תרבית תאים העיקרית היא טכניקה שימושית לניתוח אוכלוסיות מסוימות של תאים, במיוחד מעוברי עכבר מהונדסים בשלבי התפתחות ספציפיים. בזאת, חדרי לב עובריים הם גזורים וניתקו, וחרוזים נוגדנים מצומדות לזהות ולהפריד את תאי האנדותל לניתוח נוסף.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
במאמר זה
סיכום
תקציר
תרבית תאים שיפרה באופן משמעותי את היכולת שלנו להעריך אוכלוסיות בודדות של תאים בתנאי התרבות עצום. בעוד שורות תאים הנציחו מציעות יתרונות משמעותיים לנוחות השימוש שלהם, שורות תאים אלה אינן זמינות לכל סוגי התאים הפוטנציאליים. על ידי בידוד תאים ראשוניים מאזור מסוים של עניין, במיוחד מעכבר מהונדס, ניתן לבצע מחקרים מורכבים יותר. הטכניקה הבסיסית כרוכה לנתח איבר או איברים חלקיים של עניין (למשל לב או באזור מסוים של הלב) וdissociating האיברים לתאים בודדים. תאים אלה מודגרת מכן עם חרוזים מגנטיים מצומדות לנוגדן שמזהה את סוג התא של עניין. התאים של עניין אז יכולים להיות מבודדים עם השימוש במגנט, עם דגירה קצרה טריפסין dissociating תאים מאת החרוזים. אז יכולים להיות מתורבתים תאים מבודדים אלה וניתח המועדפים. טכניקה זו תוכננה במקור עבור איבר עכבר בוגראבל ים וניתן לשנות בקלות את לשימוש עם איברים עובריים, כפי שמודגם במסמך זה. כי האינטרס שלנו הוא בכלי הדם כליליים פיתוח, אנחנו רוצים ללמוד אוכלוסייה של תאים זה בשלבים עובריים ספציפיים. לפיכך, פרוטוקול המקורי היה צריך להיות שונה כדי להיות תואם עם הגודל הקטן של החדרים העובריים והתשואה הפוטנציאלית הנמוכה של תאי האנדותל בשלבי התפתחותיים אלה. ניצול גישה מוקטנת זה, יש לנו להעריך שיפוץ מקלעת כלילית בתאי אנדותל חדריות עובריים מהונדסים.
מבוא
כניסתו של שורות תאים הנציחו יש מהפכה ביולוגיה של תא בסיסית 1. שורות התאים הקיימים כיום נגזרות ממגוון רחב של איברים ולהקיף את כל סוגי התאים העיקריים. עם זאת, יש לי שורות תאים הוקמו כמה מגבלות. תהליך ההנצחה ברור שמשנה את אופן הפעולה של התאים, במיוחד ביחס לתוחלת חיים והתפשטות, אלא גם יכול להשפיע על הביטוי של חלבונים בלתי צפויים, כגון חלבוני cytoskeletal 2. בנוסף, למרות ששורות תאים רבות ושונות זמינות, יש גיוון משמעותי בקרב אפילו סוג תא בודד בתוך כל אורגניזם. תאי אנדותל בהתנהגויות מגוונות מופע מסוימות המבוססים על אם הם קו עורקים או ורידים ואיזה סוג של זרימה הוא הווה בכלי 3. ועוד יותר דחוף מבחינה התפת....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. הכן את חרוזים נוגדנים מצומדות
- יום אחד לפני לנתיחה, לשלב את הנוגדן של בחירה עם Dynabeads המתאים (כגון חולדת Dynabeads IgG לנוגדנים גדלו בחולדה, 4 x 10 8 חרוזים / מ"ל) להוראות היצרן. לנוגדן אנטי CD31 חולדת BD (0.5 מיקרוגרם / μl, המשמש לבודד תאי אנדותל), 3 נוגדן μl מתווסף לכל 25 חרוזים μl, לריכוז סופי של 1.5 מיקרוגרם נוגדן אנטי-CD31 ו1 x 10 7 / חרוזים 25 חיץ μl.
