ייצור RNA לניתוח תעתיקי מגופי תאי נוירון מוטוריים של חוט השדרה של העכבר על ידי לכידת לייזר Microdissection

סיכום

RNA כולל באיכות גבוהה הוכן מגופי תאים של נוירונים מוטוריים של חוט השדרה של העכבר על ידי לכידת לייזר microdissection לאחר הכתמת מקטעי חוט השדרה עם תכלת B ב 70% אתנול. מספיק RNA (~ 40-60 ng) הוא התאושש מ 3,000-4,000 נוירונים מוטוריים כדי לאפשר ניתוח RNA במורד הזרם על ידי RNA-seq ו qRT-PCR.

תקציר

הכנת RNA באיכות גבוהה מתאי עניין היא קריטית לניתוח מדויק ומשמעותי של הבדלים שעתוק בין סוגי תאים או בין אותו סוג תא בבריאות ומחלות או בעקבות טיפולים תרופתיים. בחוט השדרה, הכנה כזו של נוירונים מוטוריים, היעד של עניין במחלות נוירולוגיות ונוירודגנרטיביות רבות, מסובך על ידי העובדה כי נוירונים מוטוריים מייצגים <10% מכלל אוכלוסיית התאים. מיקרו-דיסקציה של לכידת לייזר (LMD) פותחה כדי לטפל בבעיה זו. כאן, אנו מתארים פרוטוקול כדי לשחזר במהירות, להקפיא, סעיף חוט השדרה של העכבר כדי למנוע נזק RNA על ידי RNases אנדוגני אקסוגני, ואחריו כתמים עם תכלת B ב 70% אתנול כדי לזהות את הנוירונים המוטוריים תוך שמירה על RNase אנדוגני מעוכב. LMD משמש לאחר מכן כדי ללכוד את הנוירונים מוכתמים ישירות לתוך מאגר תמוגה guanidine thiocyanate, שמירה על שלמות RNA. טכניקות סטנדרטיות משמשות כדי לשחזר את RNA הכולל ולמדוד את השלמות שלה. חומר זה יכול לשמש לאחר מכן לניתוח במורד הזרם של התמלילים על ידי RNA-seq ו qRT-PCR.

מבוא

ברקמות יונקים המורכבות מסוגי תאים שונים מרובים, הופעתו של מכשור microdissection לכידת לייזר (LMD) אפשרה את האפשרות לבחור סוג תא מסוים לניתוח ברמת RNA או חלבון. כיום, הגברה וטכניקות רצף מהדור הבא מאפשרות שימוש במאגר של RNA כולל מכמה אלפי תאים כדי לקבל מלאי יסודי יחסית של התמלול, כולל הערכה של רמות יחסיות של RNAs וזיהוי של צורות שחבורות שונות. עד כה, ניתוחי פרוטאומיקה של כמה אלפי תאים יגיעו למטה רק דרך מינים שופעים יותר. לדוגמה, זיהינו <1,000 החלבונים הנפוצים ביותר בין 3,000-4,000 גופי תאי נוירון מוטוריים (לא מוצג), ו Zhu ועמיתים לעבודה דיווחו לאחרונה זיהוי 2,665 חלבונים ~ 15,000 תאים סרטניים¹. עם זאת, עם התפתחויות נוספות של ספקטרומטריית מסה, סביר להניח שניתוחים כאלה יתרחבו לעומק גדול בהרבה.

כאן, אנו מציגים פרוטוקול ספציפי המשמש LMD של גופי תא נוירון מוטורי מחוט השדרה של עכברים, ואחריו הכנת RNA. פרוטוקול זה שימש בהקשר של השוואת RNAs מתאי עצב מוטוריים של מוטציה טרנסגנטית טרום-תסמינית סופראוקסיד דיסמוטאז (SOD)1 עכברי טרשת לרוחב אמיוטרופית (ALS) עם RNAs שהוכנו מזן מהונדס SOD1 מסוג פראי על ידי אימות RNA-seq ו- qRT-PCR². יש לציין כי נוירונים מוטוריים, בקרן האצילית של החומר האפור בחוט השדרה, מהווים <10% מכלל אוכלוסיית התאים, מוקפים בים של אסטרוציטים, וככאלה, לא ניתן לזלזל בקלות בפרופיל השעתוק שלהם ממחקרים על חבל הטבור כולו. גישת לכידת לייזר היא אפוא אידיאלית לניתוח ביטוי RNA בתאים אלה, עם פיזיולוגיה השתמרה על ידי כריתה מהירה והקפאה של החוט בעקבות זלוף מלוחים תוך-ארדיאק קצר. סומטה נוירון מוטורי הם גדולים ולכן ניתן לזהות בקלות, כאן באמצעות צבע כי יש זיקה חזקה נוירונים³. בנוסף, עם גודל כזה, תאים אלה מספקים כמות גדולה יחסית של RNA לכל תא שנתפס. ההליך המשמש, כמפורט להלן, יכול להיות מותאם בקלות כדי להשיג סוגי תאים עצביים אחרים, כמו גם סוגי תאים אחרים פוטנציאליים, מזוהה במיוחד על ידי טכניקות כתמי צבע או על ידי כתמי נוגדנים.

