ויזואליזציה של Craniofacial פיתוח בsox10: קאאד מהונדס דג הזברה הקו באמצעות זמן לשגות מיקרוסקופיה confocal

סיכום

ויזואליזציה של נתונים ניסיוניים הפכה מרכיב מרכזי בהצגת תוצאות לקהילה המדעית. דור של הקלטת הזמן לשגות חי של עוברים גובר תורם למצגת טובה יותר והבנה של תהליכים התפתחותיים מורכבים. פרוטוקול זה הוא מדריך צעד אחר צעד לתיוג תא באמצעות photoconversion חלבון קאאד של דג הזברה.

תקציר

palatogenesis חוליות הוא תהליך התפתחותי כוריאוגרפיה והמורכב ביותר, הכולל הגירה של רכס עצבי גולגולתי (CNC) תאים, התכנסות והרחבה של בליטות פנים, והתבגרות של שלד craniofacial. כדי ללמוד את התרומה של הרכס העצבי הגולגולת לאזורים ספציפיים של חיך דג הזברה sox10: קו דג הזברה מהונדס קאאד נוצר. Sox10 מספק הגבלת שושלת של חלבון כתב קאאד לרכס העצבי, ובכך הופך את תא תיוג תהליך מדויק יותר מאשר צבע מסורתי או הזרקת mRNA כתב. קאאד הוא חלבון תמונה הניתנת להמרה שהופך מירוק לאדום לאחר הפעלת תמונה ומאפשר לעקוב אחר תאים בדיוק. Sox10: הקו מהונדס קאאד שימש לביצוע ניתוח שושלת להתוות אוכלוסיות תאי CNC כי להצמיח לסת מול לסת תחתון, אלמנטים ולהמחיש הומולוגיה של בליטות פנים לamniotes. פרוטוקול זה מתאר את הצעדים כדי ליצור וידאו חי זמן לשגות של sox10: עובר דג הזברה קאאד. פיתוח של צלחת כברתי ישמש כדוגמא מעשית. פרוטוקול זה יכול להיות מיושם על ביצוע הקלטת confocal זמן לשגות של כל קאאד או חלבון כתב photoconvertible דומה בדג זברה מהונדס. יתר על כן, ניתן להשתמש בו כדי ללכוד את הפיתוח לא רק נורמלי, אלא גם לא תקין של מבני craniofacial במוטנטים דג הזברה.

מבוא

בתרי orofacial מייצג את עיוות craniofacial הנפוצה ביותר, עם 1/700-1, 000 משלוחים השפיעו ^1. שיבוש של התפתחות עוברית המוקדמת craniofacial יכול להוביל להיווצרות של שפה שסועה וחך (CL / P). בעוד סיבות לשסועות syndromic הוכחו במידה רבה, את הבסיסים הגנטיים ואפיגנטיים של צורות nonsyndromic של clefting orofacial עדיין צריכים להיחשף ^2-4. על מנת להבין את האטיולוגיה ופתוגנזה של מומים אלה, יש צורך להבהיר את התפתחות מבני craniofacial על בסיס סלולארי.

בכל מיני החולייתנים תאי גולגולת עצביים רכס (CNCC) להעביר מהצינור העצבי הגבי כדי לאכלס את קשתות בלוע, אשר יתרמו להיווצרות של מבני orofacial. שיבוש של התפתחות עוברית המוקדמת רכס עצבי יכול להוביל להיווצרות של מומים craniofacial כולל CL / P ^5-7.

במודעהdition לדמיון מבני בין דג הזברה ופיתוח craniofacial יונקים (CNCCs מתגורר באזורים הומולוגיים), רשת הרגולציה הגן זה שמור ביותר. כמו כן, הוכיח כי CNCCs לפתח באותו אופן בין מיני amniote ודג הזברה ^8, מה שהופך את דג הזברה אורגניזם רב עוצמה ללימוד בסיס ההתפתחותי והגנטי של CL / פ יש לו יתרונות רבים, לרבות גודל קטן, מהיר והתפתחות עוברית לשעבר ברחם, ושיעורי גידול גבוהים. יתר על כן, העובר הוא שקוף אופטי, מה שהופך אותו נוח לתצפית של אירועים התפתחותיים מורכבים מתחת למיקרוסקופ ^9. זהו מודל חיה אידיאלי לחקר נדידה וההתמיינות של תאי רכס עצביים גולגולתי.

