FIBS מאופשר פולשנית מטבולית פרופיל

סיכום

תיאור כיצד לכייל את חיישני העברת פורסטר התהודה האנרגיה משולבים ביולוגיים (FIBS) בפרופיל מטבולי אתר מוצג. FIBS ניתן להשתמש כדי למדוד את הרמות תאית של מטבוליטים noninvasively סיוע בפיתוח מודלים מטבוליים והקרנת תפוקה הגבוהה של תנאי Bioprocess.

תקציר

בעידן של ביולוגיה חישובית, מערכות ניסיוניות תפוקה גבוהה חדשות הן הכרחיות על מנת לאכלס ולשפר דגמים, כך שהם יכולים להיות תוקף למטרות חזויה. באופן אידיאלי מערכות כאלה יהיו בנפח נמוך, שאינו מאפשר ניתוח דגימה והרסני כאשר הנתונים כמובן זמן הם כדי להתקבל. מה שדרוש הוא בכלי ניטור אתר שיכול לדווח את המידע הדרוש בזמן אמת וnoninvasively. אופציה מעניינת היא השימוש בניאון, בחיישנים ביולוגיים vivo ככתבים של ריכוזים תאיים המבוסס על חלבונים. סוג מסוים אחד in vivo biosensors כי יש למצוא יישומים בכימות המטבוליט מבוסס על העברת פורסטר התהודה אנרגיה (סריג) בין שני חלבוני ניאון מחוברים על ידי תחום מחייב ליגנד. סריג חיישנים משולבים ביולוגיים (FIBS) מיוצר constitutively בתוך הקו הסלולרי, יש להם זמני תגובה מהירה וצ'ה הרפאים שלהםracteristics לשנות מבוסס על הריכוז של המטבוליט בתוך התא. במאמר זה, השיטה לבניית השחלה אוגר סינית (CHO) שורות תאים שconstitutively להביע FIBS לגלוקוז וגלוטמין וכיול FIBS in vivo בתרבית תאים אצווה על מנת לאפשר כימות עתיד של ריכוז המטבוליט תאיים מתוארת. נתונים מתרביות תאים האכילו אצווה CHO מוכיחים כי FIBS הצליח בכל מקרה כדי לזהות את השינוי וכתוצאה מכך הריכוז תאיים. השימוש באות הניאון מהשקרים ואת עקומת הכיול שנבנה בעבר, הריכוז תאיים היה מדויק ייקבע כפי שאושר על ידי assay אנזימטי עצמאי.

מבוא

יש ניטור המטבוליט יישומים שונים בbioprocessing, כוללים פיתוח תהליך, תקשורת ועיצוב מזון, והנדסה מטבולית. שיטות שונות זמינות עבור מדידות ריכוז באמצעות האנזימטית ^{1, 2} כימי, או מבחני מחייבים ^3. אופציה מעניינת היא השימוש בניאון, בחיישנים ביולוגיים vivo ככתבים של הריכוז תאיים של מטבוליטים מפתח המבוסס על חלבונים. במבחני נפח נמוכים במיוחד, הקרינה היא כלי נוח כמו מזעור ממש משפר את ^4,5 יחס אות לרעש וחיישנים המבוססים על חלבונים יכולים להיות מקודד גנטי משמעות שאין חומרים כימיים אקסוגניים נחוצים לניתוח המטבוליט. biosensors העברת פורסטר התהודה אנרגיה (סריג) מורכב משני חלבוני ניאון מחוברים על ידי תחום מחייב ליגנד. סריג הוא העברת nonradiative של אנרגיה מתורם צילום נרגש locat מולקולת ניאון acceptor אד בסמיכות (<100). מחשוף יגנד או מחייבים גורם לשינוי קונפורמציה בחיישן, אשר, בתורו, גורם לשינוי בקרבתו של fluorophores, מה שמוביל לשינוי בסריג יעילות שנמדד על ידי השינוי בספקטרום הפליטה. חיישני סריג משולבים ביולוגיים (FIBS) מיוצרים constitutively בתוך קו התא והמאפיינים ספקטרליים שלהם לשנות מבוססים על הריכוז של המטבוליט בתוך התא. יש לי FIBS זמני תגובה מהירה שהופך אותם אידיאליים עבור מדידות לדגמים דינמיים ^6. יישומים קודמים כוללים ניטור אחת ^7-9 ומרובים ¹⁰ מטבוליטים ומספקים נתונים על חלוקת spatiotemporal ^11. ניתן ליצור FIBS בשתי תצורות: Apo-מקס, שבו ליגנד מחייב משבש את הקרבה של fluorophores הפחתת העברת אנרגיה וApo-מינ ', שבו ליגנד מחייב מביא שני fluorophores במגע קרוב יותר (איור 1).

