מאמר שיטה

שימוש Coculture לזהות אינטראקציות interspecies המתווכת כימית

DOI:

10.3791/50863

⸱

31 באוקטובר 2013

1Department of Biology, University of North Carolina at Chapel Hill

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

חיידקים מייצרים תרכובות מופרשות שיש לו את הפוטנציאל להשפיע על הפיסיולוגיה של חיידקי השכנים שלהם. כאן אנו מתארים מסך coculture המאפשר זיהוי של אינטראקציות כאלה interspecies תיווך כימי על ידי ערבוב של חיידקים אדמה עם זני כתב תעתיק ניאון של Bacillus subtilis על תקשורת מוצקה.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בטבע, חיידקים קיימים רק לעתים נדירות בבידוד, הם מוקפים במקום על ידי מערך רחב של מיקרואורגניזמים אחרים המשנים את הסביבה המקומית על ידי הפרשת המטבוליטים. יש מטבוליטים אלה הפוטנציאל לווסת את הפיסיולוגיה ובידול של שכניהם של חיידקים והם גורמים חשובים צפויים בהקמה והתחזוקה של קהילות חיידקים מורכבות. פיתחנו מסך coculture הקרינה מבוססת לזהות אינטראקציות של חיידקים בתיווך כימי מסוג זה. המסך כולל שילוב מתח כתב תעתיק ניאון עם חיידקים סביבתיים על תקשורת מוצקה ומאפשר למושבות לגדול בcoculture. כתב תעתיק הניאון מתוכנן כך שזן החיידקים שנבחר מאיר כאשר הוא מבטא את הפנוטיפ מסוים של עניין (כלומר היווצרות biofilm, נביגה, ייצור גורם ארסיות, וכו '.) הקרנה מתבצעת בתנאי צמיחת wheמחדש פנוטיפ זה לא בא לידי ביטוי (ולכן מתח הכתב הוא בדרך כלל nonfluorescent). כאשר חיידק סביבתי מפריש המטבוליט שמפעיל פנוטיפ הזה, זה מפזר באמצעות אגר ומפעיל את מבנה כתב הניאון. זה מאפשר-ייצור המטבוליט גרימת החיידק כדי להתגלות: הם מושבות nonfluorescent הפרוקסימלי ביותר למושבות ניאון. כך, מסך זה מאפשר זיהוי של חיידקים סביבתיים שמייצרים מטבוליטים diffusible המפעילים תגובה פיזיולוגית מסוימת במתח כתב. פרסום זה דן באופן: א) לבחור תנאי הקרנת coculture מתאימים, ב) להכין את הכתב וחיידקים סביבתיים להקרנה, ג) לבצע את מסך coculture, ד) לבודד משוער גרימת אורגניזמים, וה) לאשר את פעילותם במסך משנית. פיתחנו שיטה זו כדי למסך עבור אורגניזמים אדמה שיפעילו biofilm מטריצת ייצור בsubtilis Bacillus

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנחנו מעוניינים להבין כיצד מטבוליטים שחיידקים מפרישים משפיעים על הפיסיולוגיה והתפתחות של חיידקים שכנים. מטבוליטים רבים כבר מאופיינים לתופעות ביו בחיידקים אחרים. שתי דוגמאות שתוארו היטב כוללות אנטיביוטיקה, אשר לעכב את הצמיחה של חיידקים אחרים, ומולקולות חישת מניין, אשר משנה את ביטוי הגנים העולמי של חיידקים אחרים. עם זאת, חיידקים מייצרים מוצרים רבים אחרים קטנים מולקולה טבעיות שאין להם bioactivities ידוע 1. אנו משערים כי חיידקים התפתחו ונשמרו את היכולת לייצר כמה מטבוליטים אלה משום שהם מאפשרים להם לווסת את הפיסיולוגיה התאית של חיידקי שכניהם בקהילות חיידקים המורכבים שבתוכה רוב החיידקים להתקיים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. בחר גן כתב ולבנות כתב ניאון תעתיק

לsubtilis ב:

  1. ראה מאמר יופיטר בהתייחסות 19 לפרוטוקול המתאר את הבנייה של כתבי תעתיק ניאון בsubtilis Bacillus.

