מאמר שיטה

שחזור נפח היסטולוגיה 3 ממדים ויישומו לחקר מאוס החלב בלוטות

14.1K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/51325

⸱

26 ביולי 2014

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medical Biophysics, University of Toronto, 2Platform Biological Sciences, Sunnybrook Research Institute, 3Department of Laboratory Medicine and Pathobiology, University of Toronto, 4Physical Sciences, Sunnybrook Research Institute, 5Department of Pathology and Laboratory Medicine, Medical University of South Carolina, 6Manitoba Institute of Cell Biology, University of Manitoba

במאמר זה

סיכום

אנו מציגים גישת רישום תמונה לשחזור נפח היסטולוגיה תלת מימדית (תלת מימדית), המאפשרת לחקור את השינויים של איבר ברמת מבני המאקרו המורכבים מתאים. באמצעות גישה זו, חקרנו את השינויים התלת-ממדיים בין בלוטות חלב מסוג בר לבלוטות חלב Igfbp7-null.

תקציר

שחזור היסטולוגיה נפח מאפשר המחקר של צורת 3D ושינוי נפח של איברים ברמה של macrostructures המורכב של תאים. זה גם יכול לשמש כדי לחקור ולאמת את טכניקות חדשניות ואלגוריתמים בתחום הדמיה רפואית נפחית וטיפולים. יצירת אטלסים ברזולוציה גבוהה 3D של איברים שונים 1,2,3 היא יישום אחר של שיקום היסטולוגיה נפח. זה מספק משאבים לחקירת מבני רקמות והיחסים מרחביים בין תכונות תאיות השונות. אנו מציגים גישת רישום תמונה לשיקום היסטולוגיה נפח, אשר עושה שימוש בסט של תמונות blockface אופטיות. משוחזר היסטולוגיה הנפח מייצג צורה אמינה של דגימת מעובד ללא שגיאות רישום שלאחר עיבוד מופץ. סעיפי hematoxylin ו eosin (H & E) המוכתמות של שתי בלוטות החלב עכבר נרשמו לתמונות blockface המקבילה שלהם באמצעות נקודות גבול שחולצו מן edGES של הדגימה בתמונות היסטולוגיה וblockface. הדיוק של הרישום הוערך באופן חזותי. היישור של macrostructures של בלוטות החלב הוערך גם מבחינה ויזואלית ברזולוציה גבוהה.

מחקר זה מתאר את השלבים השונים של צינור רישום תמונה זו, החל מכריתה של בלוטת החלב ועד לשחזור היסטולוגיה נפח 3D. בעוד תמונות היסטולוגיה 2D לחשוף את ההבדלים המבניים בין הזוגות של חלקים, 3D היסטולוגיה נפח מספק את היכולת לדמיין את ההבדלים בצורה ובנפח של בלוטות החלב.

מבוא

IGFBP7 (אינסולין כמו גורם גדילת חלבון מחייב 7) הוא חבר של משפחת החלבון קושר IGF, והוכח להיקשר לקולטן IGF1 4. למטה רגולציה של IGFBP7 ידועה להיות מתואם עם פרוגנוזה גרועה בסרטן השד 5, ואילו החידוש של IGFBP7 במודלי גידול xenograft מאוד מעכב את גידולי צמיחת 6 באמצעות אינדוקציה של אפופטוזיס והזדקנות תאית 7. כדי לחקור את ההשפעות של IGFPB7, עכבר Igfbp7-null נוצר 5 (נתונים שלא פורסמו). בעוד עכברים אלו לא לפתח גידולים, הם מראים שינויים בהיסטולוגיה של השחלה, שריר ובכבד, כמו גם ליקויים בדפוסי החלב בלוטה התפתחותית (נתונים שלא פורסמו). פנוטיפ הפגום צוין ראשון כמו שיש לי העכברים null גדלי המלטה קטנים יותר ואינם מצליח לשמור על המלטות מרובות גדולות (נתונים שלא פורסמו).

יש לי כרכי היסטולוגיה 3D הפוטנציאל לספק informat שימושייון לניתוחים והערכה כמותית והשוואתיים של ממצאים פתולוגיים בתמונות רפואיות נפחית. confocal תלת ממדים, שני הפוטונים במיקרוסקופ יכול לספק מידע מורפולוגי של תאים ברזולוציה גבוהה של הבלוטה ב14 מידה מקומית, אבל יש לו שדה ראייה מוגבל ועומק. שחזור היסטולוגיה נפח מספק מידע נוסף על מרחבי מידה גדולה הרבה יותר. תוך שימוש בגישות מסורתיות כמה עיוות צפויה במהלך תקופת ההכנה של סעיפים היסטולוגית, כגון התכווצות, התרחבות, דמעות, וקפלים. עיוותים אלה מקשים לרשום תמונות היסטולוגית סידוריים לתוך ערימת 3D לשחזר נפח 3D. ככל שמספר סעיפים ברציפות עם מומים מגדיל את הדמיון בין סעיפים בשלמות מצטמצם וכתוצאה מכך הופכת את תהליך הרישום מורכב יותר.