_content "> בעבודה זו, פרוטוקול שהוצג לבניית השחלה אוגר סינית (CHO) שורות תאים שconstitutively להביע FIBS למטבוליט, גלוקוז או גלוטמין. המתודולוגיה הוא הוקם עבור הכיול של החיישן in vivo כדי לאפשר כמותיים עתיד מדידות של ריכוז המטבוליט תאיים, כפי שהוצגו באיור 2. על בסיס זה, הריכוז תאיים של גלוקוז או גלוטמין ניתן לקבוע בתרביות תאים שייזונו אצווה CHO, שלשני חומרים מזינים נוספו בריכוזים גבוהים בתהליך. התוצאות להוכיח כי שימוש באות הניאון מהשקרים ואת עקומת הכיול שנבנה בעבר, בצורה מדויקת חיזוי של הריכוז תאיים הוא אפשרי, כפי שאושר על ידי assay אנזימטי עצמאי. שיטה זו מציעה יתרונות משמעותיים על פני טכנולוגיות אנליטיות הנוכחיות משום שהיא עלות נמוכה לא פולשנית, ומהיר, נותן אות של FIBS שיכול להיות יום שני בזמן אמתitored לאורך כל התרבות.

פרוטוקול

1. תחיית שורת תאים ותחזוקה

1. להחיות תאי CHO ב9 מיליליטר בינוני CD-CHO בתוספת 8 מ"מ L-גלוטמין ו10 תוסף מיליליטר / L hypoxanthine 100x / תימידין (מדיום גידול שלם).
2. צנטריפוגה ב 5 דקות 100 XG.
3. Resuspend התאים 10 מיליליטר של מדיום גידול שלם טרי.
4. הסר מדגם 1 מ"ל ולקבוע את ריכוז תאי קיימא על ידי מיקרוסקופ אור בשיטת הרחקת צבע הכחולה trypan בhemocytometer.
5. ליזום תרבות בצפיפות זריעה של 3 x 10 ⁵ תאים / מיליליטר ב125 מיליליטר לנער צלוחיות.
6. לשמור על התרבות בחממה על 37 מעלות צלזיוס, אווירת humidified של 5% CO _2, על פלטפורמה רועדת מסלולית מסתובבת ב120 סל"ד.
7. תת כל 3-4 ימים במדיום גידול המלא בצפיפות זריעה של 2 x 10 ⁵ תאים / מיליליטר.

2. Transfection של הקו הסלולרי עם פלסמיד Containing ג'ין Biosensor

1. הכן את ה-DNA פלסמיד באמצעות ערכת טיהור פלסמיד בקנה מידה גדולה.
2. שמור על תאים בתנאים המתאימים (37 ° C CO, 5% ₂₎ 12-24 שעה לפני transfection כדי להבטיח את התאים באופן פעיל בחלוקה בזמן של transfection.
3. ספירת התאים באמצעות שיטת הדרת צבע הכחולה trypan, ואז להכין עבודה נפח 20 מיליליטר של תרבית תאים ב125 מיליליטר ללחוץ את הבקבוק בריכוז של 1 x 10 ⁶ תאים / מיליליטר.
4. השתמש בערכת transfection מתאימה לשורת התאים בשימוש. פלסמיד דנ"א יחס ריאגנטים transfection יהיה תלוי בקו הסלולרי וקטורית. מומלץ כי זה מותאם על ידי בדיקת טווח של יחסים בטווח שצוינו על ידי היצרן לפני ביצוע transfections הסופי. כמו כן לשמור על תרבות ביקורת שלילית לפחות אחד המכילה את התאים, אך לא ה-DNA.
5. דגירה של 4 ימים במצב סטטי ולאחר מכן להעביר לשאקיפלטפורמת ng מסתובבת ב125 סל"ד.
6. הוסף את האנטיביוטיקה המתאימה לבחירת פלסמיד לריכוז מתאים כפי שנקבע על ידי עקומה להרוג. במחקר זה, Zeocin התווסף לריכוז סופי של 400 מיקרוגרם / מיליליטר לבחירה של תאי transfected.
7. שינוי בתקשורת במרווח זמן מתאים לשורת התאים, והוסיף אנטיביוטיקה בכל פעם, עד שתאים ובשליטתם מתו.
8. השתמש בבארות המחוברות ביותר כדי להתקדם לטלטול תרבויות.
9. להקים בנק תא על ידי הקפאת התאים בבקבוקונים המכילים קריוגני 10 ⁷ תאי קיימא ב 1 מיליליטר של תערובת הקפאה. בעבודה זו, זה מורכב מ92.5% מדיום גידול ו7.5% sulfoxide דימתיל.

