בידוד של hepatocytes האנושי על ידי שני שלבים Collagenase זלוף נוהל

סיכום

הליך זלוף collagenase שני שלבים שונה לבידוד של hepatocytes אדם מתואר. שיטה זו יכולה להיות מיושמת גם לכבדים של יונקים אחרים. Hepatocytes מבודד זמינים בתשואה גבוהה וכדאיות, מה שהופך אותם המודל מתאים למחקר מדעי בתחומים כגון התחדשות כבד, פרמקוקינטיקה וטוקסיקולוגיה.

תקציר

הכבד, איבר עם יכולת התחדשות יוצאת דופן, מבצע מגוון רחב של פונקציות, כגון סילוק רעלים, חילוף חומרים ועל הומאוסטזיס. ככזה, hepatocytes הוא מודל חשוב למגוון רחב של שאלות מחקר. בפרט, השימוש בhepatocytes האנושי הוא חשוב במיוחד בתחומי פרמקוקינטיקה, טוקסיקולוגיה, התחדשות כבד ומחקר translational. לכן, שיטה זו מציגה גרסה שונה של הליך זלוף collagenase שני שלבים לבודד hepatocytes כפי שתואר על ידי ¹ Seglen.

בעבר, hepatocytes היה מבודד בשיטות מכאניות. עם זאת, שיטות אנזימטיות הוכחו להיות מעולה כמו hepatocytes לשמור על השלמות המבנית שלהם ותפקוד לאחר בידוד. שיטה זו המוצגת כאן מתאים את עצמו בשיטה שנועדה בעבר לכבדי חולדה לחתיכות כבד אנושיות ותוצאות בתשואה גדולה של הפטוציטים עם כדאיות של 77 10% ±. העיקריהבדל בהליך זה הוא התהליך של cannulization של כלי הדם. יתר על כן, בשיטה שתוארה כאן יכולה להיות מיושמת גם לכבדים ממינים אחרים עם גדלים בכבד או בכלי דם דומים.

מבוא

השעיה תא כבד ניתן להכין מהכבד בשיטות מכאניות או אנזימטי. שיטות מכאניות המשמשות להכנת תאי כבד שלמים כוללות כפייה של כבד דרך הגזה ^2, רועד חתיכת כבד עם חרוזי זכוכית שייקרה קאהן ^3, באמצעות homogenizers זכוכית עם עלי רופף ^4,5 וכו 'במהלך השנים, שיטות מכאניות נפלו מתוך להעדיף בשל הנזק לקרומי תאים ואובדן התפקוד של הפטוציטים המבודדים ^6,7. כתוצאה מכך, השימוש בשיטה אנזימטית הוא כיום השיטה העיקרית לבידודה של הפטוציטים.

בידוד של hepatocytes באמצעות שיטה האנזימטית השתפר מאוד כאשר ברי והחבר ⁸ perfused collagenase וhyaluronidase דרך כבד דרך וריד הפורטל בחולדות. תהליך זה מנוצל זלוף כלי הדם כדי לאפשר לאנזימים לבוא במגע קרוב עם רוב של התאים, מה שמוביל לעלייה של פי 6 בתשואה של hepatocytes ^8. יתר על כן, שיטה זו הניבה תאים ששמרו על השלמות המבנית שלהם, עם כמעט ללא שינוי של reticulum endoplasmic לתוך שלפוחית ​​מבודדת ולא נגרם נזק המיטוכונדריה ^8.

שיטה זו שונה על ידי ¹ Seglen, שהיה חלוץ הליך זלוף שני שלבים לבידוד בתאים כבד. בהליך זה, בכבד חולדת perfused עם ^{2 +} חיץ חופשי Ca אחרי זלוף עם חיץ collagenase המכיל Ca ^{2 + 1.} ההסרה של Ca ^{2 +} בשלב הראשון מסייעת לשבש דסמוזומים, תוך התוספת של Ca ^{2 +} בשלב השני נדרשת לפעילות collagenase אופטימלית ^1,9.

