העשרה וטיהור של תאי גזע עובריים אנושיים על ידי זיהוי אנטיגנים משטח התא באמצעות נוגדנים חד שבטיים TG30 ו GCTM-2

סיכום

אנו מתארים את השימוש בנוגדנים חד שבטיים TG30 (CD9) ו- GCTM-2 לגילוי משולב של אנטיגנים משטח התא באמצעות מיון תאים המופעל על ידי פלואורסצנטיות (FACS) לזיהוי והעשרה של תאי גזע עובריים אנושיים חיים (hESC) באמצעות בחירה חיובית וגם שימוש בבחירה שלילית כדי לטהר hESCs מאוכלוסיית תאים מעורבת.

תקציר

תאי גזע עובריים אנושיים (hESC) יכולים לחדש את עצמם ללא הגבלת זמן במבחנה, ועם הרמזים המתאימים ניתן לגרום להבדיל לתוך פוטנציאל כל שושלת התא סומטי. נגזרות hESC מובחנות יכולות לשמש באופן פוטנציאלי בטיפולי השתלה לטיפול במגוון מחלות ניווניות של תאים. עם זאת, פרוטוקולי בידול hESC בדרך כלל מניבים תערובת של סוגי תאים מובחנים של יעדים ומחוץ ליעד, כמו גם תאים לא מובחנים שיורית. לתרגום נגזרות hESC מובחנות מהמעבדה למרפאה, חשוב להיות מסוגלים להפלות בין תאים לא מובחנים (פלוריפוטנטיים) לבין תאים מובחנים, וליצור שיטות להפרדת אוכלוסיות אלה. יישום בטוח של סוגי תאים סומטיים שמקורם ב- hESC יכול להתבצע רק עם אוכלוסיות נטולות תאי גזע פלוריפוטנטיים, שכן שאריות hESCs יכולות לגרום לגידולים הידועים בשם טרטומות לאחר ההשתלה. לקראת מטרה זו, כאן אנו מתארים מתודולוגיה לגילוי אנטיגנים משטח תא הקשורים pluripotency עם נוגדנים חד שבטיים TG30 (CD9) ו GCTM-2 באמצעות מיון תאים המופעלים פלואורסצנטיות (FACS) לזיהוי של pluripotent TG30^היי-GCTM-2^היי hESCs באמצעות בחירה חיובית. באמצעות בחירה שלילית עם מתודולוגיית ה- FACS TG30/GCTM-2 שלנו, הצלחנו לזהות ולטהר HESCs לא מובחנים באוכלוסיות שעברו בידול בשלב מוקדם מאוד (TG30^Neg-GCTM-2^Neg). במחקר נוסף, דגימות ללא תאי גזע פלוריפוטנטיים של תאי TG30^Neg-GCTM-2^Neg מובחנים שנבחרו באמצעות פרוטוקול FACS TG30/GCTM-2 שלנו לא יצרו טרטומות שהושתלו בעבר בעכברים עם פגיעה במערכת החיסון, התומכים בחוזק הפרוטוקול שלנו. מצד שני, TG30 /GCTM-2 FACS בתיווך פסוקים רצופים של TG30 Hi-GCTM-2^Hi hESCs מועשרים לא השפיעו על יכולתם לחדש את עצמם במבחנה או על הפלוריפוטנציה המהותית שלהם. לכן, המאפיינים של מתודולוגיית ה- FACS TG30/GCTM-2 שלנו מספקים מבחנים רגישים להשגת אוכלוסיות מועשרות מאוד של hPSC כתשומות למבחני בידול ולפטור hESC גידולי פוטנציאלי (או שיורית) מאוכלוסיות תאים נגזרים.

מבוא

HPSC (hPSC) כוללים תאי גזע עובריים אנושיים (hESC) ותאי גזע פלוריפוטנטיים הנגרמים על ידי בני אדם (hIPSC). HPSC יכול לחדש את עצמו ללא הגבלת זמן בתנאי תרבות מתאימים מבלי לאבד את יכולתם המכונה "pluripotency". Pluripotency מוגדר כפוטנציאל לתא להבדיל לתוך כל שושלת תאים סומטית כולל תאים המייצגים כל אחת משלוש שכבות תא נבט עוברי. הפוטנציאל המדהים של hPSC מספק אמצעי למגוון רחב של יישומים מבוססי תאים כולל אפשרויות טיפוליות. לדוגמה, ישנן הפרעות הכרוכות במוות תאי ונ ניוון, שבהן פונקציונליות תקינה של תאים בגוף האדם נפגעת, כמו באי ספיקת לב, פציעות בעמוד השדרה, סוכרת, מחלת פרקינסון, כמה סוגי סרטן ופתולוגיות קליניות אחרות. חולים הסובלים מתנאים אלה עלולים להיות מטופלים על ידי השתלת תאים סומטיים בריאים ותפקודיים שנגזרו מ- hPSC במעבדה. עם זאת, פרוטוקולי הבידול הנוכחיים של hPSC אינם יעילים ב -100% ומניבים תערובת של סוגי תאים מובחנים של יעדים וסוגי תאים מחוץ ליעד, כמו גם שאריות hPSCs שלא עברו בידול, במקום זאת ממשיכים לחדש את עצמם^1-3. הנוכחות של אפילו מספר קטן של hPSC במדגם של תאים סומטיים שמקורם hPSC המיועד להשתלה לחולים מהווה סיכון קליני רציני כמו תאים אלה מטבעם הטבעי כדי ליצור רקמות של כל שלוש שכבות נבט עוברי, יכול להיווצר vivo סוג של גידול המכונה טרטומה. לכן, רק אוכלוסיות תאי יעד שנקבעו כנקיות מתאי גזע פלוריפוטנטיים יכולות להיחשב בטוחות להשתלה בחולים. ישנן מספר גישות שדווחו כדי להשיג פוטנציאל טיהור של hPSCs שיורית בעקבות בידול, (לסקירה ראה פולנקו ולאסלט⁴). דיווחנו בעבר על השימוש בנוגדנים חד שבטיים TG30 (CD9) ו- GCTM-2 יחד עם מיון תאים המופעל על ידי פלואורסצנטיות (FACS) כדי לזהות תאי גזע פלוריפוטנטיים ולהפלות אותם מתאים העוברים שלב מוקדם של בידול בתרבויות של קווי hESC^5-7.

