. ה-ATP שפורסם extracellularly וADP המטבוליט שלה ⁵⁶ תהיה להפיץ באמצעות דיפוזיה. האינטראקציה הבאה של נוקלאוטידים אלה עם קולטני purinergic בתאים השכנים הייתה מעורבת בעמ 'ropagation של אינטר Ca ^{2 +} גלים ^28,37,51. שני סוגים של קולטנים שונים purinergic נוכחים: אדנוזין הוא ליגנד הטבעי העיקרי לP1-purinoceptors, בעוד הן פורין (ATP, ADP) ופירימידין (UTP, UDP) נוקלאוטידים ביותר לפעול על P2-purinoceptors ^57.

תקשורת בין תאית יכולה להיחקר על ידי שיטות שונות כגון טעינה לגרד, העברת צבע, משחררות רפרוף מקומית של אגוניסטים כמו IP ₃ וCa ^{2 +,} גירוי מכאני, וכו '. כאן אנו מתארים את המחקר של Ca ^{2 +} התפשטות גל שהושרו על ידי גירוי מכאני של תא בודד. היתרון של לימוד ^{2 +} התפשטות גל CA על ידי גירוי מכאני הוא שהיא מספקת כלי קל לכמת את התפשטות Ca ^{2 +} גל לאורך זמן, והיא מאפשרת השוואת כמותית pretreatments של התאים שונים. באנדותל בקרנית, אלה Ca ^{2 +} אינטר גלים לאפשר שיתוףתגובה מתואמת מmonolayer, מתנהגת בזאת כמנגנון הגנה אפשרי של האנדותל של הקרנית שאינם משובי עוזרים האנדותל לעמוד לחצים תאיים במהלך ניתוח תוך עיני, או בחשיפה למתווכים דלקתיים במהלך דחייה של מערכת חיסון או אובאיטיס ^58,59.

פרוטוקול

1. בידוד של תאי אנדותל הקרניים

לפני שיתחיל: לבודד את התאים מהעיניים טריות, המתקבלות מהמטבחיים מקומי, בהקדם האפשרי לאחר enucleating העין. ודא כי העין הייתה enucleated מפרה של בן 18 חודשים, חמש פוסט המורט והשתמרו בתמיסת מלח מאוזנת של ארל דקות מקסימליים - תמיסת יוד 1% ב 4 ° C להובלה למעבדה.

1. קח עין מתמיסת מלח מאוזנת של ארל - תמיסת יוד 1% ולמקם אותו בצלחת פטרי (100 מ"מ X 20).
2. לעקר את העין עם תמיסה המכילה 70% אתנול ולשטוף עם תמיסת מלח מאוזנת של ארל המכילה 1% יוד.
3. משלב זה ואילך, לעבוד במנדף סטרילי. בזהירות לנתח את הקרנית מהעין ולמקם אותו בצלחת פטרי (35 x 10 מ"מ) המכילה תמיסת מלח מאוזנת של ארל, עם שכבת תאי האפיתל פונה כלפי מעלה. להסיר כל Sti רקמת איריס שנותר בזהירותיהיה מחובר לקרנית במידת צורך.
4. העבר את הקרנית לתמיסת מלח מאוזנת של ארל אחר המכילה צלחת פטרי עם שכבת תאי האנדותל כלפי מעלה ולשטוף פעמיים עם תמיסת מלח מאוזנת של ארל.
5. העבר את הקרנית עם שכבת האנדותל פונה כלפי מעלה לשעון חול, שהוא מאכל בצורת כוס, ולכסות אותו עם מדיום גידול. מדיום הגידול מורכב מבינוני השתנה Dulbecco של הנשר המכיל גלוקוז 25 מ"מ, 10% בסרום שור עוברי, 6.6% L-גלוטמין, 2.5 מיקרוגרם / מיליליטר amphotericin-B ו 1% תערובת האנטיביוטיקה antimycotic המכיל 10,000 יחידות / מ"ל ​​של פניצילין, 10,000 מיקרוגרם / מ"ל ​​של סטרפטומיצין, ו -25 מיקרוגרם / מיליליטר amphotericin B.
6. הסר את המדיום עם טפטפת יניקה.
7. החל μl 300 של פתרון טריפסין (0.5 גר '/ ל') לשכבת האנדותל של הקרנית (כל הצעדים הכוללים טריפסין נעשים באמצעות אותו הריכוז).
8. הנח את שעון חול המכיל את הקרנית בצלחת פטרי מכוסה ושם אותו בincubator למשך 30 דקות בשעה 37 ° C ו 5% CO _2.
9. בעדינות לגרד את תאי האנדותל מקרנית עם זכוכית פיפטה פסטר בצורת וו אש מלוטשת בשכונת סטרילי.
10. תמצוץ את התמיסה המכילה את תאי האנדותל ולהוסיף אותו לתרבות צלוחיות (25 ס"מ ²⁾ המכילות 4 מ"ל של מדיום התרבות.
11. החל μl 300 של מדיום גידול לקרנית וחזור גירוד ולהוסיף תמיסה המכילה את תאי האנדותל לבקבוק התרבות.
12. חזור על שלב זה סופי (1.11) פעם נוספת.
13. הנח את תרבות צלוחיות המכילים את תאי האנדותל בקרנית במדיום הגידול בחממה ב 37 ° C ו 5% CO _2.
14. לאחר יומיים, להוסיף 6 מ"ל של מדיום התרבות.
15. רענן מדיום גידול כל יום שני.