למיני חיידקים אחרים:

  1. לזהות גן שהוגבר במהלך התגובה הפיזיולוגית של עניין. זה יכול להיות מבוסס על ספרות הקיימת או ניתוח תעתיק ש....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מסך זה משמש לזיהוי אורגניזמים אדמה מפריש תרכובות המשנות את הפיסיולוגיה של B. subtilis. התוצאות המתוארות כאן יתמקדו בסוג התא שמייצר מטריצה ​​של B. subtilis, אשר מייצר את החלבון וexopolysaccharide הנדרשים ליצירת biofilm חזקה בחיידק זה. אנחנו בחרנו את האמרגן של אופרון טאפה-sipW-טסה למבנה שלנו ניאון כתב (P טאפה-YFP). אופרון זה מקודד את המרכיב המבני החלבון של מטריקס, והוא שהוגברו במהלך ייצור מטריצת biofilm 23. כתב המטריצה ​​שלנו.......

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אחת המגבלות הטבועות של הפרוטוקול הזה הוא שהוא מסתמך על cultivability של אורגניזמים מיקרוביאלי. כפי שכבר תעד 24 היטב, רוב החיים מיקרוביאליים על פני כדור הארץ לא יכולים (עדיין) להיות מבוגרים בתנאי culturing נחקרו עד כה. לפיכך, מספר עצום של יחסי גומלין בין מינים של חיידקים המתרחשים בסביבה טבעית יהיה ללכת מבלי שיבחינו באמצעות גישה זו. עם זאת, מאחר שהרצון שלנו הוא לזהות לא רק את קיומה של אינטראקציות כאלה, אבל אז גם ללמוד את המנגנונים ומולקולות מעורבים בתיווכם, את היכולת לעבד.......

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחבר מודה רוברטו Kolter (בית הספר לרפואה של אוניברסיטת הרווארד) לקבלת הייעוץ לא יסולא בפזו וסיוע במהלך הפיתוח של מסך coculture זה. היא גם הודות מתיו פאוורס לקריאת כתב היד לבהירות, וChia-יי נג לקבלת סיוע בקבלת איור 6.

....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
ספקטרופוטומטרכל ספקטרופוטומר המסוגל למדוד ערכי OD600 absorbance.
מרק לוריא, לנוקסVWR80017-484ייתכן שיהיה צורך במקורות מדיה חלופיים.
חרוזי זכוכית, 3 מ"מVWR26396-508
קצות טעינת ג'ל,עגולים VWR29442-666
VWR59060-069
סטריאוסקופ ניתוח פלואורסצנטיZeissN/Aהמחבר השתמש בסטריאוסקופ דיסקציה של Zeiss Stemi SV6 עם מקור אור פלואורסצנטי EXFO X-cite 120, קוביית מסנן YFP ארוכת מעבר, אובייקט אכרומט 0.63X, עיניות 10X ו- מצלמה דיגיטלית Axio HRC HR. רוב ההקרנה נעשתה עם תושבת המיקוד ב-2.0-3.2X. כל סטריאוסקופ מנתח עם יכולות פלואורסצנטיות הוא בסדר, בתנאי שיש לך את המסננים הנכונים עבור ה-FP שבו אתה משתמש. עדיף אם יש תריס המאפשר לעבור בקלות בין שדה בהיר לפלורסן, כמו גם במה המאפשרת תאורה מלמעלה ומלמטה. אם אתה רוצה לצלם תמונות, יש צורך גם במצלמה מחוברת.
מוטות זכוכית

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Berdy, J. Bioactive microbial metabolites. J. Antibiot. 58, 1-26 (2005).
  2. Lopez, D., Vlamakis, H., Kolter, R. Generation of multiple cell types in Bacillus subtilis. FEMS Microbiol. Rev. 33, 152-163 (2009).
  3. Vlamakis, H., Aguilar, C., Losick, R., Kolter, R.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

מאמרים קשורים