אחד היתרונות של שימוש בנוגדנים כדי לזהות אנטיגנים משטח התא הוא כי תאי היעד הם בדרך כלל קיימא לאחר איגוד נוגדנים ו / או תיוג. לכן, תאי היעד ניתן לאסוף לאחר תיוג נוגדנים recultured להתרחבות ויישומים נוספים לפני ההשתלה. אזהרה אחת עבור אנטיגנים משטח התא לידי ביטוי על hPSC היא כי הם אינם בלעדיים לשלב pluripotent והם במקרים רבים מחדש לידי ביטוי זמני במהלך הפיתוח ולכן יזוהו בכמה סוגי תאים מובחנים. לכן, אם המטרה היא להשתמש בנוגדנים כדי לזהות תאים פלוריפוטנטיים אנושיים ולנטהר אותם מדגם של תאים שמקורם ב- hPSC, נוגדנים נבחרים לא צריכים להגיב גם עם אנטיגנים על סוגי התאים המבודלים הספציפיים המיועדים להשתלה. למרבה הצער, ישנם מספר מוגבל של נוגדנים המזהים סמני משטח תא על hPSCs חי ⁴, מה שהופך מוגבל את האפשרויות לבחירה. בנוסף, מספר מחקרים הצביעו על כך שזיהוי של סמן אחד משטח תא יחיד אינו מספיק כדי לחסל את כל hPSC, מה שמרמז כי כל ניסיון לחסל את כל תת-אוכלוסיות ה- hPSC pluripotent צריך להסתמך על שיטות המשתמשות בשני נוגדנים או יותר המזהים אפיטופים שונים המבוטאים על ידי hPSCs ^9-10. כפי שהוזכר לעיל, רק תאים שמקורם hPSC שניתן לקבוע כמו אוכלוסיות תאים ללא תאי גזע pluripotent מתאימים להשתלה אנושית. הגעה לרמה זו של ההקפדה לא ניתן להשיג עם מעבר אחד באמצעות טכנולוגיית מיון תאים בתיווך נוגדנים. Reculture של האוכלוסייה המועשרת של תאי יעד מובחנים וסבבים הבאים של מיון תאים עשויים להידרש כדי להשיג באופן סופי דגימות ללא תאי גזע פלוריפוטנטיים.

במעבדה שלנו, אפיינו בהרחבה שני נוגדני פני תא hES, TG30 (CD9) ו- GCTM-2, לגילוי תאים פלוריפוטנטיים חיים. המחקרים שלנו הראו כי זיהוי משולב של TG30 ו- GCTM-2 מאוד בקורלציה עם הביטוי של גנים הקשורים פלוריפוטנציה קנונית בשורות hESC ^5-7. TG30/GCTM-2 חיסוני FACS הראה באופן עקבי כי תרבויות hESC מהוות שיפוע רציף כמותי של ביטוי TG30/GCTM-2 ^5-7. הקמנו באופן שרירותי ארבע אוכלוסיות (P) של תאים בתוך שיפוע TG30/GCTM-2 זה: P4 (TG30^Neg-GCTM-2^Neg),P5 (TG30^נמוך-GCTM-2^נמוך),P6 (TG30^Mid-GCTM-2^Mid)ו- P7 (TG30^Hi-GCTM-2^Hi) האפיון שלנו של אוכלוסיות אלה P4, P5, P6 ו- P7 תאים הראה כי P6 ו P7 תתי-שברים להביע מספר רב של גנים הקשורים pluripotency ביעילות ליצור מושבות דמויי גזע כאשר recultured שלאחר FACS ^2-3. מצד שני, P4 (TG30^Neg-GCTM-2^Neg)תאים להביע מספר רב של סמני בידול ומהווים את סוגי התאים מובחנים באופן ספונטני המתרחשים בדרך כלל בהרחבת תרבויות של קווי hESC ^5-6. החלטנו לבדוק את הפוטנציאל של FACS TG30/GCTM-2 שלנו לחיסול סלקטיבי של שאריות hPSCs לאחר בידול בשלב מוקדם, וגם להעשרה של אוכלוסיות תאי גזע פלוריפוטנטיים. הפרוטוקול המתואר להלן מראה כיצד לאסוף ולפתוח מחדש תאים מובחנים P4 (TG30^Neg-GCTM-2^Neg)לאחר FACS כדי להשיג טיהור של P7 פלוריפוטנטי (TG30^Hi-GCTM-2^Hi). יתר על כן, אנו מסבירים גם את האוסף וההתרבות של תאי P7 (TG30^Hi-GCTM-2^Hi)כדי להשיג תרבות מועשרת של תאים פלוריפוטנטיים, אשר לאחר מכן יכול לשמש כאוכלוסיית קלט מוגדרת כדי להגדיל את היעילות והעקביות של מבחני הבידול.

פרוטוקול

הפרוטוקול הבא בוצע באמצעות hESC-MEL1^{11 תרבויות} בתפזורת סטנדרטיות המסופקות על ידי מתקן StemCore באוניברסיטת מונאש (מלבורן). קו תאים זה מתורבת באופן שגרתי על שכבה של פיברובלסטים עובריים של עכבר מומתים מיטוטיים (MEFs) ב- bFGF בתוספת hESC / KOSR מדיה⁷ ומתוחזק עם דיסוציאציה אנזימטית (Collagenase) כל 5-7 ימים⁸. hESC תרבויות גדל ~ 80% מפגש ב 75 ס"מ² (T75) בקבוקונים משמשים אוכלוסיות קלט עבור פרוטוקול זה. כל הליכי מניפולציה התא המתוארים להלן צריך להתבצע בתנאים אספטיים בארון HEPA מסונן מחלקה II ביו בטיחות.

