בידוד של תאי האנדותל חדרית עובריים

סיכום

תרבית תאים העיקרית היא טכניקה שימושית לניתוח אוכלוסיות מסוימות של תאים, במיוחד מעוברי עכבר מהונדסים בשלבי התפתחות ספציפיים. בזאת, חדרי לב עובריים הם גזורים וניתקו, וחרוזים נוגדנים מצומדות לזהות ולהפריד את תאי האנדותל לניתוח נוסף.

תקציר

תרבית תאים שיפרה באופן משמעותי את היכולת שלנו להעריך אוכלוסיות בודדות של תאים בתנאי התרבות עצום. בעוד שורות תאים הנציחו מציעות יתרונות משמעותיים לנוחות השימוש שלהם, שורות תאים אלה אינן זמינות לכל סוגי התאים הפוטנציאליים. על ידי בידוד תאים ראשוניים מאזור מסוים של עניין, במיוחד מעכבר מהונדס, ניתן לבצע מחקרים מורכבים יותר. הטכניקה הבסיסית כרוכה לנתח איבר או איברים חלקיים של עניין (למשל לב או באזור מסוים של הלב) וdissociating האיברים לתאים בודדים. תאים אלה מודגרת מכן עם חרוזים מגנטיים מצומדות לנוגדן שמזהה את סוג התא של עניין. התאים של עניין אז יכולים להיות מבודדים עם השימוש במגנט, עם דגירה קצרה טריפסין dissociating תאים מאת החרוזים. אז יכולים להיות מתורבתים תאים מבודדים אלה וניתח המועדפים. טכניקה זו תוכננה במקור עבור איבר עכבר בוגראבל ים וניתן לשנות בקלות את לשימוש עם איברים עובריים, כפי שמודגם במסמך זה. כי האינטרס שלנו הוא בכלי הדם כליליים פיתוח, אנחנו רוצים ללמוד אוכלוסייה של תאים זה בשלבים עובריים ספציפיים. לפיכך, פרוטוקול המקורי היה צריך להיות שונה כדי להיות תואם עם הגודל הקטן של החדרים העובריים והתשואה הפוטנציאלית הנמוכה של תאי האנדותל בשלבי התפתחותיים אלה. ניצול גישה מוקטנת זה, יש לנו להעריך שיפוץ מקלעת כלילית בתאי אנדותל חדריות עובריים מהונדסים.

מבוא

כניסתו של שורות תאים הנציחו יש מהפכה ביולוגיה של תא בסיסית ^1. שורות התאים הקיימים כיום נגזרות ממגוון רחב של איברים ולהקיף את כל סוגי התאים העיקריים. עם זאת, יש לי שורות תאים הוקמו כמה מגבלות. תהליך ההנצחה ברור שמשנה את אופן הפעולה של התאים, במיוחד ביחס לתוחלת חיים והתפשטות, אלא גם יכול להשפיע על הביטוי של חלבונים בלתי צפויים, כגון חלבוני cytoskeletal ^2. בנוסף, למרות ששורות תאים רבות ושונות זמינות, יש גיוון משמעותי בקרב אפילו סוג תא בודד בתוך כל אורגניזם. תאי אנדותל בהתנהגויות מגוונות מופע מסוימות המבוססים על אם הם קו עורקים או ורידים ואיזה סוג של זרימה הוא הווה בכלי ^3. ועוד יותר דחוף מבחינה התפתחותית, לעומת זאת, הוא שהרוב המכריע של שורות התאים הזמינות נגזרים מרקמות בוגרת (ראה, למשל tהוא אוסף זמין דרך ATCC). שורות תאי בוגרים אלה עשויים לא לשחזר את האופי הדינמי של המבשרים העובריים שלהם. את דפוסי ביטוי גנים spatiotemporal המשתנים במהירות שנצפו במהלך פיתוח גם מצביעים על כך שתא האנדותל מאיבר אחד בכל שלב התפתחותי נתון לא יכול להתנהג באותה הצורה כמו תא האנדותל מאותו איבר בשלב התפתחותי שונה.