- דגירה חרוזים ונוגדני לילה בשעה 4 ° C.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
באמצעות נוגדן ספציפי לאנדותל שמכיר CD31, תאי האנדותל בודדו מהחדרים של (E) 13.5 (איור 1 א) ו 18.5 (איורים 1 ב-1D) עוברים עובריים. כאשר גדלו על צלחת תרבות מטופל, התאים אלה יישארו מעוגלים והיינו ליצור דפוס מרוצף אם מחוברות קרובים (איור 1 א). קולגן לדלל שימש גם למעייל הבארות, ואילו תאי אנדותל ידבק אליו (איור 1), הם יוצרים פחות מאשר כאשר שרשרות מצופים בג'ל קולגן (1C 1D ואיורים). תאי האנדותל גדלו הב.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
עבודה עם תאים עובריים ראשוניים מאפשרת ניסויים חדשניים לטיפול בשלבים קריטיים של פיתוח במבחנה. עם זאת, הליך הבידוד הוא לא טריוויאלי. שלבים קריטיים לבידוד כל סוג של תאים כוללים הבטחה כי התאים מופרדים היטב על עיכול collagenase ולאחר מכן שהם הושעו גם במהלך השלבים לשטוף. נתיחה מכאנית על ידי pipetting מאוד עוזרת להפריד את התאים במהלך שלב collagenase, וצעד הסינון מסיר גושים של תאים. צעדים אלה ישפרו את הטוהר האוכלוסייה ואת התשואה.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.
תודות
ברצוננו להודות לאנדראה Portbury לקריאה ביקורתית של כתב היד, מעבדת השירות של מיקרוסקופ UNC לקבלת סיוע בזמן לשגות ההדמיה, ו-NIH (מענק # R01HL061656) לתמיכה במימון.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| <חזק>ריאגנטים | |||
| חזקים>בהריון מתוזמן | לניתוח בשלב העניין העוברי | ||
| נגד עכבר CD31 | BD Bioscience | 553370 | |
| עכברוש IgG Dynabeads | Invitrogen | 110-35 | |
| קולגן | BD Bioscience | 354236 | |
| PBS (1x) | |||
| קולגנאז, סוג I | Worthington Biochemical | LS004196 | |
| DMEM | Cellgro | ||
| FBS | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| מדיום גידול תאי אנדותל | (מיוצר במעבדה כמתואר בהערות) | DMEM המכיל 20% FBS, 5 μ M β-mercapt– תנול, 50 ומו; גרם/מ"ל א.ק.ג, ו-1x פניצילין/סטרפטומיצין | |
| β-mercapt– תנול | סיגמא-אולדריץ' | M6250 | |
| א.ק.ג'י | טכנולוגיות ביו-רפואיות, בע"מ | BT-203 | |
| פניצילין-סטרפטומיצין | Gibco | 15140 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25300 | |
| צלחת תרבית 384 בארות | Greiner | T-3037-6 | Plate הוכן עם ג'ל קולגן דק, כמתואר ב6; שטח פנים עבודה 10 מ"מ2קולגן |
| סוג I | BD | 354236 לשימוש סופי ריכוז של 1.5 מ"ג/מ"ל | |
| M199, 10x | Invitrogen | 11825-015 | |
| Syto-16 | Invitrogen | S7578 | בשימוש לפי ההוראות ב-13 |
| <חזק>ציוד | |||
| סטריאוסקופי | חזק Nikon | SMZ645 | |
| חממת תרבית תאים | Thermo | 3110 | |
| DynaMag | Invitrogen | 123-21D | |
| צנטריפוגה שולחנית | תרמו | 75002430 |
מקורות
- Landecker, H. Culturing Life: How Cells Became Technologies. , Presidents and Fellows of Harvard College. (2007).
- Kan, C. Y., Wen, V. W., et al. Endothelial cell dysfunction and cytoskeletal changes associated with repression of p16(INK4a) during immortalization.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