יומיים לפני ביצוע בדיקה של FACS TG30/GCTM-2, הכינו את לוחות התרבות T75 (המתוארים בסעיף 1) שישמשו להתרבות מחדש של תאים שנמצאו לאחר FACS (המתוארים בסעיף 4).

1. זריעת MEFs והכנת בינוני מותנה MEF

1.1 יום -2: ציפוי של MEFs לתוך בקבוקים T75

1. פיפטה 10 מ"ל של 0.1% w / v ג'לטין לתוך כל בקבוק T75 להטות את פני השטח באופן שווה.
2. דגירה במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר בארון biosafety.
3. תמיסת ג'לטין שאיפה.
4. הוסף 20 מ"ל MEF-בינוני לבקבוק טרום שיווי משקל ל 37 °C/5% CO₂ במשך 30 דקות באינקובטור תרבות התא.
5. Plate הפעיל באופן מיתוטלי קבצי MEFs על גבי בקבוקונים מוכנים בצפיפויות הבאות. עבור 1/3 זרעי צפיפות MEF 1.4 x 10⁴ תאים / ס"מ² (T75 = 1 x 10⁶ MEFs). עבור זרעי MEF בצפיפות מלאה 5.3 x 10⁴ תאים / ס"מ² (T75 = 4 x 10⁶ MEFs).

הערה: אנו משתמשים באופן שגרתי ב- MEFs שהושבתו באופן מיטוטי על-ידי הקרנת γ. פרוטוקול להכנת MEFs מוקרן γ ניתן למצוא מיכלסקה¹².

6. דגירה מוקרנת MEF תרבויות ב 37 °C /5% CO₂ לילה. 1/3 צלושי ניתן לדגר במשך 1-4 ימים ללא שינוי MEF-בינוני. בקבוקונים אלה משמשים להזרמת תאים שלאחר FACS (כמו בפרוטוקול 4). צלושי MEF מלאים הם דגירה לילה כדי ליצור CM לפי להלן בשלב 1.2.

1.2 יום -1: הכנת מדיום ממוזג MEF (CM)

1. לשאוף MEF-בינוני מבקבוקים מלאים MEF T75.
2. הוסף בינוני 25 מ"ל hESC/KOSR 25 מ"ל בתוספת 5 ננוגרם/מיליליטר FGF-2 אנושי לכל בקבוק T75. דגירה ב 37 °C/5% CO₂ עבור 24 שעות.
3. לאסוף בינוני מותנה MEF (CM) לתוך צינור תרבית רקמה סטרילית, תוספת טרייה CM עם 10 ng/ml אדם FGF-2 ומסנן באמצעות מסנן פוליאתרסולפונה 0.22 מיקרומטר.
4. כדי להפיק CM נוסף, חזור על שלבים 1.2.2 ו- 1.2.3 מדי יום באותה תרבות MEF למשך שבוע.

ביום ביצוע בדיקה TG30/GCTM-2, להחליף MEF-בינוני ב 1/3 MEF T75 בקבוקונים עם CM ו pre-equilibrate לפחות 30 דקות לפני זריעת כל hESCs או תאים נגזרים hESC התאושש מההליך כמתואר להלן. CM משמש טרי או מאוחסן ב 4 מעלות צלזיוס עד 2 שבועות. CM משמש בפרוטוקול זה כמו בידיים שלנו זה מגביר את הכדאיות של התאים שלאחר FACS לעומת מדיה ללא תנאים (תוצאות לא מוצגות).

2. ביצוע TG30/GCTM-2 FACS Assay: ניתוק של תרביות בתפזורת hESC לתאים בודדים

הערה: Prechill 20% FBS / DMEM-F12 בינוני ב 4 °C (69 °F).

1. שאפתן את התקשורת hESC / KOSR משני בקבוקוני T75 עם קו hESC מתורבת.
2. לשטוף את התאים בכל T75 עם 10 מיליליטר DPBS לשאוף להסיר.
3. הוסף פתרון ניתוק של 3 מ"ל של TrypLE Express לכל בקבוק T75. דגירה ב 37 °C/5% CO₂ במשך 5 דקות.
4. להקפיץ את הצד של הבקבוקים כדי לקבל עקום מוחלט של התאים. בדוק תחת מיקרוסקופ. אם התאים אינם מתפזרים בקלות, דגירה למשך 2-3 דקות נוספות ב- 37 °C/5% CO₂.
5. הוסף 10 מ"ל 20% FBS / DMEM-F12 (נשמר ב 4 מעלות צלזיוס) לכל בקבוק T75. באמצעות פיפטה סטרילית 10 מיליליטר בעדינות triturate התאים מנותקים מספר פעמים על הקיר בקבוק כדי להשיג השעיה תא יחיד בעיקר.
6. מניחים מסננת תאים 70 מיקרומטר על צינור פוליפרופילן סטרילי 50 מ"ל. השתמש פיפטה סטרילית 10 מיליליטר כדי לכפות את השעיות תא יחיד hESC במאגר משני צלושי T75 דרך מסננת.
7. השלך מסננת תאים, החלף את מכסה הצינור וצנטריפוגה השעיית hESC במאגר ב 1,000 x g במשך 2 דקות.
8. להשליך supernatant ולשטוף את התאים על ידי שימוש חוזר בעדינות גלולה ב 10 מיליליטר 20% FBS / DMEM-F12 (prechilled ב 4 מעלות צלזיוס).
9. בצע צנטריפוגה שנייה ב- 1,000 x g במשך 2 דקות.
10. השלך על-טבעי, הוסף 10 מ"ל 20% FBS/DMEM-F12 (מראש ב 4 °C (4 °C)) בעדינות triturate כדי resuspend תאים. מניחים את הצינור 50 מ"ל על קרח. צינור זה ישמש עבור הליך חיסון מדגם מיון המתואר להלן.
11. קח 20 μl של השעיית תא יחיד hESC (שלב 2.10) לספירת מספר תא באמצעות hemotocytometer. אתה צריך לצפות לתשואה של 10-15 מיליון תאים לכל בקבוק T75.