בהתחשב בכך שהעבודה שפורסמה שתוארה לעיל בוצעה בחולדות, מאמר זה נועד להדגים הליך שונה שיכול לשמש לבידודה של הפטוציטים עם כדאיות גבוהה מזמזוםכבדים. השימוש בhepatocytes האנושי נשאר חשוב למחקר translational ולאימות ניסויים תוך שימוש במודלים של בעלי חיים. חתיכות הכבד האנושיות השתמשו במחקר זה נרכשו בהסכמה לממשל דרך הקרן לחקר רקמות ותאים אנושיים, קרן ללא כוונת רווח בשליטה ממשלתית ^10. לאחר הפתולוג הסיר את מה שנדרש לאבחון, חתיכות כבד נאספו מהרקמות שנותרו. הרקמה מחולק על ידי פתולוג הייתה מורפולוגית רקמה בריאה המתקבלת משולי כריתה לאחר כריתת כבד.

פרוטוקול

1. הכנה של פתרונות זלוף ובידוד

1. הכן את הפתרונות דרושים לטפטוף של חתיכת הכבד והבידוד של hepatocytes לפי טבלת 1. ניתן לאחסן את פתרונות על 4 מעלות צלזיוס עד לשימוש.
2. סינון סטרילי כל הפתרונות באמצעות מסנן 0.22 מיקרומטר.
3. כל הפתרונות שבאים במגע עם הכבד צריכים להיות סטרילי.

2. הכנת זלוף הציוד ופתרונות

1. הציוד לטפטוף של פיסת הכבד יש להגדיר כפי שמוצגים באיור 1.
2. אמבט המים צריך להיות מוגדר בטמפרטורה מתאימה, שהוא שונה בכל ניסיוני הגדרה מסוימת, כך שהפתרונים נמצאים בטמפרטורה של C ° 37 כאשר הם מגיעים לחתיכת הכבד. במקרה זה, אמבט המים מוגדר 41 מעלות צלזיוס כדי לחמם את הפתרונות 1, 2 ו -3 וקבל זכוכית במעיל. פתרון 4 יש לחמם עד37 מעלות צלזיוס באמבט מים נפרד לשימוש כדי להפחית את האובדן של פעילות collagenase.
3. זמן קצר לפני זלוף הכבד, להדליק את הרגולטור של מיכל הדלק המכיל 95% O _2/5% CO ₂ לגז מנגנון החמצון (איור 1E).

3. טפטוף של הכבד

1. יש לקבל חתיכת כבד עם כמה שיותר הקפסולה של Glisson שלמה ככל האפשר ואופן אידיאלי עם משטח רק 1 לחתוך מפתולוג לזלוף.
2. מניחים חתיכת הכבד הזה במשפך ביכנר המכיל מסנן דיסק מחורר (איור 1).
3. מערכת זלוף צריכה להיות דרוכה עם פתרון 1.
4. עם קצב זרימה נמוך, cannulae השקיה המעוגל עם טיפים זית צריך להיות מוכנס לתוך כלי דם גדולים יותר על פני השטח החתך של פיסת הכבד. הדם שוטף החוצה מן הכבד, הרקמות הופכת להיות קלות יותר באזורים עם זלוף טוב. מספר cannulae משמש לגדלים שוניםשל כבדים מוצג באיור 2 א. גודל מד נבחר צריך לגרום להתאמה הדוקה שתחזיק cannulae במקום. יש להשאיר כלי הדם הקטנים יותר פתוחים לחיץ זלוף לניקוז מחוץ לחתיכת הכבד.
5. להגדיל את קצב הזרימה במשאבת peristaltic לבין 110-460 מיליליטר / דקה בהתאם לגודל של הכבד (איור 2). התוצאה היא קצב זרימה של 44 ± 16 ממוצע מיליליטר / דקה לצינורית (איור 2 ג). המהירות שנבחרה תלויה בחתיכת הכבד וצריכה לגרום להתפחה עד קלה של חתיכת הכבד. במקרים מסוימים, ייתכן שיהיה צורך להדק את שהחלק מכלי השיט הפתוח עם מלחציים בכלי דם מיקרו על מנת להשיג את ההתפחה הקלה שהוזכר לעיל. זלוף טוב ניתן להבחין כאשר חתיכת הכבד היא צבע בהיר יותר לאורך כל דרך.
6. שמור על פיסה הלחה הכבד במהלך זלוף על ידי כיסוי אותו עם פיסת הגזה הספוגה בתמיסת מלח.
7. Perfuse עם 1 ליטר של פתרון 1 כדי לשטוף את כל remaining דם בחתיכת הכבד.
8. לשנות את נוזל זלוף לפתרון 2 וינקב עבור 10 דקות.
9. לעבור את נוזל זלוף לפתרון 3 וינקב עם 0.5 L.
10. לשנות את נוזל זלוף ל4 פתרון, אשר מכיל .1-0.15% מcollagenase (טבלה 2).
11. לצעד זה, זלוף צריך להתבצע באופן מחזוריות ל9-12 דקות או עד שהכבד מתעכל מספיק; רקמת הכבד אמורה להופיע להתפרק מעט מתחת הכמוסה של Glisson ולהרגיש התרכך כשמשש עם הצד הקהה של אזמל.