כחלופה לשימוש בשורות תאים הנציחו זמינות מסחרי, ניתן לבודד תאים ראשוניים מהרקמה הספציפית של עניין. בין היתרונות של טכניקה זו, ניתן לבודד תאים הראשוניים אלה מאיבר מסוים או אפילו חלק מאיבר בכל שלב התפתחותי מסוים. יתר על כן, ניתן לבודד תאים הראשוניים אלה ממגוון הרחב של בעלי חיים מהונדסים זמינים, המאפשרים במחקר במבחנה של נוקאאוט הגן ודפיקה ב, תוך הימנעות בעיות אחרות כגון יעילות transfection. באופן לא מפתיע, רביםטכניקות כבר פורסם מפרטות כיצד לבודד סוגי תאים מסוימים ^4,5. באופן כללי, טכניקות אלה כרוכים באיסוף באזור של עניין, dissociating תאים, תיוג סוג התא המסוים של עניין, ומבודד את התאים הללו לניתוח נוסף.

ללמוד אוכלוסייה עוברית מוקדמת של תאי האנדותל הכליליים, אנו scaled למטה ⁴ טכניקה שפורסמו בעבר לשימוש עם איבר קטן יותר. עם הליך מוקטן זה, אנו יכולים לבודד את תאי האנדותל הכליליים מהלב העוברי בשלבים עובריים ספציפיים. תאים אלה לאחר מכן ניתן להשתמש במבחני אנדותל מסורתיים, כגון ניתוחי הגירה. עד שורות תאים עובריים מוקדמות הפכו נפוצות יותר, עבודה עם התאים הראשוניים היא טכניקה לא יסולא בפז.

פרוטוקול

1. הכן את חרוזים נוגדנים מצומדות

1. יום אחד לפני לנתיחה, לשלב את הנוגדן של בחירה עם Dynabeads המתאים (כגון חולדת Dynabeads IgG לנוגדנים גדלו בחולדה, 4 x 10 ⁸ חרוזים / מ"ל) להוראות היצרן. לנוגדן אנטי CD31 חולדת BD (0.5 מיקרוגרם / μl, המשמש לבודד תאי אנדותל), 3 נוגדן μl מתווסף לכל 25 חרוזים μl, לריכוז סופי של 1.5 מיקרוגרם נוגדן אנטי-CD31 ו1 x 10 ⁷ / חרוזים 25 חיץ μl.
2. דגירה חרוזים ונוגדני לילה בשעה 4 ° C.

2. הכנת פלייט קולגן

1. תאים מבודדים יוצרים צינוריות במהירות רבות יותר כאשר גדלו על ג'ל קולגן בניגוד לסתם צלחת קולגן מצופה. לכן, ג'ל קולגן נעשים בלילה שלפני הניתוח, כפי שתואר ^ב6. על קרח במכסת מנוע בתרבית רקמה, לשלב את ריאגנטים הבאים (מספיק 19 בארות): 206.4 H סטרילי μl <תת> 2 O, 140.4 סוג קולגן μl אני (4.08 מ"ג / מ"ל), 38.4 M199 10x μl, ו1.15 μl 5 M NaOH.
2. פיפטה μl 20 של ג'ל קולגן זה לתוך הבארות של צלחת תרבית רקמת 384 גם. מניחים את הצלחת 37 ° C תרבות רקמות חממה למשך 30 דקות.
3. הוסף 80 DMEM μl לכל היטב דגירה במשך 15 דקות ב 37 ° C. הסר את התרבות בינונית ולחזור פעמיים נוספות.
4. לאחר השטיפה הסופית, להוסיף 80% 10 μl FBS / DMEM זה היטב דגירה הלילה בשעה 37 ° C. הסר את התרבות בינונית לפני הוספת התאים הבודדים.