הערה: FBS משמש בחלק זה של הפרוטוקול כדי להגביר את הכדאיות של תאים לאחר FACS.

3. כתמים אימונופלואורסצנטיים של אנטיגנים משטח התא TG30 ו- GCTM-2

1. Aliquot 150 μl (~ 100,000 תאים) של השעיית תא יחיד hESC (משלב 2.11) לתוך כל אחד משישה צינורות microcentrifuge של 1.5 מ"ל. ששת aliquots אלה ישמשו עבור פקדי הכתם הנדרשים כדי לכייל את ההסתערות על מכונת FACS. הנותר ~ 9 מיליליטר השעיית תא יהיה מדגם המיון שלך שבו התרבות מנותק יהיה costained לגילוי של TG30 ו GCTM-2, על פי טבלאות 1 ו 2.
2. בצע תגובות מחייבות של נוגדנים ראשוניים ב 20% FBS / DMEM-F12. אמצעי אחסון לתגובה סופית צריכים להיות ~ 9 מ"ל עבור מדגם המיון ו- 200 μl עבור הפקדים. כלול פקדי isotype כנוגדנים עיקריים. מניחים צינורות אופקית על קרח ומערבבים בעדינות במשך 30 דקות על פלטפורמת נדנדה.
3. תגובות נוגדנים ראשוניות צנטריפוגה ב 1,000 x g במשך 2 דקות.
4. השלך supernatant ולשטוף את התאים על ידי שימוש חוזר גלולה ב 20 מיליליטר 20% FBS / DMEM-F12 (prechilled ב 4 °C (4 °C (69 °F) עבור מדגם מיון ו 200 μl עבור הפקדים.
5. בצע סיבוב שני ב- 1,000 x g למשך 2 דקות.
6. בצע תגובות מחייבות של נוגדנים משניים ב 20% FBS / DMEM-F12. אמצעי אחסון לתגובה סופית צריכים להיות 2.5 מ"ל עבור מדגם המיון ו- 200 μl עבור הפקדים. הכן את צינור התגובה PE נגד עכבר CD90.2 בשלב זה. מניחים צינורות אופקית על קרח ומערבבים בעדינות במשך 30 דקות על פלטפורמת נדנדה.

הערה: במהלך זמן דגירה זה, נוח לאסוף CM ולהכין 1/3 בקבוקונים MEF T75 עם CM כמו בסעיף 1.2.

7. תגובות נוגדנים משניות צנטריפוגה ב 1,000 x g במשך 2 דקות.
8. השלך supernatant ולשטוף את התאים פעמיים על ידי שימוש חוזר גלולה ב 20 מיליליטר 20% FBS / DMEM-F12 (prechilled ב 4 °C (4 °C )) עבור מדגם מיון ו 200 μl עבור הפקדים.
9. בצע סיבוב ב 1,000 x g במשך 2 דקות בעקבות כל לשטוף ומניחים צינורות על הקרח.
10. השלך supernatants וכדורי תא resuspend ב 20% FBS / DMEM-F12 בתוספת יודיד propidium (PI) ב 0.3 מיקרוגרם / מיליליטר. השתמש 2-3 מיליליטר עבור מדגם מיון ו 300 μl עבור הפקדים.

הערה: אין להוסיף PI לצינור הבקרה עם תאים לא מוכתמים.

11. השתמש במיקרופיפט P1000 כדי לכפות על כל תא בודד השעיה באמצעות מסננת תא מכסה 35 מיקרומטר, יחד עם 5 מ"ל צינור פוליסטירן מבחנות עגולות התחתון.
12. צנטריפוגה ב 50 גרם / דקה לכפות דרך השעיית תא שיורית על מכסי מסננת.
13. התחדשו בכל השעיה של תא בודד על ידי הקשה על דפנות הצינורות, והניחו על הקרח. התאים שלך מוכנים כעת עבור FACS. אנא המשיכו מיד.

4. תרבות פוסט-FACS של תאי תת-שבר TG30/GCTM-2 ב-75 ס"מ² (T75) בקבוקונים

1. דיווחנו בעבר כיצד להקים מכונת FACS עבור TG30/GCTM-2 immunoprofiling⁷. ההליך מאפשר התאוששות של hESCs יחיד קיימא, ללא MEFs, ובתוך השערים של P4 (TG30^Neg-GCTM-2^Neg),P5 (TG30^נמוך-GCTM-2^נמוך),P6 (TG30^אמצע-GCTM-2^Mid)ו P7 (TG30^היי-GCTM-2^היי)- ראה איור 1E. הגדר את מכונת FACS עבור FACS TG30/GCTM-2 כמו בדוח הקודם שלנו כדי לשחזר את תתי-fractions התא שישמשו הבא.
2. הוסף 1 מיליליטר CM, מוכן כמו בשלב 1.2, לכל אחד משני מבחנות 5 מיליליטר עגול התחתון לפני איסוף תאים ממכונת FACS. מניחים על קרח.
3. שחזר 400,000 תאים כל אחד מ- P4 מובחן (TG30^Neg-GCTM-2^Neg)ו- P7 פלוריפוטנטי (TG30^Hi-GCTM-2^Hi)תתי-פרקי תאים באמצעות TG30/GCTM-2 FACS.
4. צנטריפוגה צינורות האיסוף ב 1,000 x g במשך 5 דקות.
5. לשאוף את הנתנים העל-טבעיים. הוסף 1 מ"ל מראש 37 °C/5% CO₂ CM לשימוש חוזר כל גלולה תא באמצעות מיקרופיפטור P1000. זרע את התאים עבור כל שבר על בקבוק 1/3 MEF T75 שווה מראש עם CM (מוכן לפי שלב 1.2)
6. תרבות ב 37 °C/5% CO₂ עבור 24 שעות באינקובטור תרבות התא.
7. שאפת CM מדי יום ולהחליף עם CM מוכן טרי (כמו בשלב 1.2) במשך כשבועיים. תרבויות של תאים P7 pluripotent (TG30^היי-GCTM-2^Hi)להראות מושבות דמויי גזע אנושי לאחר שבוע אחד ולהגיע ~ 80% מפגש ב 9-11 ימים. תרבויות של P4 (TG30^Neg-GCTM-2^Neg)תאים גדלים בעיקר כמדשאה של תאים דמויי פיברובלסט שמגיע לעיסוק ב 11-13 ימים. בשלב זה, במידת הצורך, ניתן להשתמש בתרביות תאים P4 ו- P7 עבור FACS TG30/GCTM-2 בתיווך תיקון רצוף של תתי-שברי P4 או P7 (ראה איורים 2 ו- 3).