פרוטוקול

ההליכים המתוארים כאן להרדמה, המתת חסד וזלוף לב של עכברים בוצעו על פי פרוטוקול שאושר על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים באוניברסיטת ייל.

1. הכנת מכשירים ופתרונות ללא RNase

1. RNase הוא מזהם נפוץ של כל משטחי המעבדה, כולל צמרות ספסל, micropipettes, ואת החוקר.
   1. החלף כפפות לעתים קרובות או לנגב באופן קבוע עם פתרון גמילה RNAse.
   2. כלי ניתוח פלדת אל-חלד וכלי זכוכית יכולים להיות נטולי RNase על ידי חימום ב->200 מעלות צלזיוס למשך שעה או יותר. הערה: עיקור קיטור אינו הורס RNase. לחלופין, יש לנגב בעזרת תמיסת טיהור RNase, ולאחר מכן עם 70% אתנול ללא RNase ויבש באוויר.
   3. לנגב צמרות ספסל, משטחי מעבדה אחרים micropipettors עם פתרון decontaminating RNase, ולאחר מכן עם RNase חינם 70% אתנול. לייעד ספסל מעבדה ספציפי או אזור עבודה להתאוששות וניתוח RNA. הערה: הסר מפלטים קצה לפני ניגוב פירי pipettors ולהשאיר אותם, אם אפשר.
   4. השתמש צינורות, צינורות microcentrifuge, פיפטות, טיפים micropipette המאושרים על ידי היצרן שלהם להיות ללא RNase. מומלץ להשתמש בטיפים ומיקרו-צינורות קשירה נמוכים מאוד. במידת האפשר, השתמשו בקופסאות או בשקיות שנפתחו זה עתה של רכיבים אלה ושמרו אותם בנפרד מאספקת המעבדה הכללית.
   5. השג פתרונות ללא RNase [PBS ללא סידן ומגנזיום (PBS), אתנול, ללא RNase 70% אתנול] ממקורות מסחריים. השתמש בבקבוקים חדשים שנפתחו עבור כל ניסוי.
2. המקור של צבע תכלת B הוא קריטי להתאוששות מוצלחת של RNA שלם. בדוק כל אצווה של צבע לפני ביצוע דגימות יקרות כתמים ואיסוף. לאסוף כמה אלפי נוירונים מבעל חיים שאינו קיים, להכין RNA, ולקבוע את שלמות RNA כמתואר להלן כדי למצוא אחד שמייצר באופן עקבי מספרי RIN מעל 8.5.
   1. להמיס צבע תכלת B (1%, wt / vol) ב RNase חינם 70% אתנול, בדרך כלל 0.3 גרם ב 30 מיליליטר אתנול בצינור צנטריפוגה 50 מ"ל. מערבבים היטב על נדנדה ב RT לילה או עד שכל החלקיקים התמוססו. צינור אחד של פתרון זה יכול לשמש כדי להכתים שקופיות מרובות מבלי להשפיע על עוצמת הכתם.
   2. כאמצעי זהירות, השתמש בצינור אחר של כתם עבור כל שכפול ביולוגי.
3. השתמש cryomolds ו O.C.T. להטמעת מקטעי כבל ללא טיפול נוסף.
4. שמור על cryostat ב -20 עד -24 מעלות צלזיוס. לאחר החיתוך, הניחו את השקופיות במקפיא של -80 מעלות צלזיוס עד שיכינו מספר מספיק. התחל הכנת RNA בהקדם האפשרי לאחר השקופיות נעשו. לאחסון לטווח ארוך, שמור בלוקי OCT לא חתומים או חתוכים חלקית, במקום שקופיות, ב- 80 °C (69 °F).
5. הפוך את החיץ guanidine thiocyanate להכנת RNA מן הנוירונים המוטוריים מנותח באמצעות הפתרונות המסופקים על ידי יצרן ערכת הכנה RNA על פי הוראותיו.

