Method Article

Assay עקידת התפוקה גבוה MHC II לניתוח כמותי של פפטיד אפיטופים

DOI:

10.3791/51308

March 25th, 2014

In This Article

Erratum Notice

Important: There has been an erratum issued for this article. Read More ...

Erratum

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Formal Correction: Erratum: A High Throughput MHC II Binding Assay for Quantitative Analysis of Peptide Epitopes
Posted by JoVE Editors on 3/18/2019. Citeable Link.

An erratum was issued for: A High Throughput MHC II Binding Assay for Quantitative Analysis of Peptide Epitopes.  There were typos in the Protocol section and Table 2.

Step 3.1.1 in the Protocol was updated from:

Add 80 µl of 1 mM Pefa Bloc and 60 mg of octyl-β-D-glucopyranaside to 3,920 µl of Citrate Phosphate Buffer. (See supplemental spreadsheet calculator for alternative scaling).

to:

Add 80 µl of 1 mM Pefa Bloc and 60 µg of octyl-β-D-glucopyranaside to 3,920 µl of Citrate Phosphate Buffer. (See supplemental spreadsheet calculator for alternative scaling).

Step 5.2 in the Protocol was updated from:

Further dilute the Control Peptide from step 5.1 (20 mM) 1:100 into the MHC II Master Mix from step 3.2.

to:

Further dilute the Control Peptide from step 5.1 (20 µM) 1:100 into the MHC II Master Mix from step 3.2.

Table 2 was updated from:

MHC II Allele DRB1*:1501
MHC II Stock Concentration (mg/ml)1.3
MHC II Stock Concentration (mM)20
Vol. MHC II Stock to Add (ml)14.65
Vol. Reaction Buffer to Add (ml):2885.35
MHC II Master Mix Concentration (nM)101

to:

MHC II Allele DRB1*:1501
MHC II Stock Concentration (mg/ml)1.3
MHC II Stock Concentration (μM)20
Vol. MHC II Stock to Add (μl)14.65
Vol. Reaction Buffer to Add (μl):2885.35
MHC II Master Mix Concentration (nM)101

Summary

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מבחני ביוכימיים עם מולקולות MHC II רקומביננטי אדם יכולים לספק תובנות מהירים, כמותיים לזיהוי אפיטופ immunogenic, מחיקה, או עיצוב. הנה, assay מחייב פפטיד-MHC השני טיפס לצלחות 384 גם הוא תאר. פורמט חסכוני זה צריך להיות שימושי בתחומי deimmunization חלבון ועיצוב חיסון ופיתוח.

Abstract

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מבחני ביוכימיים עם מולקולות MHC II רקומביננטי אדם יכולים לספק תובנות מהירים, כמותיים לזיהוי אפיטופ immunogenic, מחיקה, או עיצוב 1,2. הנה, assay מחייב פפטיד-MHC II ישתנה לפורמט 384 גם. פרוטוקול scaled למטה מפחית עלויות מגיב על ידי 75% ותפוקה גבוהה יותר מאשר שתואר קודם לכן פרוטוקולי 96 היטב 1,3-5. באופן ספציפי, תכנון הניסוי מאפשר ניתוח חזק ושחזור של עד 15 פפטידים נגד אחד אלל MHC II לכל צלחת ELISA 384 גם. באמצעות רובוט טיפול נוזל יחיד, שיטה זו מאפשרת לחוקר אחד כדי לנתח כ תשעים פפטידים מבחן בשלושה עותקים על פני טווח של שמונה ריכוזים וארבעה סוגי MHC II אלל בפחות מ 48 שעות. אחרים עובדים בתחומי deimmunization חלבון או עיצוב ופיתוח חיסון עשויים למצוא את הפרוטוקול כדי להיות שימושי בהנחיית העבודה שלהם. בפרט, הוראות והפורמט ויזואלי צעד אחר צעדשל יופיטר צריך לאפשר למשתמשים אחרים, כדי לקבוע במהירות ובקלות במתודולוגיה זו במעבדות שלהם.

Introduction

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

חלבונים הם ברמת הצמיחה המהירה ביותר של סוכנים טיפוליים 6, וההתרחבות המהירה של צינורות biotherapeutic התמקדה תשומת לב הולכת וגובר על האתגרים הקשורים בהתפתחות ושימוש בתרופות חלבון. שיקול אחד ייחודי נובע מהעובדה כי במערכת חיסונית בריאה ומתפקדת, כל החלבונים תאיים נדגמים על ידי תאי המציגים אנטיגנים (נגמ"שים). הפנים פעם על ידי נגמ"שים, חלבון הוא ביקע לרסיסי פפטיד קטנים, ומגזרי immunogenic משוערים נטענים לתוך החריץ של הכיתה השנייה חלבונים עיקריים histocompatibility המורכבים (MHC II). פפטיד-MHC II מתחמים לאחר מכן מוצגים על פני APC, ופפטידים immunogenic אמיתיים, המכונים אפיטופים תא T, יצירת קומפלקסי קולטן תא משולש MHC II-pept....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ארבע פעילויות עיקריות מרכיבות את assay מחייב פפטיד-MHC II: 1-איגוד: פפטידים מבחן להתחרות עם פפטידים שליטה שכותרתו עבור שלב פתרון מחייב של חלבוני MHC II מסיסים. כריכה נמדדת על פני טווח רחב של ריכוזי פפטיד בדיקה. 2-Capture: לאחר התגובה מחייבת גישות שיווי משקל, פפטיד-MHC II מתחמים נלכדים ומופרד מפפטיד מאוגד וחלבון על ידי הכרת קונפורמציה תלויה עם נוגדן משותק. 3 איתור: פפטיד שליטה שנתפס הוא כמותית זוהה באמצעות הקרינה זמן נפתר. 4 ניתוח-: נתונים ספקטרליים מעובדים, זממו ונותחו כדי לקבוע מאפיינים המחייבים תלוי מינון של הפפטיד מבחן וחלבונים MHC II.