תוצאות

h נגזרות של hESC שהן נטולות תאי גזע פלוריפוטנטיים ניתן להשיג על ידי פסיעה רצופה של תאים מתת-השבירה P4 (TG30 Neg-GCTM-2^Neg).

דיווחים קודמים קבעו כי בתרבויות תקן hESC תערובת של תתי-אוכלוסיות מתקיימות יחד המציגות שיפוע ביטוי של גנים הקשורים לפלוריפוטנציה^5,6,13. זיהוי משולב של אנטיגנים משטח התא כמו TG30 (CD9) ו GCTM-2 מאפשר אפליה של מספר קבוצות משנה של תאים בשלב pluripotent ובשלבים שונים של בידול מוקדם, כפי שצוין על ידי הביטוי שלהם של סמני תאי גזע וגורמי שעתוק ספציפיים^{שושלת 5,6,13}. בהסכמה עם דיווחים קודמים, הצלחנו להפלות P4 (TG30^Neg-GCTM-2^Neg),P5 (TG30^נמוך-GCTM-2^נמוך),P6 (TG30 Mid-GCTM-2^Mid),ו P7 (TG30^היי-GCTM-2^Hi)בקו hESC-MEL1 המשמש למחקר זה (איור 1). עם תוצאה זו, המשכנו לאסוף P4 מובחן (TG30^Neg-GCTM-2^Neg)תאים P7 פלוריפוטנטי (TG30^היי-GCTM-2^היי)תאים עבור תרבות נוספת במחקרים המתוארים להלן.

חקרנו אם באמצעות גישת בחירה שלילית אנו יכולים לטהר hESCs מובחנים מאוכלוסיות תאים שעברו בידול בשלב מוקדם מאוד (TG30^Neg-GCTM-2^Neg). השתמשנו במספר מוגדר של תאי P4 (TG30^Neg-GCTM-2^Neg)שהיו מתורבתים ברצף לאחר FACS(איור 2A)במשך כשבועיים, ותיעזרנו מחדש באמצעות FACS TG30/GCTM-2 לפני ההזרמה מחדש בכל קטע. התוצאות הראו כי ה-P4-subfraction מועשר עבור TG30^Neg-GCTM-2^Neg סוגי תאים מובחנים לאחר מעבר רצוף, ונוכחות מינורית של תאי P7 (TG30^Hi-GCTM-2^Hi)במעבר הראשוני(איור 2A,מעבר 1) נעלמו בסופו של דבר לאחר מעבר נוסף, והפכו לדגימות נטולות תאי גזע פלוריפוטנטיים(איור 2A, מעבר 3).

העשרה של תאי hESC pluripotent ניתן להשיג על ידי אוסף של תאים TG30^היי-GCTM-2 היי תאים.

בהתבסס על תצפיות קודמות באמצעות מבחנים אלה, היינו מצפים להעשרה של hESCs pluripotent על ידי איסוף P7 (TG30^Hi-GCTM-2^Hi)תאים שאמורים ליצור מושבות hESC. לכן, חקרנו גם TG30 / GCTM-2 FACS בתיווך העברה רצופה של תאים pluripotent P7 (TG30^Hi-GCTM-2^Hi). בתרבויות P7 אלה, חיסון FACS TG30/GCTM-2 בוצע לפני ריפוד תאים בכל קטע ורק תאיP7 (TG30 Hi-GCTM-2^Hi)צולמו מחדש. בדרך זו, הבחנו כי רוב התאים היו ממוקמים בfractions הקשורים pluripotency (P6 ו P7), המציין העשרה של תאים פלוריפוטנטיים כי גם שמרה על היכולת להבדיל וליצור אחוז קטן של P4 (TG30^Neg-GCTM-2^Neg) תאים (איור 3A). יתר על כן, תרבויות של תאי P7 הראו מספר רב של מושבות דמויי hESC במהלך ההעברה (איור 3B), גם מצביע על תחזוקה של מצב pluripotency.