2. הכנת מקטעי חוט השדרה מעכברים (איור 1A)

1. נקה את כל כלי הניתוח, מגלשות הזכוכית, סכיני הגילוח ופלטפורמת הניתוח על-ידי אפייה או ניגוב באמצעות פתרון טיהור RNase, ואחריו אתנול נטול RNase של 70%. תן יבש במשך 2 דקות. שמור על הכל ללא אבק על ידי כיסוי עם מגבוני מעבדה.
2. נהלי טיפול בבעלי חיים, לרבות הרדמה, זלוף לב והמתת חסד, צריכים להתבצע בהתאם לדרישות הוועדה המקומית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC), במטרה להביא במהירות את החיה לנקודה של ניתוח חוט השדרה.
   1. הרדמה את העכבר על ידי הזרקה תוך-אישית (IP) של מנה קטלנית של קטמין (450 מ"ג/ק"ג).
   2. לאחר רמה עמוקה של הרדמה מושגת ומאושרת על ידי חוסר תגובה לצבוט בוהן, למקם את הצד הגחוני של העכבר על פלטפורמת דיסקציה (לוח קלקר, למשל), לפתוח את חלל החזה כדי לחשוף את הלב, ולהכניס את מחט פרפר 27 G של עירוי להגדיר לתוך החדר השמאלי (אשר בצד ימין של החוקר). ניק אטריום הנכון עם מלקחיים חדים, ולעיין עם PBS בקצב של 5-7 מיליליטר / דקה במשך כ 2 דקות באמצעות משאבה peristaltic. הנוזל הזורם מהאטריום צריך להיות נקי ברובו מדם בשלב זה.
   3. הסר את מחט הזלוף, ערף את ראשו של העכבר, ולהפוך אותו על לוח הניתוח. פתח את העור כדי לחשוף את עמוד השדרה, להשתמש במספריים קטנים ומלקחיים כדי להסיר את החוליות, ולהרים את חוט השדרה תוך ניתוק שורשי העצבים עם מלקחיים חדים. מהירות ותרגול חיוניים במעבר מתחילת הזחילה להסרת הכבל; זה צריך לקחת לא יותר מ 7 דקות.
   4. יש לשטוף את חבל הטבור למשך 10 שניות במים נטולי RNase כדי לשטוף כל שאריות דם. הניחו את חוט השדרה על מגלשת זכוכית נטולת RNase עם מלקחיים מעוגלים בעדינות רבה אך במהירות. מחלקים את חוט השדרה רוחבי באמצעות סכין גילוח נקי ל-9-10 חתיכות.
   5. מניחים את החלקים בקריומולד מלא O.C.T. באמצעות אותם מלקחיים, וליישר אותם אנכית באמצעות מחט נקייה. מניחים את התבנית במגש רדוד המכיל 2-מתילבוטאן precooled עם חנקן נוזלי, ולאחר מכן לשים את המגש לתוך אמבט חנקן נוזלי להקפיא במהירות את חתיכות חוט השדרה, כדי למנוע השפלה RNA.
   6. אחסן את הבלוק המוטבע ב- OCT ב- -80 °C (70 °F) למשך עד 6 חודשים לפני החיתוך. התהליך מאחזור של החוט דרך הקפאה צריך להיעשות בתוך 5 דקות כדי לשמור על שלמות RNA.
3. Cryosection O.C.T.-מוטבע בלוק ב -20 °C (70 °F) עם cryostat לייצר פרוסות 20 מיקרומטר, כל אחד מכיל 9-10 חתכים חוט השדרה, על RNase-ללא PEN-קרום 2 שקופיות מיקרומטר שמרו בתחילה בטמפרטורת החדר כדי להבטיח כי החלקים לדבוק במגלשה. מיד להקפיא את החלק על משטח -20 מעלות צלזיוס בתוך cryostat. שמור על השקופיות ב -80 °C (60 °F) עד לשימוש.

3. הכתמת מקטעי חוט השדרה (איור 1A)