2. תרבית תאים

1. הסר את מדיום התרבות לשטוף את התאים פעמיים עם הפתרון של ארל מאוזן מלח, כאשר confluency הוא הגיע (באבו10 ימים לאחר בידוד t).
2. הוסף פתרון 1.5 מ"ל טריפסין לתאים כדי לנתק אותם ומניחים את הבקבוק בחממה (37 מעלות צלזיוס, 5% CO ₂₎ במשך 3 עד 4 דקות.
3. הוסף 12 מ"ל של מדיום גידול. פיפטה שלוש הפעמים בינוניות פנימה והחוצה כדי לפזר את התאים ולספור את התאים.
4. תאי זרע עם חלק קטן משתנה בהתאם לצפיפות התא ולשים אותם בחממה. הכן שתי שקופיות היטב בליעה (בשטח של 4.2 ס"מ ²⁾ עם ספירת תאים של 165,000 תאים (תא לצפיפות 39,286 ² ס"מ). הכן 80 ס"מ ² צלוחיות תרבות למעבר חדש בצפיפות של 6,250 ^ל2 ס"מ, ולהוסיף מדיום התרבות טרי עד נפח כולל של 25 מ"ל.
5. רענן בינונית כל יומיים.
6. Confluency של שכבת התאים הוא הגיע לאחר 3 עד 4 ימים. להשתמש בתאים לניסויים.
7. כאשר confluency של שכבת התאים בצלוחיות הוא הגיע, חזור על שלבי 2.1-2.6. ניתן להשתמש בתרביות תאים עד חלוף 2 Fאו ניסויים.

3. גירוי מכאני לגל סיד התרמה

1. לטעון את התאים בשקופית הקבורים עם 10 מיקרומטר Fluo-4 בבוקר בפוספט שנאגרו מלוח למשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס בזמן הטלטול בעדינות.
2. הסר Fluo-04:00 פתרון, לשטוף את התאים חמש פעמים עם פוספט שנאגרו מלוח, דגירה התאים עם פוספט שנאגרו מלוח ולהשאיר את התאים לפחות 5 דקות בטמפרטורת חדר לפני המדידה.
3. אקסייט ב 488 ננומטר עם ארגון לייזר ושימוש קורה המפצל HFT 488, לאסוף את פליטת הקרינה ב530 ננומטר באמצעות longpass פליטת מסנן LP 505, קבע את חריר במינימום. השתמש אובייקטיבי 40X טבילת שמן (אוויר, 1.2 NA). בניסויים עם ARL-67156, השתמש אובייקטיבי 10X (אוויר, 0.3 NA).
4. לחפש תחום שבו התאים ומחוברות במיקרוסקופ confocal.
5. עמדת פיפטה כך שזה ב 45 מעלות ביחס לשקופית הבליעה ונוגע בקרום התא.לעורר גירוי מכאני קצר (≈ 1 שניות) לתא בודד. הגירוי מכאני מורכב מעיוות חריפה, קצר טווח של התא על ידי נגיעה פחות מ -1% של קרום התא בקצרה עם micropipette כוס (קוטר קצה <1 מיקרומטר) מצמידים את nanopositioner גביש פיזואלקטריים, המופעל באמצעות מגבר שהוא רכוב על מיקרו מניפולטור. את micropipettes עשוי הזכוכית עם חולץ microelectrode. ודא כי nanopositioner מופעל על ידי מתח בין 0.2 ו 1.5 V במהלך הגירוי מכאני. מתח גבוה מ -1.5 וולט יכול לגרום לניזק לתאים. לכל סוג תא ולמצבו, המתח האופטימלי לגירוי מכאני ללא נזק לתאים צריך להיקבע בזהירות על ידי יישום שורה של מתחים החל מ נמוך (0.2 וולט) למתח גבוה (1.5 וולט). המתח הוא מדד לעוצמת הגירוי שכן מתח זה קובע את הלחץ מכאני ומתח שמוחלים על קרום התא.כוח של הגירוי מכאני יכול להיות מחושב על ידי הכפלת הלחץ מכאני עם האזור. מאז הן האזור (<3.14 מיקרומטר ²⁾ ולחץ מכאני הם נמוכים מאוד, כוח של הגירוי מכאני הוא נמוך. (שים לב שכאשר תא פגום, דליפות הקרינה אל מחוץ לתא והתא הופכים כהות.)
6. למדוד שינויים מרחביים ב[ Ca ^{2 +]} _אני בעקבות גירוי מכאני עם מיקרוסקופ confocal.
7. לאסוף ולאחסן את תמונות.
8. צייר אזור polygonal עניין להגדיר את שטח הפנים הכולל של תאים מגיבים (האזור פעיל, א.א.) באמצעות התוכנה של מיקרוסקופ confocal.