3. אצווה ועקומת גדילה תאי הפד אצווה

1. עקוב אחר הוראות לתחזוקת תא שמעל להקים תרביות תאים שלושה עותקים של תאי CHO transfected ב250 מיליליטר לנער צלוחיות עם נפח עבודה של 50 מיליליטר.
2. לשמור cultuמיל בחממה humidified תא על 37 מעלות צלזיוס, עם 5% CO _2, על פלטפורמה רועדת מסלולית מסתובבת ב125 סל"ד, ולהסיר 4.1 מיליליטר דגימות מכל תרבות גדלה ב24 מרווחי שעה.
3. שימוש במדגם 100 μl כדי לקבוע את כדאיות ריכוז תא ותא קיימא עם שיטת הדרת צבע הכחולה trypan.
4. חזור על פעולה עד ריכוז תאי קיימא מצטמצם לאפס.
5. חזור על פעולה עבור תרביות תאי הפד אצווה להשלים עם הכמות המתאימה של גלוקוז או גלוטמין ביום 6 לשחזר ריכוזיהם לערכיהם הראשוניים של 36 מ"מ ו 4 מ"מ, בהתאמה. מומלץ תרבויות שליטה נוספת גם נשמרות, שהם שיאכילו עם אותו הנפח (12 מיליליטר במקרה זה) של מים טהורים.

4. סריג מדידות יחס

1. קח 2 מיליליטר של הדגימות יומיות הוסר בשלב 3.2 לעיל וצנטריפוגות ב 5 דקות 100 XG ב 4 ° C.
2. Resuspסיימתי את התא גלולה ב 2 מיליליטר של תמיסת מלח קרח קר פוספט (PBS). העבר את זה לצלחת 6 היטב ולהוסיף מדגם ריק המכיל לא תאים לאחד טוב.
3. מדוד את רמות הקרינה כחולה וצהובה באופן מיידי בגל עירור של 430/435 אורכי גל nm ופליטה של ​​465/435 ננומטר (כחול) ו520/510 ננומטר (צהוב).
4. לחשב את יחסי סריג (יחס של הקרינה צהובה זוהתה על הקרינה כחולה המזוהה).

5. המטבוליט מבחני

1. קח 2 מיליליטר של הדגימות יומיות הוסר בשלב 3.2 לעיל וצנטריפוגות ב 5 דקות 100 XG ב 4 ° C. הסר את supernatant.
2. Resuspend התא גלולה ב 3 קרח מיליליטר PBS הקר ו צנטריפוגות שוב בדקות 5 100 XG.
3. הסר את supernatant ו resuspend התא גלולה ב 3 מיליליטר PBS הקר הקרח כאמור לעיל. Sonicate 5x המדגם עבור 3 דקות כל אחד בדופק של 15 שניות וב15 שניות משם. בשלב זה, התא נוסףCTS עשוי להיות מוקפא אם תרצה בכך.
4. השתמש בערכת assay גלוקוז מתאימה לפי הוראות היצרן על דגימות של תמציות תא כדי לקבוע את ריכוז הגלוקוז התוך התאי (ראה טבלה של חומרים).
   הערה: השתמש בסטנדרטים מתאימים לבניית עקומת סטנדרט. בעבודה זו, הריכוז של סטנדרטים נע בין 0-100 מ"מ.
5. שימוש בקריאה לסטנדרטים, לבנות את עקומת הסטנדרט ולמצוא את המשוואה ליניארית בכושר הטוב ביותר (במקרה זה: y = 1310.51x - 723.43 בי y הוא קריאת הספיגה וx הוא ריכוז גלוקוז).
6. חשב את ריכוזי הגלוקוז באמצעות עקומת הסטנדרט ולוקח את הדילול בחשבון. ריכוז הגלוקוז התוך התאי ואז יכול להיות מחושב באמצעות המשוואה הזאת:
   