1. על מתלה נקי, לסדר שישה צינורות חרוט 50 מ"ל. מלא את כולם עם 25-30 מ"ל של RNase חינם 70% אתנול, כך העומק מספיק כדי לכסות את כל המקטעים בשקופית כאשר השקופית שקועה. הפוך פתרון 30-35 מ"ל של 1% Azure B כמתואר קודם לכן ושמור אותו על אותו ארון תקשורת כדי למזער את הזמן בין שינוי פתרונות במהלך כביסה או כתמים. יש לשמור שלושה או ארבעה מגבוני מעבדה לפני המתלה כדי לנקז את התמיסה הנוספת במהירות.
2. מוציאים את המגלשות מהמקפיא ב-80 מעלות צלזיוס לקרח יבש. להפשיר שקופית אחת על ידי הנחת אותו על כף יד כפפה. הסר את רוב הלחות והתמציתיות בשקופית על ידי ניגובו באמצעות מגבון מעבדה, תוך הקפדה שלא לגעת בקטעים. מניחים את המגלשה על ג'ל סיליקה טרי מיובש בצלחת פטרי במשך 30-40 שניות לייבוש מלא. אם לחות המעבדה גבוהה, ניתן להשתמש בטיפול קצר ביבוש ואקום כדי לייבש את המגלשה מהר יותר.
3. כביסה וכתמים.
   1. טובלים את המגלשה המיובשת לתוך הצינור הראשון של RNase ללא 70% אתנול. השרו את השקופית למשך 30 שניות ולאחר מכן שטפו את השקופית כדי להסיר את ה-OCT על-ידי טבילתה למעלה ולמטה למשך 45-60 שניות . מוציאים את השקופית מהתמיסה ומנקזים את הנוזל העודף על מגבוני מעבדה. חזור על אותו תהליך על ידי טבילת השקופית בצינור השני של 70% אתנול. אם OCT סביב מקטעי חוט השדרה לא נעלם לחלוטין, לחזור על הכביסה בצינור השלישי.
   2. לאחר ניקוז הנוזל העודף, הטביעו את המגלשה בתמיסת Azure B של 1% באתנול נטול 70% RNase למשך 30-45 שניות. מסננים את התכלת העודפת B על מגבון מעבדה; בשלב זה, כל השקופית תהיה כחולה.
   3. להטביע את השקופית בצינור הבא של 70% אתנול, ולטבול למעלה ולמטה במהירות 3-4x כדי להסיר צבע עודף ולהפוך את הכתם נוירון מוטורי ספציפי גלוי. אם החלקים נראים מוכתמים מאוד כהה, לחזור על הצעד destaining בצינור טרי של 70% אתנול. אם הכתמים נראים קלים מדי, החזר את השקופית לפתרון תכלת הרקיע B למשך 30 שניות נוספות וחזור על הביטול. לנגב את האתנול עודף האוויר לייבש את המגלשה במשך ~ 40 שניות עד שכל הנוזל נעלם. החומר האפור יהיה כחול בהיר, ואילו הנוירונים המוטוריים יהיו מוכתמים בכחול עמוק, אשר נראה בקלות. התחל את הניתוח באופן מיידי.

4. מיקרו-דיסקציה של לכידת לייזר (LMD) (איור 1B)

1. הפעל את המיקרוסקופ ולפרוק את מחזיק הצינור כדי לחבר את המכסה של צינור מיקרופוגה 0.6 מ"ל לאיסוף מדגם. שים 30 μl guanidine תיוציאניאט תיסת חיץ לתוך הכובע של צינור 0.6 מיליליטר microfuge. לכסות את פני השטח של הכובע עם נוזל על ידי הפצת הפתרון באמצעות קצה פיפטה. בדרך זו, כל הנוירונים שנאספו יומסו בתמיסה solubilizing כפי שהם מנותחים. יישר את המכסה עם החור והמטרה עם תוכנת המיקרוסקופ. שמור את המכסה במצב המכוסה עד להפעלת לכידת לייזר.
2. הנח את השקופית המיובשת באוויר על במת המיקרוסקופ LMD במהופך, כך שהממברנה של שקופית PEN פונה כלפי מטה. הממברנה עם החלקים צריכה להתמודד עם החור, שמתחתיו צינור האיסוף.
3. הפעל את הלייזר 10 דקות לפני תחילת הכנת שקופית. התמקד בחלק של חוט השדרה עם המטרה 5X. עבור ליעד 20X לניתוח.
   1. סמן אזור "דמה" עם העט הקל ואפשר ללייזר לחתוך אותו מבלי לאסוף אותו. זה מרגיע את קרום PEN ומאפשר לסמן ולחתוך אזורים מרובים ברציפות.
   2. למקד מחדש ולזהות נוירונים מוטוריים באזור קרן הגחון. נוירונים אלה מזוהים לפי מיקומם, המורפולוגיה הפירמידלית שלהם, גודלם הגדול והכתמים הכחולים הכהים שלהם בתכלת B (איור 2).
   3. באמצעות עט האור, בחר את כלי הציור וסמן לאורך קצה הנוירונים המוטוריים, תוך יצירת קו מתאר מלא. נסו להפוך את קווי המתאר קרוב ככל האפשר לנוירון המוטורי כדי למנוע זיהום מתאים שאינם הנוירון המוטורי. (בדוק כמה קטעים מראש כדי לראות כמה רחב קו החיתוך בלייזר ולהתאים את הסיווג לפי הצורך.) סמן תאים מרובים לפני החיתוך; התוכנה תזכור את העמדות.
   4. מביאים את הכובע מתחת לתנוחת החיתוך על ידי לחיצה על מיקום הכובע. לחץ על לחצן התחל כדי ליזום ניתוח נוירון מוטורי עם הלייזר. לאסוף את כל הנוירונים המוטוריים מכל החלקים על שקופית אחת לתוך הכובע של צינור microfuge אחד.
   5. לאחר השלמת האיסוף, מוציאים את צינור המיקרופוגה מהמחזיק על ידי פריקת המגש ועורק בעדינות את הצינור. ממיסים לחלוטין את הנוירונים המוטוריים במאגר על ידי pipetting הפתרון למעלה ולמטה. להעביר את הפתרון לתוך הגוף של הצינור על ידי צנטריפוגה ב 14,000 x g במשך 2 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. להקפיא את המדגם מיד בקרח יבש ולאחסן אותו ב -80 מעלות צלזיוס. תהליך זה, מכתים שקופית דרך אוסף נוירונים מוטוריים, צריך להיעשות בתוך 30 דקות עבור שקופית אחת כדי למזער את השפלת RNA.