תוצאות

כל הניסויים מבוצעים בעמידה בכל ההנחיות הרלוונטיות, תקנות וגופים הרגולטוריים ואת הפרוטוקול שמפגינים מבוצע תחת הדרכתו ואישורו של הטיפול בבעלי החיים ועדת שימוש בלובן KU.

בתאי אנדותל בקרנית שור (BCEC), צמתים פער תפקודיים באים לידי ביטוי וגם תקשורת בין תאית junctional פער ותקשורת בין תאית paracrine לתרום באופן משמעותי לתקשורת בין תאית באופן אינטראקטיבית, אבל המסלול העיקרי הוכח להיות מסלול תקשורת בין תאית paracrine מתו...

דיון

בכתב יד זה, אנו מתארים שיטה פשוטה למדידת ^{2 +} אינטר התפשטות גל CA בmonolayers של תאי האנדותל בקרנית שור ראשוניים על ידי מתן גירוי מכאני מקומית ומבוקר באמצעות micropipette. תאי מגורה מכאני מגיבים בעלייה מקומית בIP תאי ₃ וCa ^{2 +,} אשר שניהם הם מולקולות איתות תאיות חיוניות המניעות אינטר Ca ^{2 +} גל התפשטות ^11,67. ה-IP של ₃ מועבר ישירות לתאי שכנים באמצעות ערוצי צומת פער ^5, בעוד Ca ^{2 +} מעורר פת...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
תמיסת מלח מאוזנת של ארל (EBSS)	בדיקות Invitrogen-Gibco-Molecular (קרלסרוהה, גרמניה)	14155-048
יוד	סיגמא-אולדריץ' (Deisenhofen, גרמניה)	38060-1EA
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)	בדיקות Invitrogen-Gibco-Molecular (קרלסרוהה, גרמניה)	11960-044
L-גלוטמין (Glutamax)	בדיקות Invitrogen-Gibco-Molecular (קרלסרוהה, גרמניה)	35050-038
Amphotericin-B	Sigma-Aldrich (Deisenhofen, גרמניה)	A2942
תערובת אנטיביוטית-אנטי-מיקוטית	בדיקות Invitrogen-Gibco-Molecular (קרלסרוהה, גרמניה)	15240-096
Trypsin	Invitrogen-Gibco-Molecular (קרלסרוהה, גרמניה)	25300-054
Dulbeccoבדיקות PBS	Invitrogen-Gibco-Molecular (קרלסרוהה, גרמניה)	14190-091
Fluo-4 AM	בדיקות Invitrogen-Gibco-Molecular (קרלסרוהה, גרמניה)	F14217
ARL-67156 (6-N,N-Diethyl-b,g-dibromomethylene-D-ATP)	Sigma-Aldrich (Deisenhofen, גרמניה)	A265
Apyrase VI	Sigma-Aldrich (Deisenhofen, גרמניה)	A6410
Apyrase VII	Sigma-Aldrich (Deisenhofen, גרמניה)	A6535
Gap26 (VCYDKSFPISHVR)	סינתזת
Gap27 (SRPTEKTIFII)	סינתזת
פפטיד בקרת פפטיד (SRGGEKNVFIV)	סינתזת
siRNA1 Cx43 (חוש: 5'GAAGGAGGAGGAACU-CAAAdTdT)	siRNA מחוסל נרכש ב Eurogentec (Luik, בלגיה)
siRNA2 Cx43 (חוש: 5'CAAUUCUUCCUGCCGCAAUdTdT)	siRNA מחוסל נרכש ב-Eurogentec (Luik, בלגיה)
siRNA ערבול: רצף מקושקש של siCx43-1 (חוש: 5'GGUAAACG-GAACGAGAAGAdTdT)	siRNA מחוסל נרכש ב-Eurogentec (Luik, בלגיה)
TAT-L2 (TAT-DGANVDMHLKQIEIKKFKYGIEEHGK)	Thermo Electron (Ulm, גרמניה)
TAT-L2-H126K/I130N (TAT-DGANVDMKLKQNEIKKFKYGIEEHGK	) תרמו אלקטרון (אולם, גרמניה)
שתי שקופיות זכוכית תאיות	Laboratory-Tek Nunc (רוסקילדה, דנמרק)	155380
מיקרוסקופ קונפוקלי	Carl Zeiss Meditec (Jena, גרמניה)	LSM510
Piez– ננו-פוזיונר קריסטל לקטרי (Piezo Flexure NanoPositioner)	PI Polytech (קרלסרוהה, גרמניה)	מגבר P-280
HVPZT	PI Polytech (קרלסרוהה, גרמניה)	E463 מגבר
צינורות זכוכית (החלפת זכוכית 3.5 ננו-ליטר)	World Precision Instruments, Inc. סרסוטה, פלורידה, ארה"ב	4878
Micr– Lectrode	puller Zeitz Instrumente (מינכן, גרמניה)	WZ DMZ-חולץ

בדיקותפפטידים מותאמת אישיתפפטידים מותאמת אישיתפפטידים מותאמת אישיתHVPZT אוניברסלי