הרחבת בעבר עבודה שפורסמה ^{8, 10, 11,} דפוס הנדידה של CNCC תואר בפירוט באמצעות sox10: המודל המהונדס קאאד ^5. קאאד הוא חלבון תמונה הניתנת להמרה שtuאחיות מוסמכות מירוקים לאדום לאחר הפעלת תמונה ומאפשרת לעקוב אחר CNCCs בדיוק. במהלך השינוי הזה את עמוד השדרה פפטיד הוא ביקע, טוען כי ההמרה היא יציבה, כלומר, יכולים להיות במעקב התאים ליעדן הסופי ^12. קווים מהונדסים שכותרתו עם קאאד תחת שליטת תעתיק של sox10 הראו כי חיך amniote וצלחת כברתי של דג הזברה נוצרים homologously על ידי שילוב של בליטות הבילטראליים לסת (MXP) עם בולטות frontonasal (FNP) ושתפר היתוך Y בצורת משול בין מינים.

בין יישומים אחרים, sox10: מודל דג הזברה מהונדס קאאד היה לשמש ליצירת קטעי וידאו של עוברי דג הזברה בשלבי התפתחותיים שונים כדי להראות היווצרות של מבני craniofacial נורמלים ולא נורמליים. Photoconversion של קבוצות ספציפיות של תאים מאפשרת לעקוב אחר התפתחותם. בשיטה זו גישה ליצור הדמיה חיה של פיתוח craniofacמבני ial בדג הזברה הוא הציג, מה שהופך את זה קל מבחינה ויזואלית להדגים תהליך התפתחותי מורכב זה.

פרוטוקול זה מיועד לשיתוף החוויה של יצירת סרטונים אלה באמצעות ההתפתחות התקינה של צלחת כברתי בsox10: דג הזברה מהונדס קאאד לדוגמא ירושלים. פרוטוקול זה עוד יכול להיות מיושם על ביצוע קטעי וידאו הזמן לשגות של כל מבנה שמקורם בתאי רכס עצביים גולגולתי בדג זברה.

פרוטוקול

1. אוסף עובר לphotoconversion

1. להגדיר לפחות עשרה זוגות של sox10: דג הזברה מהונדס קאאד בין 5 ל 6:00 בערב.
2. למחרת בבוקר, למשוך את החוצצים ולאסוף ביצים בסביבות הצהריים. להעביר אותם לצלחות פטרי ולשים אותם לתוך 28.5 חממת מעלות צלזיוס.
3. בסביבות 24 הודעה שעה הפריה, לנקות את צלחות פטרי על ידי הסרת עוברים מתים. בדוק את שלב ההתפתחות של עוברים ¹³ באמצעות מיקרוסקופ שדה אור וכל מיקרוסקופ פלואורסצנטי עם חלבון פלואורסצנטי ירוק משופר מסנן (EGFP). קאאד יהיה גלוי דרך מסנן זה.
4. כאשר עוברים להגיע 60 העברת hpf חמישה עוברי ניאון בהירים לתוך צלחת פטרי נפרדת וdechorionate במידת צורך.