שיטות שונות הוצעו כדי לרשום סעיפים היסטולוגית וליצור vo היסטולוגיה רציףlume. כמה טכניקות תלויות בוריאציות בעוצמה 8, ואחרים המבוססים על הצורה של הסעיפים 9. עבור חלק מדגימות יכולים לשמש מבנים אנטומיים כציוני דרך 10,11 יחד עם שיטות רישום המבוסס על ציון 12,13. אבל המבנים הפנימיים אלה עלולים שלא להתגלות לאורך כל הנפח ועבור חלק מדגימות לא ניתן לזהות מבנים אנטומיים אמינים. חלק מהקבוצות השתמשו בגישת רישום זוג חכם ורשומות תמונות היסטולוגיה רציפות אחד למשנו באמצעות קווי המתאר או מבנים אנטומיים 16-18. רישום סעיפי היסטולוגיה סידוריים זה לזה ללא השימוש בתמונות התייחסות עשויה להפיץ טעות ברישום ולשנות את הצורה האמיתית של היסטולוגיה הנפח. גישת רישום זוג חכמה מסתמכת על העקביות של צורה של סעיפי היסטולוגיה והמבנים הפנימיים לאורך הערימה של התמונות; לכן הוא דורש דגימה צפופה של הדגימה, אשראולי לא תמיד אפשרי, למשל, לדגימות קליניות.

בצנרת זו אנו משתמשים בתמונות blockface כסט של תמונות התייחסות לשיקום היסטולוגיה נפח 19. תמונות Blockface נלקחות מאבני רקמות פרפין לאחר גובר על microtome ולפני כל קטע הוא לחתוך. לפיכך, נזק לקיצוץ סעיפים סידוריים בודד לא מפריע לרישום של חלקים סידוריים 8,11,15. אנו ללכוד את תמונות blockface בצורה שונה מהקבוצות האחרות. תמונות הפנים של הבלוק האופטי מתקבלות על ידי עדשת telecentric כדי למנוע או למזער את עיוות החבית ופרספקטיבה, אשר מתרחשת בדרך כלל בעת שימוש בעדשות רגילות באופטיקה. זהו אחד היתרונות של הגישה המוצעת על פני השיטות האחרות שפורסמו, אשר מבצעות הדמיה blockface שימוש בעדשות רגילות. התמונות שצולמו בזווית אלכסונית קלה להשתמש בהשתקפות של פני השטח של הבלוק להגברת ניגוד בין Tissמשטח UE ופרפין ולחסל את הצל של הרקמה בעומק, מתחת לפני שטח פרפין. מסנן צילום משמש גם כדי לקטב את האור המגיע ממשטח הבלוק והרקמות כדי לאזן את הניגוד 19. כדי לתקן את העקירה של הגוש על microtome הסיבובי, פעמים עד שלושה הם קדחו חורים בפינות הרחוב, שהם בקלות לזיהוי בתמונות blockface. Centroids של חורים אלה משמשים יחד עם רישום נוקשה המבוסס על אתר כדי ליישר את תמונות blockface.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. דגימה

  1. בלו בלוטות החלב בניתוח מהסוג wild-CDH1 כמו גם עכברי Igfbp7-null שלושה ימים שלאחר תחילתה של הנקה.
  2. מורחים את הבלוטות על גבי שקופיות זכוכית כדי לעזור להחזיר את מורפולוגיה בלוטת החלב מקומית.

2. קיבוע ועיבוד רקמות

  1. תקן את בלוטות החלב בPFA 4% O / N הניטרלי שנאגרו ב4 o C.
  2. אחסן את הבלוטות ב70% אתנול לפני עיבוד רקמות.
  3. העבר את הבלוטות לקלטות עיבוד רקמות קטנות.
  4. לעבד את הרקמות באמצעות מעבד רקמות אוטומטית
    1. מייבשים את הרקמות בהגדלת אמבטיות אתנול וקסילן של 70% אתנול ל45 דקות, 2 פעמים ב95% אתנול ל45 דקות, 3 פעמים ב100% אתנול עבור שעה 1 ו -2 פעמים בקסילן 45 דקות.
    2. מחלחל רקמות עם 3 פעמים פרפין במשך שעה 1 כל אחד בואקום עם לחץ מופעל.
  5. להטביע את הרקמות בפרפין ליצירת בלוקים, עבור חתך.