5. הכנת RNA מתאי עצב מוטוריים

להפשיר את כל הנוירונים שנאספו מחיה אחת ולאסוף אותם יחד כדי לחלץ RNA. דגימות עשויות להיראות כחול חיוור בהתאם למספר הנוירונים המוטוריים (מוכתמים בתכלת B) בהם. לחלץ RNA באמצעות ערכה מתאימה על פי הפרוטוקול המסופק עבור רקמת LMD, eluting בנפח המינימלי האפשרי. קח 1 μl כדי לבדוק את כמות ושלמות של המדגם. להקפיא במהירות את ה-RNA הנותר על קרח יבש ולאחסן ב -80 מעלות צלזיוס.

6. קביעת איכות וכמות RNA

לקבוע את איכות RNA עם מדגם 1 μl על שבב מיקרופלואידיקה אלקטרופורזה נימי על פי פרוטוקול היצרן. סה"כ הכנות RNA עם מספר שלמות RNA (RIN) מעל 8.5 ניתן להשתמש עבור RNA-seq ו qRT-PCR. פלט הנתונים כולל בדרך כלל גם את הריכוז המשוער של המדגם.

תוצאות

הפרוטוקול המתואר לעיל ובאיור 1 אמור לייצר 50 ng או יותר של RNA הכולל עם RIN של >8.5 מ 3,000-4,000 גופי תאים נוירון מוטוריים חוט השדרה מנותח מן 9-10 20 פרוסות מיקרומטר על כ 20 שקופיות PEN. מכיוון שמספר זה של שקופיות מייצג פחות מ-10% מבלוק מוטבע O.C.T. של חוט השדרה של העכבר, ניתן לחזור לבלוק, אשר אוחסן ב -80 מעלות צלזיוס, ולחתוך פרוסות נוספות כדי לעבור סבב נוסף של הכנת RNA. אם יש צורך בכמויות גדולות יותר של RNA לניתוח, עדיף לעשות רק את מספר השקופיות(למשל 20) בבת אחת שניתן לעבד באמצעות ניתוח והכנת RNA בעוד כמה ימים, ואז לעשות יותר שקופיות לסיבוב שני ולשלב את המוצרים. הקפד לבדוק את RIN של כל הכנה הראשונה, כדי למנוע שילוב של אחד טוב עם רע. שיטות RNA-seq הופכות רגישות יותר וטכנולוגיות PCR חדשות מבטיחות רגישות גבוהה יותר מאלה הנוכחיות. לכן, פחות RNA מגופי תא נוירון פחות יידרש, המאפשר עומק רצף גדול יותר אימות מקיף יותר של להיטים מעניינים. מצד שני, דבקות מלאה בהמלצות MIQE לניתוח qRT-PCR ואימות⁴ עשויה לדרוש כמויות גדולות יותר כדי לאפשר את תגובות הבקרה הדרושות עבור RNAs בשפע נמוך.