2. הרכבה של עובר לphotoconversion

1. הר את העובר באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי נורמלי. ההרכבה של עוברים על מיקרוסקופ confocal היא מאוד מאתגרת.
2. השתמש בדוכןמים ארד E3 או להכין E3 הטרי באמצעות המתכון הבא:
   להוסיף את הדברים הבאים לליטר אחד של DH מים מזוקקים ₂ O להוסיף את הדברים הבאים כדי להפוך את E3L 1x:
   0.292 גרם 5.0 מ"מ NaCl
   0.013 גרם 0.17mm KCl
   0.044 גרם 0.33mm CaCl ₂ (יבוש, 96%, מגיב ACS)
   0.081 גרם .33 מ"מ MgSO ₄ (anhydrated)
   אופציונאלי: להוסיף 200 μl של 0.05% מתילן כחול ל1X E3 כמו פטריות ומערבבים.
   בינוני שומר בטמפרטורת חדר למשך השבוע 1.
3. השתמש tricaine סטנדרטית או להכין tricaine באמצעות המתכון הבא:
   ל5 L של .0.2% tricaine לערבב את המרכיבים הבאים:
   45 מיליליטר טריס-Cl (1M pH9.5)
   5 LH ₂ O
   10 tricaine גרם
4. הכן את 'מיץ סרט' (50 מיליליטר E3, 0.015% פתרון tricaine), על ידי הוספת tricaine 3.75 מיליליטר 0.2% ל46.25 מיליליטר E3.
5. הכן את agarose על ידי ערבוב 46.25 מיליליטר מים E3 עם נקודת 46.35 מ"ג נמוך היתוך agarose (LMP) בבקבוק זכוכית 50 מ"ל ולפזר חלקיקים מוצקים על ידי במיקרוגל. לאחר מכן להוסיף3.73 tricaine 0.2% מיליליטר לagarose ולשים את בקבוק זכוכית עם agarose לתוך 50 ° C אמבט מים עד שימוש.

3. הכנה והרכבה של עובר

1. הרדימי עובר עם E3/0.015% פתרון tricaine עשה בשלב 1.1.2 ועובר העברה לתא שקופיות.
2. לספוג את כל עודפי E3 עם רקמת נייר ולשים agarose על עובר.
3. עובר עמדה מגבה בצורה מושלמת עם טיפים microloader. ודא שכל העובר אינו מרחף על גבי agarose, אבל לדחוף את הגוף כולו. ואז לשפוך E3/0.015% פתרון tricaine על עובר מוטבע agarose עד החדר מתמלא באופן מלא בנוזל.

4. התאמת הגדרות תוכנה על Confocal מיקרוסקופ

1. השתמש אובייקטיבי 20X אוויר immersible (צמצם מספרי 0.75; גודל חריר 20) למיקוד העובר. ואז ללחוץ על כפתור אור L100 על המיקרוסקופ ובחר ערוצים בתוכנה. controls/A1settings לפתוח את הסמלים להציג / רכישה וclick confocal התקנת הכפתור. הבא לחץ על 'אוטומטי' ובחר ערוצים הבאים לפני סגירת החלון שוב:
   CH1: ננומטר DAPI ערוץ 403.4 (ניתן להשתמש באורכי גל שבין 350-410 ננומטר)
   CH2: 488.0 ננומטר
   CH3: 561.9 ננומטר

5. Photoconversion

1. כבה את CH1 ו -3 ולהדליק CH2 לפני לחיצה על לחצן משתלבים הסרה וסריקה.
2. להתמקד בתאים של עניין לphotoconversion, שהוא הטוב ביותר שנעשה על ידי הפעלה עם מתח 1frame/sec וגבוה (HV) 200 ולאחר מכן עולה במסגרות / השנייה והוריד HV בהתאם עד שמגיע 1/32 מסגרות / sec וHV סביב 100-120, תלוי ברעש הרקע.
3. כאשר העובר הוא בפוקוס, נראה בקצה הימני של מסך, לתפוס את השפה הירוקה ולהפוך אותו קטן יותר, כך שהוא מתאים לאזור של עניין לphotoconversion קליק ימני עם העכבר. קטן יותר הוא טוב יותר, כי photoconversion היא בלתי הפיכה.
4. הפעל מסגרות / sec עד 1 וHV 200 ופגעלסרוק. תמונה מוגדלת באזור של photoconversion גלויה עכשיו.
5. תאי Photoconvert ידי הפעלת CH1 (403.4 ננומטר). לחשוף לליזר photoconverting כל מקום 5-60 שניות, תלוי בגודל של האזור עד קאאד הירוק כפי שניתן לראות דרך ערוץ ה-GFP הוא כמעט נעדר.
6. כאשר אות קאאד הירוקה היא כמעט נעדר, לכבות CH1. הפעל CH2 ו -3 ב. לאחר מכן, לחץ לחיצה ימנית על חלון בשדה אזור סריקת A1 ופגעתי 'חזרה לגודל מקורי' כדי לבדוק אם תאים רצויים היו photoconverted.

