מאמר שיטה

כמותי Assay לחקר חלבון: אינטראקציות-DNA, רגולטורים גלו תעתיק של ביטוי גנים, ולזהות חומרים אנטי סרטניים רומן

DOI:

10.3791/50512

⸱

31 באוגוסט 2013

 ,  ,  ,  ,  , 
1Greenebaum Cancer Center, University of Maryland School of Medicine, 2Program in Molecular Medicine, University of Maryland School of Medicine, 3Department of Biochemistry & Molecular Biology, University of Maryland School of Medicine, 4Department of Pharmacology & Experimental Therapeutics, University of Maryland School of Medicine, 5Department of Pathology and Biochemistry & Molecular Biology, University of Maryland School of Medicine

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פיתחנו assay כמותיים-DNA מחייבת, המבוסס על ELISA למדוד אינטראקציות עם גורם שעתוק ה-DNA. סגוליות גבוהה לחלבון Runx2 הושג עם oligonucleotide DNA לזיהוי קונסנסוס ונוגדנים חד שבטיים ספציפיים. איתור Colorimetric עם תגובת מצע נוגדנים בשילוב אנזים היה פיקוח בזמן אמת.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מבחני ה-DNA מחייבת רבים כגון מבחני משמרת ניידות electrophoretic (EMSA), מבחני chemiluminescent, immunoprecipitation הכרומטין (שבב) המבוסס על מבחני, ומבחנים מבוססי multiwell משמשים למדידת פעילות גורם שעתוק. עם זאת, מבחני אלה הם nonquantitative, חסרי ייחוד, עשוי להיות כרוכים בשימוש בoligonucleotides רדיואקטיבי, ולא יכולים להיות ישים להקרנה של מעכבים של ה-DNA המחייבים. מצד השני, באמצעות assay כמותיים-DNA מחייבת צמוד אנזים immunosorbent (D-ELISA) assay, אנחנו מדגימים אינטראקציות חלבון גרעיניות עם ה-DNA באמצעות גורם שעתוק Runx2 שתלוי בקשר ספציפי עם רצפי ה-DNA מחייבת קונסנסוס נוכחי ביוטין oligonucleotides שכותרתו. הכנת תאים, מיצוי של חלבון גרעיני, ועיצוב של oligonucleotides גדילים הכפולה מתוארים. צלחות 96 היטב מצופה Avidin קבועות עם חיץ אלקליין וטופחו עם חלבונים גרעיניים במאגר נוקלאוטיד חסימה. Follבשל שטיפה נרחבת של הצלחות, נוגדן ראשוני ספציפי וincubations נוגדנים משני ואחריו התוספת של מצע חזרת peroxidase ופיתוח של תגובת colorimetric. מצב תגובת עצירה או ניטור רציף הקינטית שימש למדידת אינטראקציה חלבון עם DNA כמותית. אנחנו דנים בבקרות ספציפיות מתאימות, כוללים טיפול עם IgG אינו ספציפי או בלי חלבון או נוגדן ראשוני. יישומים של assay מתוארים כוללים השירות שלה בהקרנת סמים ותוצאות חיוביות ושליליות נציג הם דנו.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

יש מבחני ה-DNA מחייבת שירות במדידת היכולת של גורמי שעתוק כדי לקיים אינטראקציה עם ה-DNA. מבחני עבור ה-DNA מחייבים לכלול מבחני electrophoretic משמרת ניידות (EMSA) שתלויים בoligonucleotides radiolabeled 1 או מבחני chemiluminescence 2. מבחני מבוססים immuneprecipitation הכרומטין (שבב) 3, כמו גם מבחני העסקת פורמטי 96 היטב 4 גם תוארו. עם זאת, EMSA הוא assay שאינו כמותיים הדורש את השימוש של oligonucleotides רדיואקטיבי. כאשר חלבונים גרעיניים לקשר עם רצפי אמרגן נוקלאוטיד הספציפיים, מתחמי מחייבים הם מפגרים בג'לים polyacrylamide וגורמים שעתוק הספציפי יכול להיות מאומת עם "supershift" נוגדן. פי....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כמה צעדים מבוצעים מבעוד מועד וכמה חומרים כימיים מוכנים ומאוחסנים לפני ההליך: (1) בידוד תרבית תאים וחלבונים, (2) הכנת oligonucleotide, (3) הכנת צלחות 96 היטב, (4) תמצית גרעינית לילה דגירה. הליך דורש 2 ימים בגלל הדגירה הלילה של חלבון גרעיני עם oligonucleotides ה-DNA.