איור 2 מציג סדרה טיפוסית של תמונות של חלק מקטע קרן הגחון של חוט השדרה לאחר הכתמת תכלת B וניתוק. בפאנל A, גופי התאים הגדולים והכהים הם נוירונים מוטוריים, שאושרו על ידי מכתמי נוגדנים נגד צ'אט², והם מובחנים בקלות מתאים שכנים קטנים יותר. לוח ב' מציג את אותו אזור עם גופי תאים בודדים המתוארים בעט האור וממוספרים על-ידי תוכנת המיקרוסקופ. קווי המתאר עוקבים מקרוב אחר שולי גופי התאים, עם קצבה קטנה לרוחב החיתוך של הלייזר. מרווח זה צריך להיקבע עבור כל הגדרת כוח לייזר כדי למזער את הכללת חומר חוץ-מחוץ לתחום תוך הימנעות מאובדן ציטוסול נוירון מוטורי. לוחות C ו- D מראים את הקטע לאחר שהלייזר נחתך וגופי התאים הבודדים נפלו לתוך מכסה האיסוף. שים לב כי שולי החיתוך לא בדיוק בצע את קווי המתאר של עט האור בלוח C, אבל בעיקר להישאר מחוץ לו. אי סדירות זו ניכרת בפאנל D, כמו גם האזור החשוך סביב כל חתך, המשקף את נזקי החום לרקמה הנגרמים על ידי הלייזר. בגלל זה, אם שני גופי תאים קרובים מאוד זה לזה, עדיף להתוות אותם עבור חתך אחד, במקום לנסות לחתוך אותם בנפרד ולאבד כמה RNA כדי לחמם נזק באזור שלהם של מגע קרוב.

איור 3 מראה תוצאות אופייניות של ניתוח אלקטרופורטי של שלמות ה-RNA של דגימת RNA שהוכנה מכ-4,000 גופי תאים של נוירונים מוטוריים בעכבר שנאספו על ידי LMD. הלוח העליון הוא electropherogram המיוצר על ידי 1 μl של RNA הכולל; הכניסה מימין היא תמונה של הג'ל. בשניהם, שימו לב לפסגות ה-RNA הריבוזומליות הבולטות. הלוח התחתון הוא האלקטרופרוגרמה של הנתיב המכיל תקני גודל RNA. תוכנת הניתוח חישבה RIN של 9.8 עבור מדגם זה, עם ריכוז של 4.9 ng/μl. סך של 13 μl של פתרון זה היה זמין לאחר הניתוח, מתן 64 ng של RNA עבור אימות qRT-PCR במורד הזרם של כמויות תעתיק. עבור ניתוח qRT-PCR טיפוסי של תעתיקים בשפע בינוני, 0.15-0.20 ng של RNA הכולל מספיק כדי לייצר כמויות מדויקות², ולכן כמות RNA זמין הכנה זו מספיקה כדי לאמת מספר תעתיקים עם ערכות פריימר מרובות, כמומלץ⁴. כמובן, כמויות גדולות יותר של RNA קלט יכול לשמש כדי לאפשר אימות של תעתיקים נדירים. סכום זה הוא גם יותר ממספיק כדי לאפשר הכנת הספרייה ואת הדור הבא RNA-seq.

איור 1. סקירה כללית של ייצור פרוסת חוט השדרה ומיקרו-דיסקציה לכידת לייזר של גופי תאים של נוירונים מוטוריים בחוט השדרה. A) צעדים עיקריים בייצור פרוסות וכתמים. ב)תצוגה מצוירת של קטע חוט השדרה וניתוק לייזר. לחץ כאן כדי להציג תמונה גדולה יותר. 

איור 2. תמונות לפני ואחרי של ניתוח לייזר של גופי תא נוירון מוטורי מוכתם תכלת B. A) חלק מקרן הגחון של קטע מוכתם. שימו לב לארבעת התאים הגדולים והכהים. ישנם גם כמה תאים מוכתמים קלות וקצת יותר קטנים, שאינם נוירונים מוטוריים (שאושרו על ידי כתמי נוגדנים נגד צ'אט; לא מוצגים, אך ראו Bandyopadhyay²) ואשר לא ייבחרו לניתוח. כתמים קטנים וכהים רבים הם כנראה תהליכים עצביים (דנדריטים ואקסונים), אבל זה לא אושר. ב)ארבעת גופי התאים המתוארים בעט האור. שים לב שהקווי המתאר עוקבים מקרוב אחר שולי התאים, עם מרחק מינימלי ביניהם. מרווח זה צריך להיות מבוסס אמפירית עבור כל מיקרוסקופ לייזר. התוכנה ממספרת את הנוירונים הבודדים, מה שמפשט את המעקב אחר כמה נאספו. C ו- D) לאחר הלייזר נחתך ואת החלקים המכילים את גופי התא ירדו לתוך מכסה האיסוף. שים לב שהחור שנותר מאחור גדול במקצת מהקווי המתאר והוא לא סדיר. זה משקף את רוחב קרן הלייזר ואת יעילות החיתוך המשתנה במקצת שלה בהתאם להרכב המקומי של הרקמה. כמו כן ניכר שפת הרקמה הכהה המקיפה כל חור עקב נזקי חימום מקומיים הנגרמים על ידי הלייזר. לחץ כאן כדי להציג תמונה גדולה יותר.