3. בלו ולעכל לב

1. להרדים את העכבר מתוזמן בהריון ביום העוברי הרצוי באמצעות טכניקת המתת חסד מאושרת. כל הניסויים אושרו על ידי הטיפול בבעלי החיים המוסדיים ועדת שימוש באוניברסיטת צפון קרוליינה בצ'אפל היל.
2. עם העכבר במצב שכיבה, בנדיבות לרסס את צד הגחון של הנקבה עם אתנול 70% לפנינתיחה. בעזרת מלקחיים כדי להרים את עור הבטן התחתון ושריר מהאיברים הפנימיים, לחתוך לפתוח חלל הבטן התחתונה של הנקבה כדי להמחיש את האיברים הפנימיים.
3. מחזיק את צוואר הרחם עם מלקחיים, לחתוך בזהירות הזנב למלקחיים ולהתחיל להרים את קרן הרחם מחלל הבטן. תוך הרמת קרן הרחם, חתך את כל רקמת חיבור שמחזיקה את הקרן במקום. כדי לסיים מוציא את קרן הרחם, חתך את הצומת של קרן הרחם עם oviduct לשחרר את קרן הרחם.
4. הנח את קרן הרחם בצלחת פטרי שמכילה תמיסת מלח קר 1x פוספט שנאגרו (PBS) ולשטוף במידת הצורך. גזור לפתוח קרן הרחם דרך קו האמצע לחשוף את שקי העובריים המצורפים.
5. גזור לפתוח השק עוברי בצומת של השליה ואת העובר, כדי למנוע טעות חיתוך העובר ולאחזר עובר. הנח את העובר בצלחת פטרי שנייה עם PBS הקר. להחזיר את צלחת פטרי עם קרן הרחם לקרח.
6. Decapitate העובר כדי לשפר את הגישה לקיר החזה. אם genotyping הוא צורך, לחתוך את הזנב כדי להסיר אותו ולשמור בצינור Eppendorf מונח על קרח.
7. עם העובר על הגב שלה, לחתוך לפתוח את דופן בית החזה כדי להמחיש את הלב וריאות. כדי להימנע מחיתוך הלב, לעשות חתך אנכי בצד של כלוב הצלעות, ליד forelimb, ואחריו חתך אופקי לרוחב החלק התחתון של הצלעות, ולאחר מכן משוך בעדינות את בית החזה ואת הדרך. דרך כ יום עוברי 13.5, קיר החזה הוא שקוף, בסיוע בהדמיה.
8. רם בזהירות את הלב באמצעות מלקחיים ולחתוך את כלי בהמשך. לאחר מכן, לחתוך מעל כלי הגדול כדי לשחרר את הלב. אם כלי ריאתי לא נחתכים, הריאות ניתן להסיר עם הלב. לפיכך, להסיר רקמות זרות, כמו הריאות, במידת צורך.
9. להפריד ולהשליך את כלי הפרוזדורים וגדולים מהחדרים. בעזרת מספריים, ברר את החדרים לחתיכות קטנות (כ 1 מ"מ ^{3 <}/ Sup>) ומקום בכ -500 collagenase μl (1 מ"ג / מ"ל ​​בPBS סטרילי). שמור דגימות על קרח עד שכל חדרי לב טחון והניח בcollagenase.
10. חזרו על השלבים הקודמים עד שכבר נכרת מכל העוברים את החדרים, איסוף כל לב בצינור Eppendorf נפרד. אם יש לי כל העוברים באותו גנוטיפ, לב עשוי להיות נקווה בצינור Eppendorf אחת. מספר הדגימות שעובדו בכל פעם אחת עלול להיות מוגבל המבוסס על המגנט משמש לבידוד; DynaMag (123-21D) משמש כאן מחזיק מקסימום של 16 צינורות Eppendorf.
11. מקם את החדרים הטחונים ב 37 ° C עם הנדנדה למשך 45 דקות. בכל 15 דקות, להסיר בעדינות את הדגימות ו פיפטה מעלה ומטה כדי לנתק מכאני את התאים.

4. בידוד תאי האנדותל

1. לעבור את פתרון חדר-collagenase דרך 70 מיקרומטר סינון כדי להסיר גושים הנותרים של תאים.
2. צנטריפוגה התאים ב XG 400 במשך 10 דקות. להשליךsupernatant, להחליף עם כ 200 FBS 10% μl בDMEM, ופיפטה מעלה ומטה כדי לנתק את התאים.
3. חזור על השלב הקודם ועונה אחת. צנטריפוגה התאים ב XG 400 במשך 10 דקות אחרי השני 10% לשטוף FBS / DMEM. Resuspend התאים 50 FBS 10% / DMEM μl.
4. במהלך השלב הסופי צנטריפוגה, להכין את החרוזים.
   1. מניחים את צינור Eppendorf המכיל נוגדנים וחרוזים על מגנט דקות 1.
   2. עם הצינור במקום על המגנט, להסיר את supernatant. הסר את הצינור מהמגנט ולהוסיף כ 100 FBS 10% / DMEM μl.
   3. מניחים את הצינור על מגנט דקות 1. הסר את supernatant, ולשטוף שוב עם FBS 10% / DMEM. חזור על פעולה עבור סכום כולל של 3 שוטף.
   4. לאחר לשטוף הסופי, resuspend את חרוזי נוגדנים מצומדות בFBS 10% / DMEM (5 μl לדגימה).
5. לכל דגימה של תאים, מוסיף 5 μl של חרוזי נוגדנים מצומדות. מניחים את השעיות חרוז הסלולריים על 4 מעלות צלזיוס עם נדנדה עבורדקות R 30.
6. במכסת מנוע זרימה למינרית, למקם את צינורות Eppendorf המכילים תאים וחרוזים נוגדנים מצומדות על מגנט דקות 1. הסר את supernatant, הסר את הצינורות מהמגנט, ולשטוף עם FBS כ 100 μl 10% / DMEM. חזור על פעולה עבור 5 שוטף.
7. לאחר השטיפה האחרונה, מניח את הצינורות על מגנט דקות 1, להסיר את supernatant, והסר את הצינורות מהמגנט. הוסף כ 100 DMEM μl.
8. מניחים את הצינורות על מגנט דקות 1, להסיר את supernatant, והסר את הצינורות מהמגנט. הוסף 100-200 μl prewarmed 0.25% טריפסין-EDTA. דגירה הדגימות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO ₂ למשך 5 דקות.
9. מניחים את הצינורות על המגנט במשך 2 דקות. להעביר את supernatant המכיל תא בזהירות לצינורות Eppendorf טריים. צנטריפוגה במשך 5 דקות ב 400 x גרם.
10. הסר את supernatant. Resuspend התאים בינוני 80-100 μl צמיחה וצלחת ב96 - או 384 היטב צלחת תרבות מטופלים, בהתאם לתשואה הצפויה(כ 450-600 תאים מהחדרים של E14.5-E16.5 עוברים). לתאי אנדותל, השתמש במדיום תרבות צמיחת אנדותל (מוגדר להלן).