1. הכנת חוצצים

1.1 בידוד חלבון גרעיני

  1. Hypotonic הצפת: כדי להכין של חיץ hypotonic 100 מיליליטר, להוסיף 1 מיליליטר (1 M HEPES, pH 7.9), 150 μl (1....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שיטת D-ELISA היא מאוד ספציפית לחלבון קושר DNA המיועד עוד, oligonucleotide פעמיים תקוע רצף ספציפי המכיל שלושה עותקים של אתר קישור Runx2 הקונצנזוס (ACACCA) משמש. הנוגדן הראשוני הכרה בגורם החלבון גם משפר את הספציפיות. הנוגדנים משני מכילים peroxidase חזרת קוולנטית צמודה (HRP) שממיר מצע ברור (tetramethyl benzidine) למוצר בצבע, כדי להקל על זיהוי (איור 1). מסיבות אלה, מספר פקדי רקע חשובים צריכים להיות כלולים בכל צלחת assay כדי להבטיח DNA הספציפי מחייב. אלה כוללים מדידת מ.......

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מבחני ה-DNA מחייב משמשים למדידת היכולת של גורמי שעתוק כדי לקיים אינטראקציה עם ה-DNA. מבחני עבור ה-DNA מחייבים כוללים משמרת electrophoretic ניידות (EMSA) 1 וimmuneprecipitation הכרומטין (שבב) מבוסס מבחני 3, כמו גם מבחני העסקת פורמטי 96 היטב 4 כגון מבחני chemiluminescent 2. EMSA הוא שאינם כמותיים ומשתמש oligonucleotides radiolabeled (32 P). אלה הודגרו עם חלבונים גרעיניים ומתחמים מחייבים מופרדים על ג'ל agarose או polyacrylami.......

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

יש לנו מה למסור.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

סיוע טכני והמכשור של מתקן Greenebaum המרכז לחקר סרטן Translational Core אוניברסיטת מרילנד, במיוחד בני הזוג. רינה לפידוס וMariola Sadowska, הם הכירו בהכרת תודה. העבודה אחראית לפיתוח של assay זה מומנה בחלקו על ידי NIH RO1CA108846, AHA GRNT2130014 גרנט-in-Aid, פרס הצטיינות VA לסוכנות הידיעות AP, ועל ידי האוניברסיטה של ​​כספי פיצויי סיגריות מרילנד (CRF) הניתן למרלן וסטיוארט מרכז לחקר סרטן Greenebaum.

....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
Poly dI/dCGE Healthcare, פיסקאטאווי, ניו ג'רזיUS20539-5UN1 U ~ 50 מ"ג
נוגדן RUNX2MBL International Corp., Woburn, MAD130-31 מ"ג/מ"ל
נוגדן מצומד פרוקסידאז ספציפי ל-FabSigma-Aldrich, סנט לואיס, MOA99177.1 מ"ג/מ"ל
מצע TMB (טטרמתיל בנזידין)EXALPHA Biologicals, Shirley, MAX1189S100 מ"ל
נתרן פחמתיSigma-Aldrich, סנט לואיס, MO57995
חומצה גופרתיתVWR, ווסט צ'סטר, PABDH-39922-1תמיסת עצירה
צלחות מרובות בארותGreiner Bio-One, באזל, שוויץ655996ציפוי אבידין, צדדים שחורים
HALTThermo-Scientific/Pierce, Rockford, IL78440מעכבי פרוטאז ופוספטאז
כימיקליםיצרנים שוניםכיתה
<חזק>טבלה 1. ריאגנטים
ספקטרופוטומטר: Biotrak II קורא לוחות גלוייםAmersham Biosciencesלשימוש בשיטת תגובת עצירה
ספקטרופוטומטר: Bio-Tek Synergy HT קורא מיקרו-פלטות רב-תגובותBio-Tek Instruments, Inc.לשימוש עם ניטור קינטי רציף
טבלה 2. ציוד
מקבעת צלחת מעבדה

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hellman, L. M., Fried, M. G. Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions. Nat. Protoc. 2, 1849-1861 (2007).
  2. Bhattacharya, N., Sarno, A., Idler, I. S., et al.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

DNA Binding AssayQuantitative ELISANuclear Protein ExtractionBiotinylated OligonucleotidesStreptavidin Coated PlatesHorseradish Peroxidase DetectionSpectrophotometric Analysis

מאמרים קשורים