6. מה שהופך את Z-מחסנית

1. מצא את הסמל "Z-הסדרה ללכוד" בשורת התפריט והיכולת להציב גבולות העליונים ותחתונים של Z-מחסנית לפני שמתחילים אותו. הגדר LUTs.

7. תוכנת הגדרות זמן לשגות

1. עבור לתיבת A1Simple GUI וסמן את ההגדרות הבאות:
   1/32 מסגרות / sec
   גודל 1024
   ממוצע או 8X 4 תלוי במספר של Z-ערימות שיש לקחת בלולאה אחת
2. עבור אל:פקדי תצוגה / רכישה / רכישת רצף ND ומסגרת זמן שנקבע (8-v30), לחץ מתמשך ולחץ על Z-מחסנית. הגדר גבולות כפי שנבדק בעבר ולהתחיל סרט.
3. המשך להוסיף E3/0.015% קאמרי שקופיות פתרון tricaine לאורך כל היום. בלילה, למלא את האולם לחלוטין. שיימשך עד למחרת בבוקר.
4. למחרת בבוקר, למלא E3/0.015% פתרון tricaine ולבדוק אם עובר הוא עדיין בחיים. הפסד של הקרינה מצביע על מוות. המשך מילוי ובדיקות לאורך כל היום.
5. כאשר המבנה סיים להרכיב, או את העובר מת, לסיים את הסרט.

8. עיבוד פוסט פרודקשן

1. לחץ על 'הקרנת מופע מקסימום עוצמת' בסרגל כלים, ולאחר מכן לחץ לחיצה ימנית על התמונה וליצור מסמך חדש. הווידאו הוא נראה באיכות הטובה ביותר האפשרית עכשיו. ללכת על מנת להסיר מסגרות שאינם נחוצות ולהתאים LUTs. לבסוף לשמור כ. avi. פורמט זה יהיה בסדר עבור Windows. עבור לא תוכנה להורדת מקo להמיר. mov או. wmv.

תוצאות

בsox10: CNCCs קו מהונדס קאאד, נדידה והודעה נודדת שכותרתו fluorescently ירוקה. תאי CNCC שכותרתו עם קאאד פלואורסצנטי הירוק לסכם ביטוי mRNA sox10 אנדוגני ^5.

בין יישומים אחרים, מודל חיה זה שימש כדי להמחיש את הפיתוח של מבני craniofacial תלויים CNCC טוב יותר. התפתחות תקינה של מבנים ספציפיים וגם התפתחות פתולוגית של מומים Craniofacial, שפה שסועה וחך במיוחד כבר נתפסה. סדרה של קטעי וידאו זמן לשגות חי של דג הזברה...

דיון

הנה שיטה חדשה להדמיה של פיתוח craniofacial במודל דג הזברה מוצגת. Sox10: קו דג הזברה מהונדס קאאד כבר השתמש בהצלחה כדי לתאר את דפוס הנדידה של CNCC בפירוט משמש כאורגניזם מודל ^5.

מחקרים קודמים השתמשו בציוני דרך גולמית כגון העין למקד את התאים ויש לסמוך על הזרקת mRNA קאאד, מבחני photoconversion או dextran והעמסת בכלוב לphotoconversion ^{10, 11, 14, 15} סוקס:. יש 10 קאאד קו מהונדס יתרונות רבים בהשוואה...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
Sox10: kaede קו דג זברה טרנסגני	MGH		זמין דרך מעבדת Liao
צלחות פטרי 100x15 מ"מ	BD פלקון	351029
צלחות פטרי 35 מ"מ x 10 מ"מ	BD Falcon	351008
Ultrapure נקודת התכה נמוכה (LMP) Agarose	Invitrogen	15517022
Lab Tek 2 Chamber SlideSystem	LabTek	154453
Microloaders 200/pk	Fisher	E5242956003
Nikon A1R Si Confocal Ti series	Nikon	ללא מספר
NIS Elements Software AR3.2 64-bit	Nikon	ללא מספר