   לתאי CHO, אחד נפח התא חושב באמצעות קוטר תא של 12 מיקרומטר ¹²
7. השתמש בערכת assay גלוטמין מתאימה לפי הוראות היצרן על דגימות של תמציות תא כדי לקבוע את ריכוז גלוטמין תאיים (ראה טבלה של חומרים).
   הערה: השתמש בסטנדרטים מתאימים לבניית עקומת סטנדרט. בעבודה זו, הריכוז של סטנדרטים נע בין 0-2 מ"מ.
8. כמו ב5.5 לעיל, לבנות את עקומת הכיול (במקרה זה y = 203.1x + 17.1 בי y הוא קריאת הספיגה וx הוא ריכוז גלוקוז)
9. באמצעות עקומת הסטנדרט, לחשב את ריכוז גלוטמין של הדגימות, לוקח את הדילול בחשבון. ריכוז גלוטמין תאיים יכול להיות מחושב באמצעות משוואה 1 לעיל.

תוצאות

סקירה של המתודולוגיה מוצגת באיור 2. בעבודה שהוצגה במסמך זה, תאי CHO היו transfected עם וקטור השקרים ושורות תאי יציבות נבחרו בלחץ אנטיביוטי של 400 מיקרוגרם / מיליליטר Zeocin. שתי שורות תאי יציבות נפרדות constitutively מבטאות את חיישני גלוקוז וגלוטמין נוצרו לכן. איור 1 מתאר את התצורות של שני biosensors שימש במחקר זה. חיישן גלוקוז מבוסס על עיקרון Apo-מקס ופלסמיד המתאים הוא pRSET-FLIPglu600μΔ11Aphrodite. זו היא שילוב של החלבון המשופר ציאן הניאון (ECFP...

דיון

FIBS לאפשר in vivo ו בquantitation באתרו של מולקולות מרכזיות, במקרה זה חומרים מזינים הגבלת צמיחה, הסרת אי ודאות הנובעת ממרווה ומיצוי שיטות. הממצאים מראים כי קיים מתאם טוב בין אות שקרים ואת הריכוזים תאיים בטווח של 1-5 מ"מ לגלוקוז ו0.3-2 מ"מ לגלוטמין. בתרבית תאים אצווה CHO, ריכוזים אלה נתקלו בשלבי הירידה מעריכית, נייחים, ומוקדם. שלבי מעריכי ונייחים הם הקריטיים ביותר במונחים של העיצוב של אסטרטגיות האכלה מתאימות; שימוש biosensors אלה להערכת דרישות חילוף החו...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
CHO-S Cells	Life Tecnologies	11619-012	קו התאים ישתנה בהתאם למטרות המחקר
pCDNA4/TO וקטור			טכנולוגיות חיים
TransIT-PRO מגיב טרנספקציה	Mirus Bio	MIR 5700	ניתן לבצע טרנספקציות באמצעות כל שיטה המתאימה לקו התאים הנחקר
Zeocin	Invivogen
CD-CHO מדיום	חיים	טכנולוגיות חיים 10743-011	מדיום גידול תאים תלוי בתאים הנחקרים
100x HT Supplement	Life טכנולוגיות	11067-030
L-גלוטמין 200 מ"מ (פי 100),	טכנולוגיות חיים נוזליות	25030032
קורא צלחות InfinitePRO 200	Tecan	FLx800TBI	ניתן להחליף כל קורא צלחות פלואורסצנטי בעל 96 בארות שיכול לגשת לאורכי הגל הנדרשים
מסננים לקורא צלחות	Tecan	30000463
Maxiprep ערכת טיהור פלסמיד	Qiagen	12163	ניתן להחליף כל ערכה מתאימה
בדיקת גלוקוז/גלוקוז אוקסידאז אדום	Amplex Invitrogen	A22189	ניתן להחליף כל ערכה מתאימה
EnzyChrom  ערכת בדיקת גלוטמין	BioAssay Systems	EOAC-100	ניתן להחליף כל ערכה מתאימה
משופר Neubauer hemocytometer	Fisher Scientific	MNK-420-010N
Incubator	נואיר	NU-5510E