איור 3. ניתוח אלקטרופורטי של שלמות ה-RNA שהוכן מדגימות LMD. A) 1 μl aliquot של RNA מוכן ~ 4,000 גופי תא נוירון מוטורי על ידי הפרוטוקול לעיל נותח על ידי אלקטרופורזה מיקרו-קפילארית על שבב microfluidics. האלקטרופרוגרמה מוצגת, עם פסגות RNA ריבוזומליות בולטות. מימין תמונה של הג'ל עצמו. B) האלקטרופרוגרמה של תקני הגודל מוצגת, עם נתיב הג'ל המתאים מימין. תוכנת המכשיר חישבה RIN של 9.8 עבור מדגם זה וריכוז של 4.9 ng/μl. לחץ כאן כדי להציג תמונה גדולה יותר.

דיון

המדד המשמעותי ביותר של הצלחה של פרוטוקול זה לייצור RNA הכולל על ידי מיקרו-דיסקציה לייזר של פרוסות חוט השדרה הוא ערך RIN⁵. עבור דגימות RNA מאוקריוטים גבוהים יותר, ערכים מעל 8.5 מניבים בקביעות רצף באיכות גבוהה ונתוני qRT-PCR. אם התשואה נמוכה אך האיכות גבוהה, חזור על ההכנה. אם השלמות נמוכה יותר (אפילו 7.5-8), עם זאת, עדיף למצוא את מקור הבעיה ולנסות שוב. ישנם צעדים רבים שבהם משהו יכול להשתבש, אבל באמת רק שני מקורות של הבעיה - זיהום RNase אנדוגני או זיהום RNase אקסוגני. הראשון יכול להיות מטופל על ידי תרגול, כך הזמן מהקרבת העכבר להקפאת כבל O.C.T מוטבע שלה הוא ממוזער. הנקודה השנייה בפרוטוקול שבו RNase אנדוגני יכול לתרום לתוצאה גרועה היא במהלך הכנת הפרוסות. כל פרוסה צריכה לדבוק בשקופית PEN בטמפרטורת החדר במהירות, אך היא תימס (O.C.T מתבהר). ככל שהפרוסה מהירה יותר, כך טוב יותר. cryostat אנו משתמשים יש משטחים שטוחים בתוך התא כי הם ב -20 מעלות צלזיוס, שבו אנו משתמשים כדי להפשיר במהירות את הפרוסה. מצא נקודה דומה cryostat בשימוש ולוודא את הפרוסה הופך אטום שוב במהירות.

מעקב אחר מקורות של RNase אקסוגני יכול להיות קשה, כי יש כל כך הרבה אפשרויות. ריאגנטים רק בשימוש אשר אינם במפורש RNase חינם הם O.C.T. ו תכלת B. אם התכלת B ביצעה באופן משביע רצון בעבר, נסה בקבוק טרי של O.C.T., אם כי מגיב זה מעולם לא היווה בעיה. ריאגנטים ללא RNase ניתן גם להחליף, אפילו מספק אחר. מקור הרבה יותר סביר הוא החוקר. בנוסף לניקוי יסודי של אזור העבודה, זה לעתים קרובות שימושי יש חבר מעבדה אחר בצע יחד ולבחון את כל השלבים בהליך. גם אם זה מישהו שאינו מבצע הליך זה באופן שגרתי, קבוצה חדשה של עיניים עשוי להרים מקור אחר מעיניהם של זיהום.

הרחבת פרוטוקול זה לשחזור RNA מתאי חוט שדרה אחרים, מתאי חוט השדרה ממינים אחרים, או מסוגי תאים ספציפיים באיברים אחרים תדרוש שינויים במספר תחומים המכוונים להשגת זיהוי ברור של תאי העניין תוך ניתוב, או לפחות צמצום, ההשפעה של RNase אנדוגני. בפרוטוקול כאן, הסרה מהירה והקפאה של חבל הטבור, יחד עם כתמי תכלת B ב 70% אתנול, אפשרו הן מזעור של השפלה RNA וזיהוי קל של גופי תא נוירון מוטורי. תכלת B הוא כתם היסטוכימי מבוסס היטב עבור נוירונים שנראה להיקשר RNA³ שימש להערכת תוכן RNA של נוירונים בדגימות נתיחה שלאחר המוות של רקמת המוח מחולים עם מחלה ניוונית⁶. יש לציין כי כתמי תכלת B לא השפיעו על שלמות ה- RNA המטוהר או על יכולתו להיות מתמללים ומנותחים לאחור. צבעים אחרים, כגון קריסיל סגול⁷ וכחול טולואידין⁸ שימשו בפרוטוקולי LMD דומים. איסוף גופי התא ישירות לתוך פתרון thiocyanate guanidine כפי שהם נותחו סיפק את הצעד האחרון שהביא להתאוששות השגרתית של RNA שלם.