בשלבים שונים בהליך של....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

רצף פפטיד הבוגר של Enterobacter P99 cloacae בטא lactamase (BLA) (# X07274.1 GenBank ID) נותח עם ProPred 16 לקלסרים פפטיד המשוערת לMHC II אלל DRB1 * 1501 (לוח 4). ProPred זיהה 117 פפטידים nonamer עם שאריות עוגן P1 חובה (כלומר, M, L, I, V, F, Y או W בעמדה 1, אשר נדרש עבור MHC II מחייב ביום 31). בסף של 5%, פפטידים עם ציונים גבוהים או שווה ל2.6 צפויים קלסרים בלבד. לפיכך, על סף 5%, רק 11 פפטידים העליונים הם חזו לאגד DRB1.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biotherapeutics הקימו את עצמם כפינה של רפואה המודרנית, המייצג את ארבעה מחמש התרופות הנמכרות ביותר בשנת 2012 32. Biopharmaceutics המגזר הראה צמיחה מתמשכת במשך כמה שנות 6, והפיתוח המתמשך של סוכני רומן, כמו גם את הופעתה של biosimilars הרחיב צינורות ביולוגיות. במבט לעתיד, הערכה ומקלי immunogenicity של חלבון הרפוי תהפוך לחלק בלתי נפרד מפיתוח biotherapeutic שלב מוקדם. כדי להקל על התהליך, biotechnologists יכול להיעזר בשיטות חישוביות לחיזוי epitope 16-22, .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

לאונרד מואיז הוא מועסק על ידי ומחזיק באופציות מניות בEpiVax, Inc, חברת הביוטכנולוגיה בבעלות פרטית הממוקמת בפרובידנס, רוד איילנד. העבודה הכלולה בדוח מחקר זה היא חופשי מכל הטיה שעלולה להיות קשורות למטרות מסחריות של החברה.

Acknowledgements

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי מענקי NIH R01-GM-098,977 וR21-AI-098,122 לCBK וחבית. RSS נתמך בחלקו על ידי לוס קרן מלגה ובחלקו על ידי מלגת תייר חדשנות תכנית מבית הספר תאייר להנדסה.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
נתרן טטרבוראט דקהידראטסיגמא221732
חומצת לימוןסיגמאC1901
נתרן פוספט דו-בסיסיסיגמאS7907
Trizma הידרוכלורידOmniPur9310
טווין-20סיגמאP7949
100% DMSOסיגמאD8418
אוקטיל-& beta;-D-GlucopyranasideFischer29836-26-8
Pefa Bloc SCFRoche1158591600
Dulbecco' s 10x פוספט מאגר מלחInvitrogen14200-166
DELFIA מאגר מבחןPerkin Elmer4002-0010
DELFIA Enhancement BufferPerkin Elmer4001-0010
Europium Labeled StreptavidinPerkin Elmer1244-360
L243 נוגדן נגד HLA-DRBiolegend307602
Biotinylated פפטידים עוקביםמהמאה ה-21 פפטידיבהזמנה
(1-4 מ"ג, 85% טוהר)מונומריםמטוהרים בהזמנה
(לא ביוטיניליים)מכון המחקר בנארויה*הזמנה
של 384 בארות צלחת EIA/RIA לבנהתרמו460372
פוליפרופילן 384 בארותצלחת Costar3656
פילם, AxySeal, 80 ומיקרו; מ, אליסה אפליקטור  Axygen AscientificPCR-SP
MilliQ WaterN/AN/A
Epimotion Liquid Handler (או דומה)Eppendorf5075
Select TS מכונת כביסה צלחות (או דומה)BioTek405
SpectraMax Gemini Microplate Reader (או דומה)התקנים מולקולרייםN/A
*ניתן להשיג מולקולות MHC II אנושיות רקומביננטיות ממעבדת הליבה של Benaroya Tetramer.  ראה: https://www.benaroyaresearch.org/our-research/core-resources/tetramer-core-laboratory
בדיקה אישית של ביוכימיקלים HLA-DRB1 מותאמת אישית של Genscriptמותאמת אישית

References

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Steere, A. C., et al. Antibiotic-refractory Lyme arthritis is associated with HLA-DR molecules that bind a Borrelia burgdorferi peptide. J. Exp. Med. 203, 961-971 (2006).
  2. Raddrizzani, L., et al.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

MHC II Binding AssayPeptide Epitope AnalysisHigh Throughput ELISASolution Phase CompetitionTime Resolved FluorometryPeptide MHC II ComplexImmunogenic Epitope IdentificationProtein DeimmunizationVaccine DesignLiquid Handling Robot

Related Articles