4. בידוד של hepatocytes

1. כבה את משאבת peristaltic ולהסיר cannulae מחתיכת הכבד.
2. מניחים את חתיכת הכבד בצלחת מתגבשת המכילה 100-200 מיליליטר של פתרון 5.
3. הסר את הקפסולה של Glisson בזהירות ובעדינות לנער את התאים. אם ישנם אזורים שאינם perfused היטב, אזמל יכול לשמש כדי לחתוךאזורים אלה כדי לשחרר את התאים בתוך. הוסף עוד פתרון 5 צורך כבמהלך התהליך.
4. הוסף עוד פתרון 5 עד לנפח סופי של 500 מיליליטר.
5. סנן השעיה תא פעמיים; ראשון דרך רשת 210 ניילון מיקרומטר ואחריו רשת ניילון 70 מיקרומטר. , הבא לשפוך את ההשעיה התא לתוך 200 צינורות צנטריפוגה מיליליטר.
6. צנטריפוגה ההשעיה התא ב72 גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C. לשאוב supernatant ותא גלולה בעדינות resuspend בעדינות ב200 מיליליטר של פתרון 5.
7. חזור על מספר שלב הכביסה 4.6 שלוש פעמים. על המדרגה צנטריפוגות הסופית, תאי resuspend בפתרון אחסון קר (ראו רשימה של חומרים). תאים צריכים להיות כ 2-5,000,000 hepatocytes למיליליטר להערכה של תשואה וכדאיות באמצעות assay הרחקת trypan הכחול מבוסס hemocytometer.
8. כדי לבצע את assay הרחקת trypan הכחול, להוסיף 0.1 מיליליטר של תאים בדילול כראוי (2-5,000,000 ≈ / מיליליטר) לצינור microfuge מכיל 0.5 מיליליטר של soluti trypan הכחולב( 0.4% trypan הכחולים מומס בפוספט שנאגרו מלוח (PBS)) ו0.4 מיליליטר של PBS. לאחר ערבוב ההשעיה התא ביסודיות, טען hemocytometer עם ההשעיה ולבחון תחת מיקרוסקופ בהגדלה 100X. תחת מיקרוסקופ, התאים המתים יהיו מוכתמים כחולים ואילו תאי החיים מופיעים בלא כתם. לספור את מספר תאי חיים ומוחלט בכל אחד ממ"מ ² הרשתות 1 מסומנת על hemocytometer. כדאיות (%), תשואה של תאי חיים (מיליון hepatocytes למיליליטר פתרון אחסון קר (CSS) או מיליון hepatocytes לכבד ז) יכולה להיות מחושבת באמצעות נוסחאות שלהלן.

הערה: במקרה זה, גורם לדילול trypan הכחול הוא 10 וגורם hemocytometer הוא 10,000.

תוצאות

התקנת זלוף

הציוד הדרוש לזלוף כבד יש להגדיר על פי איור 1.