איור 1. אסטרטגיית מיון מייצגת להשגת שברי משנה של FACS TG30/GCTM-2. (A): השעיות תאי hES מנותקות ממוינות כתאים בודדים וגושים או כפילויות פוטנציאליים מגודרים החוצה עם הפיזור הקדמי עבור גובה ואזור (FSC-H ו- FSC-A). (B): פסולת פוטנציאלית מוסרת עם FSC-A ו- SSC-A, ורק תאים שלמים ממוינים עוד יותר. (ג): תאים שאינם ברי קיימא אינם נכללים בהתבסס על פלואורסצנטיות פרופידיום יודיד (PI) (FSC-A ו- FL3-A). (ד): תאי מאכיל MEF היו מגודרים על-ידי בחירה שלילית בהתבסס על ביטוי של העכבר CD90.2-PE (FL2-A ו- SSC-A). (ה): שבר hESC קיימא מבודד, ללא מאכילי MEF, הוא סוף סוף מופרד לתוך P4 (TG30^נג-GCTM-2^נג),P5 (TG30^נמוך-GCTM-2^נמוך),P6 (TG30^אמצע-GCTM-2^אמצע),ו P7 (TG30^היי-GCTM-2^Hi)תת-אוכלוסיות. השער השלילי (TG30^Neg-GCTM-2^Neg, בשם P4) נקבע על פי שפעת אוטומטית ברקע עבור התאים מוכתמים וגם לבקרות isotype. (ו): אחוזים של תת-אוכלוסיות מגודרות שונות האופייניות לניתוח ציטומטריית זרימה TG30/GCTM-2. לחץ כאן כדי להציג איור גדול יותר.

איור 2. תרבויות עוקבות מייצגות של תאי P4(TG30 Neg-GCTM-2^Neg)המובחנים באופן ספונטני מקו hESC-MEL1. (A): ייצוגי TG30/GCTM-2 FACS התוויות המציגות תת-קבוצות מגודרות של תאים (P4, P5, P6 ו- P7) מופלים על-ידי רמת הביטוי שזוהה של סמני משטח תאים TG30 ו- GCTM-2. אוכלוסייה ראשונית של 400,000 hESC-נגזרות המציג P4 (TG30^Neg-GCTM-2^Neg)immunoprofiling נאסף מתרבויות בתפזורת של קו hESC-MEL1. תאים אלה P4 (TG30^Neg-GCTM-2^Neg)מועברים ברציפות לאחר FACS בתנאים התומכים בחידוש hESC בבקבוקי T75, עד להגעה לסיכום (11-13 ימים). לפני כל קטע, TG30 / GCTM-2 FACS מבוצע כדי לאסוף ולבת מחדש רק את P4 (TG30^Neg-GCTM-2^Neg) סוגי תאים מובחנים. (B): מורפולוגיה אופיינית של הדשא של P4 מובחן (TG30^Neg-GCTM-2^Neg)תאים לאחר 14 ימים. (ג): מושבות ספורדיות דמויי hESC שנראו לאחר 14 ימים התערבבו עם הדשא של P4 (TG30^Neg-GCTM-2^Neg)תאים במעבר 1 בלבד, נוצרים ככל הנראה על ידי מזהם P7 (TG30^היי-GCTM-2^היי)תאים. סרגל קנה מידה = 200 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג איור גדול יותר.

איור 3. P7 (TG30^Hi-GCTM-2^Hi)תאים הנגזרים מקווי hESC ניתן להעביר ברציפות שלאחר FACS מבלי לאבד את המאפיינים pluripotent המהותיים שלהם. נציג TG30/GCTM-2 FACS immunoprofiling של קטעים רצופים שונים, מראה את קבוצות משנה מופלות של תאים (P4, P5, P6, ו P7) על פי רמת הביטוי של TG30 ו GCTM-2. (א): אוכלוסייה התחלתית של 400,000 תאים המציגים מאפייני P7 (TG30^Hi-GCTM-2^Hi)מאוחזרת מתרבויות בתפזורת של קו hESC-MEL1. תאים Pluripotent P7 (TG30^Hi-GCTM-2^Hi)מועברים ברציפות לאחר FACS בתנאים התומכים בחידוש hESC בבקבוקי T75, עד שהם מגיעים ~ 80% מפגש (9-11 ימים). TG30/GCTM-2 חיסוני FACS מבוצע לפני replating תאים בכל מעבר ורק תאים P7 (TG30^Hi-GCTM-2^Hi)הם recultured. התוצאות מראות שתאי P7 (TG30 Hi-GCTM-2^Hi)משמרים את המאפיינים הפלוריפוטנטיים שלהם עם המעבר הבא, כולל שימור (TG30^Hi-GCTM-2^Hi)ביטוי, יצירת מושבות דמויי hESC (מוצג ב- B)ושמירה על היכולת להבדיל כפי שניתן להסיק מן הסיכום של חלק קטן של P4 מובחן (TG30^Neg-GCTM-2^Neg)בכל אחד ממדרגי FACS. סרגל קנה מידה = 200 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג איור גדול יותר.

דוגמה (אמצעי אחסון לתגובה)	נוגדן ראשוני	נוגדן משני	עכברוש PE נגד עכבר CD90.2 b	פרופידיום יודיד c
דוגמת מיון (~ 9 מ"ל עבור ABS ראשי, 2.5 מ"ל עבור ABS משני)	(TG30 + GCTM-2) א	AF 488 עז נגד עכבר IgG2a + AF 647 עז נגד עכבר IgM	+	+
בקרה-1: TG30 (200 μl)	TG30	AF 488 עז נגד עכבר IgG2a	-	+
בקרה-2: GCTM-2 (200 μl)	GCTM-2	AF 647 עז נגד עכבר IgM	-	+
Control-3: CD90.2 נגד עכבר (200 μl)	-	-	+	+
בקרה-4: פיקוריתרין (PE) (200 מיקרול)	עכבר IgG2a איזוטיפ	R-פיקוריתרין עז נגד עכבר IgG2a	-	+
Control-5: איזוטיפ אימונוגלובולין עכבר (200 μl)	עכבר IgG2a isotype + איזוטיפ IgM	AF 488 עז נגד עכבר IgG2a + AF 647 עז נגד עכבר IgM	-	+
Control-6: תאים לא מוכתמים (200 μl)	-	-	-	-

שולחן 1. מיין דוגמה ופקדים עבור מיון FACS. ^א דגימת מיון היא immunostained בו זמנית עם נוגדני TG30 ו- GCTM-2. ^{b b} CD90.2 נגד עכבר PE משמש לזיהוי תאי עכבר ולהסרת קבצי MEFs מ- HESCs במהלך FACS¹⁴. ^ג תאים שאינם ברי קיימא אינם נכללים באמצעות יודיד propidium בריכוז הסופי של 0.3 מיקרוגרם / מיליליטר. ריאגנט הוסיף (+), לא הוסיף (-) לצינור התגובה.