תוצאות

באמצעות נוגדן ספציפי לאנדותל שמכיר CD31, תאי האנדותל בודדו מהחדרים של (E) 13.5 (איור 1 א) ו 18.5 (איורים 1 ב-1D) עוברים עובריים. כאשר גדלו על צלחת תרבות מטופל, התאים אלה יישארו מעוגלים והיינו ליצור דפוס מרוצף אם מחוברות קרובים (איור 1 א). קולגן לדלל שימש גם למעייל הבארות, ואילו תאי אנדותל ידבק אליו (איור 1), הם יוצרים פחות מאשר כאשר שרשרות מצופים בג'ל קולגן (1C 1D ואיורים). תאי האנדותל גדלו הב...

דיון

עבודה עם תאים עובריים ראשוניים מאפשרת ניסויים חדשניים לטיפול בשלבים קריטיים של פיתוח במבחנה. עם זאת, הליך הבידוד הוא לא טריוויאלי. שלבים קריטיים לבידוד כל סוג של תאים כוללים הבטחה כי התאים מופרדים היטב על עיכול collagenase ולאחר מכן שהם הושעו גם במהלך השלבים לשטוף. נתיחה מכאנית על ידי pipetting מאוד עוזרת להפריד את התאים במהלך שלב collagenase, וצעד הסינון מסיר גושים של תאים. צעדים אלה ישפרו את הטוהר האוכלוסייה ואת התשואה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
<חזק>ריאגנטים
		חזקים>בהריון מתוזמן	לניתוח בשלב העניין העוברי
נגד עכבר CD31	BD Bioscience	553370
עכברוש IgG Dynabeads	Invitrogen	110-35
קולגן	BD Bioscience	354236
PBS (1x)
קולגנאז, סוג I	Worthington Biochemical	LS004196
DMEM	Cellgro
FBS	Sigma-Aldrich	F2442
מדיום גידול תאי אנדותל	(מיוצר במעבדה כמתואר בהערות)		DMEM המכיל 20% FBS, 5 μ M β-mercapt– תנול, 50 ומו; גרם/מ"ל א.ק.ג, ו-1x פניצילין/סטרפטומיצין
β-mercapt– תנול	סיגמא-אולדריץ'	M6250
א.ק.ג'י	טכנולוגיות ביו-רפואיות, בע"מ	BT-203
פניצילין-סטרפטומיצין	Gibco	15140
Trypsin-EDTA	Gibco	25300
צלחת תרבית 384 בארות	Greiner	T-3037-6	Plate הוכן עם ג'ל קולגן דק, כמתואר ב6; שטח פנים עבודה 10 מ"מ2קולגן
סוג I	BD		354236 לשימוש סופי ריכוז של 1.5 מ"ג/מ"ל
M199, 10x	Invitrogen	11825-015
Syto-16	Invitrogen	S7578	בשימוש לפי ההוראות ב-13
<חזק>ציוד
סטריאוסקופי	חזק Nikon	SMZ645
חממת תרבית תאים	Thermo	3110
DynaMag	Invitrogen	123-21D
צנטריפוגה שולחנית	תרמו	75002430