כדאיות ותשואה של hepatocytes אדם מבודד

הכדאיות הממוצעת של hepatocytes אדם הבודד הייתה 77 ± 10% והתשואה הממוצעת של hepatocytes הייתה כבד 13 ± 11 מיליון hepatocytes / g, עם הערכים באו לידי ביטוי כאמצעי ± סטיית תק...

דיון

פרוטוקול זה גורם לבידוד של hepatocytes האנושי עם כדאיות גבוהה ובטהרה. על מנת להשיג את התוצאות הללו, חשוב להתחיל עם חתיכת הכבד מתאימה. חתיכת הכבד צריכה הכמוסה של Glisson שלמות על כל המשטחים, פרט למשטח לחתוך 1. גורם חשוב נוסף הוא אצווה המסוים של collagenase משמש, כפי שקבוצות שונות יכולות לגרום להבדלים ניכר בviabilities של hepatocytes לאחר עיכול ^11. לכן, קבוצות שונות של collagenase צריכים להיבדק ויש לקבל את המנה שמייצרת hepatocytes עם הכדאיות הטובה ביותר בכמויות גדולות. לב...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
מלכודת בועות	Gaß נר גלטכניק
מעבה מעטפת זכוכית	Gaß נר גלטכניק
41 & deg; אמבט מים C	Julabo	35723-H24/EG
37 מעלות; C אמבט מים	GFL	1083
בלון גז דחוס (95% O2/5% CO2)	Linde
צינורות חדירים לגז	Neolab	2-4440
משאבה פריסטלטית	Ismatec	IP65
נוצת	אזמל	320010
מלקחיים	אומנילאב	5171014
צלוחיות חרוטיות 1 ליטר	שוט דוראן	2121654
צלוחיות חרוטיות 5 ליטר	שוט דוראן	2121673
כוסות	שוט דוראן	2110654
צינורות צנטריפוגה 200 מ"ל	בקטון דיקינסון	352075
צלחת גיבוש	אומנילאב	5144063
צינורית השקיה מעוקלת עם קצות כדור	Ernst Kratz GmbH	1464LL / 1465LL A + B / 1472LL
מהדקי מיקרו וסקולריים	Ernst Kratz GmbH
Bü משפך chner	קארל רוט	HT38.1
רשת ניילון 210 μ מ	Neolab	4-1413
רשת ניילון 70 μ מ	Neolab	4-1419
0.22 μ מסננים סטריליים m	Peske	99505
בקבוקי 500 מ"ל	שוט דוראן	2180144
בקבוקי 1 ליטר	שוט דוראן	2180154
המוציטומטר	פסקה	06-0001
שפופרות 1.5 מ"ל	Eppendorf	0030 120,086
50 מ"ל שפופרות חרוטיות	BD Biosciences	352070
דלי קרח	Neolab	1508454
פיפטות פסטר סטריליות	מותג	747715
מילוי פיפטה ממונע (Pipette boy acu)	Integra	155017
צנטריפוגה מקררת	Eppendorf	5810R
זרימה למינרית	Kendro	Hera בטוחה-KS9
שואב (משאבת יניקה כירורגית בזרימה נמוכה)	Atmos	C361
מבער גז	מעבדה Integra	Fire Boy eco
מעיל מעבדה חד פעמי	Paperlynen GmbH	MD0202414
מסכה כירורגית עם מגן	קימברלי-קלארק	48247
מחסום	מכסה מנוע כירורגי	42072
כפפות לטקס	Semper Care	CE0321
קולגנאז (מספר אצווה NB 4G)	Serva	17465
סידן כלוריד דיהידרט	Merck	2382
EGTA	סיגמא	E4378
נתרן כלורי	רוט	9265.2
הפס	רוט	9105.3
אשלגן כלורי	Serva	26868
אלבומין	ביומול	01400-2
גלוקוז	סרווה	22700
נתרן מימן פחמתי	Serva	30180
0.4% תמיסת טריפאן כחולה	לונזה	17-942E
פתרון אחסון קר	Hepacult GmbH