גישות דומות ניתן לדמיין עבור תאים ואיברים אחרים, הכרה בכך זיהוי התאים של עניין תוך מזעור או, רצוי, מניעת השפלה RNA על ידי RNases אנדוגני היא הדרישה הקריטית לניתוח מוצלח. ברקמות שיש להן רמות גבוהות של RNase, כגון לבלב, טיפול מהיר וטמפרטורה נמוכה שולבו כדי לאפשר התאוששות של RNA מתאי β, תוך ניצול שפעתם האוטומטית הטבעית להדמיה⁹. נהלים באמצעות כתמי נוגדנים לזיהוי דווחו גם¹⁰, אבל לא הצליחו באופן מלא בידיים שלנו. לבסוף, מודלים רבים של עכבר זמינים המבטאים חלבוני היתוך פלואורסצנטיים(כלומר GFP, YFP, RFP) בתאים מעניינים, אשר יכול לשמש כדי לזהות אותם בחלקי רקמה על מיקרוסקופ LMD. למעשה, זנים העכבר ניתחנו עם פרוטוקול זה להביע חלבון היתוך בין SOD1 ו YFP¹¹, ואת הנוירונים המוטוריים חוט השדרה שלהם הם פלואורסצנטיים מאוד. לא הצלחנו, עם זאת, למצוא קבוצה של שטיפות אתנול ו / או תנאי התייבשות כי בו זמנית להסיר את O.C.T., לעכב את פעילות RNase, באופן עקבי לשמור על פלואורסצנטיות YFP מספיק כדי לאפשר הדמיה של הנוירונים המוטוריים ואת ההתאוששות שלהם על ידי LMD. אולי חלבון פלואורסצנטי חדש או גרסה של אלה הזמינים השומרים על פלואורסצנטיות בממסים אורגניים ניתן למצוא כדי להתגבר על מגבלה זו.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
קטמין	וובסטר וטרינרי	26637041101	כל מקור שאושר על ידי השירות הווטרינרי המוסדי
כלי דיסקציה (מספריים, מלקחיים,  etc.)			כל מקור נוח למכשירי חיתוך איכותיים
Cryostat	Leica Microsystem	CM3050S	קריוסטטים אחרים צריכים להתאים
LMD6000 B	Leica Microsystem		מערכות LMD אחרות לא נבדקו
ללא RNase PEN-membrane 2 μ שקופיות M	Leica Microsystem	11505189	סוגי שקופיות אחרים נבדקו ואינם מתפקדים היטב
ערכת RNeasy Micro (50)	Qiagen	74004	ניתן להשתמש בכל ערכה המשתמשת במאגר ליזה של גואנידין תיוציאנט ונבדקה לשחזור כמויות קטנות של RNA ניתן להשתמש
ב-Agilent 2100 BioAnalyzer	Agilent Technologies	G2939A
Azure B מוסמך	MP Biomedicals	190520	קריטי! מוצר מכל מקור צריך להיבדק לפני השימוש ביכולתו לשמור על שלמות ה-RNA
PBS	Sigma Life Science	D8537	כל מקור אמין של PBS RNA אתנול ללא RNase
70% (מיוצר עם מים מטופלים ב-DEPC)	American Bioanalytical	AB04010-00500	כל מקור אמין, יכול להיות מיוצר במעבדה
מים, ללא RNase, נבדק אנדוטוקסין (מטופל ב-DEPC כדי לחסל RNase)	American Bioanalytical	AB02128-00500	כל מקור אמין, יכול להיות תוצרת מעבדה
RNase AWAY	Invitrogen Life Technologies	10328-011	ניתן להשתמש בריאגנטים דומים אחרים להסרת RNase, כגון RNaseZAP (גם מ- Invitrogen)
2-מתילבוטן	מדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית	78-78-4	כל מקור
צינורות מיקרופוגה לשחזור מקסימום (0.6 ו-1.5 מ"ל) וקצות פיפטה	Axygen	311-03-051 & 311-09-051	שימור נמוך במיוחד, צינורות וטיפים ללא RNase; בדוק מוצרים של יצרנים אחרים לפני השימוש
ב-O.C.T. Compound	Tissue-Tek	4583
Cryomold מגבוני	בינוני-Tek	4566
(Kimwipes)	KIMTECH	34155