נוגדן	מארח	סוג נתונים	דילול עבודה
TG30 (1.4 מ"ג/מ"ל)	עכבר	IgG2a	1:1,000
GCTM-2 (היברידיומה על טבעית)	עכבר	IgM (IgM)	1:5 ~ 1:10 a
AF 488 עז נגד עכבר IgG2a	עז	פוליקלונאלי	1:500
AF 647 עז נגד עכבר IgM	עז	פוליקלונאלי	1:500
R-פיקוריתרין (PE) עז נגד עכבר IgG2a	עז	פוליקלונאלי	1:1,000
CD90.2 נגד עכבר	חולדה	IgG2b	1:100
עכבר מטוהר IgG2a, κ בקרת איזוטיפ	עכבר	IgG2a	1:200
עכבר מטוהר IgM, κ בקרת Isotype	עכבר	IgM (IgM)	1:200

שולחן 2. פרטי נוגדנים ודילולים למיון FACS. ^בשל הביטוי הגבוה מאוד של GCTM-2 על פני התא של hESCs לא ניתן להגיע רוויה עם נוגדן זה. כל אצווה של GCTM-2 היברידית supernatant חייב להיות titrated נגד פקד סטנדרטי או אצווה קודמת כדי להשיג תוצאות דומות עם hESCs בקנה מידה כדי למנוע כתמים.

שם המדיום	הרכב
hESC/קוסר בינוני	הנשר שונה של Dulbecco בינוני:תערובת תזונה F-12 (DMEM / F-12) בתוספת 20% החלפת סרום נוקאאוט (KOSR), 2 mM GlutaMAX, 1% חומצות אמינו לא חיוניות MEM, 0.1 מ"מ 2-Mercaptoethanol, 10 ננוגרם/מיליליטר גורם גדילה פיברובלסט אנושי 2 (FGF-2) ועט/סטרפטוקוקוס ב 1x.
מדיום MEF	הנשר שונה בינוני של Dulbecco, גלוקוז גבוה (DMEM) בתוספת 10% סרום שור עוברי (FBS), 2 מ"מ GlutaMAX, ו עט / סטרפטוקוקוס ב 1x.

שולחן 3. הרכב של מדיה תרבותית.

דיון

בהקשר הקליני, סוגי תאים סומטיים מובחנים הם המוצר הרצוי הסופי להשתלה ויישומים טיפוליים, ו- hPSC הם מקור לחידוש עצמי ומדרגי ליצירת אותם תאים סומטיים או אבותיהם במעבדה. נוכחותם של שאריות hESCs מובחנות עם פוטנציאל אינהרנטי להיווצרות טרטומה היא סיכון בטיחותי כאשר בוחנים תאים סומטיים שמקורם ב- hESC להשתלה בחולים. לסקירה של זה וסיכונים אחרים הקשורים לטיפול בתאים אנא ראה שארפ ואח '. ¹⁶ לכן, כדי לממש יישומים כאלה, זה הכרחי כי החוקרים שואפים ליצור אוכלוסיות תא היעד כי הם גם פלוריפוטנטי תאי גזע חינם. לקראת מטרה זו, אנו מראים כאן כי באמצעות מתודולוגיית TG30/GCTM-2 FACS שלנו ניתן לפקח על נוכחותם של תאים פלוריפוטנטיים (TG30^Hi-GCTM-2^Hi)באוכלוסיית תאים מבדילה ולקבל נגזרות מובנות hESC קיימא שניתן להעשיר ולשקול מחדש לאחר FACS. למרות שלא ניתן להשיג 100% דגימות ללא תאי גזע פלוריפוטנטיים עם מעבר אחד של הפרוטוקול שלנו, נגזרות hESC מועשר ניתן לחשב מחדש ולאחר מעבר רצוף 100% טוהר תא סומטי מושגת. הכדאיות המוכחה של תאים סומטיים להתרחבות שלאחר FACS גם מאפשרת ייצור של מספר מספיק של תאים המתאימים לטיפולי השתלה פוטנציאליים.

התוצאות המעודדות של מחקר פיילוט זה גרמו לנו לבצע חקירה מקיפה יותר באמצעות פרוטוקול TG30/GCTM-2 שלנו במחקר השוואתי עם מספר תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם (hiPSC) קווים¹⁵. במחקר זה, מצאנו כי דגימות ללא תאי גזע פלוריפוטנטיים שהושגו באמצעות פרוטוקול FACS TG30/GCTM-2 שלנו לא יצרו טרטומות כאשר הושתלו בעכברים ללא חיסון. לכן, אנו יכולים לציין בביטחון כי עם השימוש בפרוטוקול זה במבחנה, בשלב מוקדם בידול תרביות התא נקבע להיות חופשי של תאי pluripotent TG30 Hi-GCTM-2 Hi אינם מפתחים טרטומות vivo. זה תומך מאוד את החוסן של ההסתערות שלנו, מתן גישה פוטנציאלית כדי למנוע את הסיכון של היווצרות טרטומה לפני השימוש בתאים שמקורם hPSC ביישומים קליניים.

לעומת זאת, אנו גם מראים כי TG30 / GCTM-2 FACS assay ניתן להשתמש כדי לאחזר אוכלוסיית תאים pluripotent עם רמה גבוהה של ביטוי של שני אנטיגנים אלה פני השטח (TG30^היי-GCTM-2^היי). מחקרים קודמים הראו כיתאי Hi-GCTM-2^Hi של TG30 מציגים את המתאם הגבוה ביותר עם ביטוי^HI OCT4 ויוצרים את המספר הגבוה ביותר של מושבות דמויי hESC^5,6,13,15. לכן אנו סיבה כי רשת pluripotency מופעלת ברמות המרביות שלה TG30^היי-GCTM-2^היי הבעת תאים. אנו רואים כי באמצעות פרוטוקול TG30/GCTM-2 FACS שלנו ואחזור תאי P7 (TG30^Hi-GCTM-2^Hi)עלולים לאפשר טיהור בקנה מידה גדול של תרבויות hESC חיות מועשרות, כמו תשומות למבחני בידול.

לסיכום, אנו מדגימים כאן את הפוטנציאל של מבחני FACS שלנו המבוססים על הביטוי המשולב של אנטיגנים משטח TG30 ו- GCTM-2 הן לטיהור והן להעשרה של hESCs. מחקרים עתידיים עם פרוטוקולים לבידול מכוון של hPSCs צפויים גם להיות אינפורמטיבי לגבי פוטנציאל זה. אנו מודעים לכך שבכמה מבחנים שבהם נגזרות hESC מובחנות מבטאות זמנית TG30 (CD9) או GCTM-2, שני נוגדנים אלה עשויים שלא להיות מתאימים או מספיקים כדי לטהר תאים פלוריפוטנטיים מאוכלוסייה מובחנת בנקודת זמן מסוימת ב- assay⁶. לכן, יש צורך מתמשך למצוא נוגדנים חדשניים המזהים במיוחד hESCs חיים כדי להתגבר על המגבלה האפשרית של תגובה צולבת עם כמה סוגי תאים מובחנים.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
DMEM/F-12	Life Technologies	11320082	שם ארוך: הנשר השונה של Dulbecco מדיום: תערובת נוטריאנטים F-12
KOSR	Life Technologies	10828028	שם ארוך: החלפת סרום נוקאאוט
GlutaMAX	Life Technologies	35050061	שם ארוך: תוסף GlutaMAX
חומצות אמינו לא חיוניות	Life Technologies	11140050	שם ארוך: MEM תמיסת חומצות אמינו לא חיוניות
Mercaptoethanol	Life Technologies	21985023	שם ארוך: 2-Mercaptoethanol
DPBS	Life Technologies	14190250	שם ארוך: Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline, ללא סידן, ללא מגנזיום
TrypLE Express	Life Technologies	12604039	שם ארוך: TrypLE Express (1x), ללא פנול אדום
AF-488	Life Technologies	A21131	שם ארוך: Alexa Fluor 488 עז נגד עכבר IgG2a
AF-647	Life Technologies	A21238	שם ארוך: Alexa Fluor 647 עז נגד עכבר IgM
PE-anti IgG2a	Life Technologies	P21139	שם ארוך: R-Phycoerythrin Goat Anti-Mouse IgG2a (γ 2א) מצומד
DMEM	Life Technologies	11965-092	שם ארוך: Modified Eagle Medium של Dulbecco, עט גלוקוז גבוה
/ Strep	Life Technologies	15140-122	שם ארוך: פניצילין-סטרפטומיצין,
טכנולוגיות חיים	במים מזוקקים	15230-089.	שם ארוך: מים מזוקקים סטריליים
PI	SIGMA	P4864	שם ארוך: תמיסת יודיד פרופידיום
FBS	SIGMA	12203C	שם ארוך: סרום בקר עוברי
ג'לטין	SIGMA	G-1890	שם ארוך: ג'לטין מעור חזיר
אנושי FGF-2	Millipore	GF003AF-100UG	שם ארוך: גורם גדילה פיברובלסט בסיסי, רקומביננטי אנושי, ללא בעלי חיים
מסנן 0.22 μ m	Millipore	SCGPU02RE	שם ארוך: Stericup-GP, 0.22 μ M, פוליאתרסולפון, 250 מ"ל, מעוקר ברדיו
70 μ m מסננת תאים	בקטון דיקינסון	352350	שם ארוך: מסננת תאים עם 70 μ m רשת ניילון
35 μ m מסננת תאי מכסה, שפופרת 5 מ"ל	Becton Dickinson	352235	שם ארוך: מבחנה תחתונה עגולה מפוליסטירן 5 מ"ל, עם מכסה מסננת תאים (35 μ מ)
5 מ"ל מבחנה תחתונה עגולה מפוליסטירן	בקטון דיקינסון	352054	שם ארוך: 5 מ"ל מבחנה תחתונה עגולה מפוליסטירן,
בקרת איזוטיפ סטרילית IgG2a	בקטון דיקינסון		554126 שם ארוך: עכבר מטוהר IgG2a, κ בקרת איזוטיפ
IgM בקרת איזוטיפ	בקטון דיקינסון	553472	שם ארוך: עכבר מטוהר IgM, κ בקרת איזוטיפ
PE-CD90.2	בקטון דיקינסון	553014	שם ארוך: PE Rat Anti-Mouse CD90.2
כיול 8 פסגות	בקטון דיקינסון	559123	שם ארוך: חלקיקי כיול קשת בענן (8 פסגות)
50 מ"ל צינור פוליפרופילן סטרילי	גריינר ביו-וואן	227261	שם ארוך: צינור פוליפרופילן 50 מ"ל עם תחתית חרוטית, בקבוק סטרילי
T75	גריינר ביו-וואן		658175 שם ארוך: מכסה מסנן CELLSTAR תרבית תאים 75 ס"מ2 צלוחיות
TG30	Merck Millipore	MAB4427	שם ארוך: נוגדן TG30, שיבוט TG30
GCTM-2	Merck Millipore	MAB4346	שם ארוך: GCTM-2 אינו זמין מסחרית אך TG343 ונוגדנים חד שבטיים מקבילים הוא
<חזק>טבלה 4. רשימת חומרים ומגיב
מכונת FACS	Becton Dickinson		FACSVantage SE עם אפשרות FACSDiva
מיקרוסקופ הפוך	Olympus		IX71
טבלה 5. רשימת ציוד.