3. היסטולוגיה וBlockface הדמיה

  1. חתוך את בלוקי פרפין באמצעות microtome סיבובי עד פרפין העודף מוסר.
  2. השתמש במכונת טחינה אנכית לקדוח חורי 1 מ"מ לפחות בשתי פינות של גוש פרפין בניצב לקלטת.
  3. הר גוש הרקמה בmicrotome הסיבובי.
  4. הגדר את מערכת ההדמיה blockface 19 מול microtome.
  5. לכידת תמונת blockface אופטית לפני חתך.
  6. לחתוך סרטים מארבעה חלקים בעובי 5 מיקרומטר על microtome.
    1. להעביר את הסרטים לאמבטיה מים הקרים.
    2. הפרד את החלקים השניה והרביעי של הסרט ולעלות אותם בשקופיות מיקרוסקופ. בחירת החלקים השניה והרביעי מספקת פער 5 מיקרומטר בין סעיפים.
    3. להרחיב כל קטע באמבט מים חם (48 C o) לunwrinkle, ואז שוב לעלות אותו על שקופיות מיקרוסקופ.
      הערה: Cutting, הרכבה, unwrinkling הסעיפים לגרום לעיוותים במקטע, כגון דמעה, לקפל, התכווצות והתרחבות. ממצאים אלה לסבך את הרישום של חלקי היסטולוגיה.
    4. להכתים את החלקים עם H & E באמצעות שטיינר אוטומטי.
    5. Coverslip השקופיות באמצעות coverslipper אוטומטי.
    6. ספרת השקופיות באמצעות סורק שקופיות היסטולוגיה דיגיטלי ברזולוציה של עניין. לפרוטוקול זה הוא בהגדלה 20x והרזולוציה היא 0.47 מיקרומטר.
    7. למטה לדגום את תמונות היסטולוגיה לרזולוציה של תמונות blockface, 18 מיקרומטר.

4. רישום תמונה

  1. פילוח תמונה ובחירת נקודה
    1. בblockface תמונות למדוד את ערכי פיקסל של חורי הרישום ולהשתמש בערך הממוצע כסף קבוע למגזר חורי הרישום בפינות של בלוק פרפין.
    2. מאז כמה חלקים נוספים עשויים להיות גם בפילוח לפישימוש בסף הקבוע, השתמש בהמעגליות והשטח של האובייקטים מפולחים למצוא את החורים וזורקים חפצים נוספים. כדי לעשות זאת, לכתוב קוד קטן ולמצוא את היחס (x אזור 4π) / (היקפי) 2 לאובייקטים מפולחים. יחס זה לעצמים עגולים הוא 1.
    3. עבור כל בלוטת החלב, בחר את תמונת blockface אחד כנקודת התייחסות וליישר את שאר תמונות blockface להתייחסות על ידי שימוש במרכז חורי הרישום וטכניקות רישום המבוסס על ציון דרך.
    4. לתמונות blockface המיושרים, באופן ידני או לחלץ קטע הרקמה מהרקע. השתמש באובייקט הגדול ביותר במסכה למשך שארית הפרוטוקול.
    5. עבור H & E סעיפים בצעו את השלבים הבאים לפילוח אוטומטי.
      1. השתמש בטכניקת thresholding אוטסו 20 לתמונות קטע מהרקע ויצירת מסכות בינאריות של תמונות היסטולוגיה.
      2. לזהות ולבחור את האובייקט הגדול ביותר בכל מסכה באמצעות histogram של האובייקטים שכותרתו.
      3. חלץ את נקודות גבול רחבה פיקסל אחד משני היסטולוגיה ומסכות blockface.
      4. השתמש באלגוריתם קוד שרשרת 21, לייצג את נקודות גבול על ידי רצף של יניארי piecewise מתאים.
  2. רישום נוקשה ראשוני
    1. השתמש במתארים פורייה אלגוריתם 22, למצוא נוקשה הראשוני להפוך בין נקודות גבול של היסטולוגיה ותמונות blockface המקבילה שלהם. ראשוני להפוך את זה כולל את גורמי תרגום, סיבוב ואת קנה מידה.
    2. להפוך כל תמונת היסטולוגיה עם הראשוני להפוך התקבל מהשלב הקודם.
  3. עידון של הרישום קשיח
    1. הסר את חלקי קצה עקמומיות גבוהים מגובה היסטולוגיה באמצעות מסנן גלגל את כדור 23.
    2. בחר 500 נקודות מנקודות גבול היסטולוגיה שנותרו באופן אקראי באמצעות התפלגות אחידה.
    3. להפוך אתנקודות היסטולוגיה אקראיות גבול עם השינוי הראשוני המתקבל ממתארים פורייה.
    4. בחר את המערך השלם של blockface נקודות גבול ולהשתמש בנקודות הקרובה ביותר איטרטיבי אלגוריתם (ICP) 24 כדי למצוא את השינוי הנוקשה בין נקודות גבול blockface, היעד, ונקודות גבול אקראיות היסטולוגיה.
    5. להפוך את התמונות מיושרות היסטולוגיה שהתקבלו מהשלב הקודם ואת ערימת תמונות היסטולוגיה מיושרות יוצרת היסטולוגיה הנפח.
    6. השתמש בתוכנה להדמיה 3D כדי ליצור תמונה חזותית של היסטולוגיה הנפח.
  4. צופה בערימה של תמונות בהגדלה 5x
    1. למטה לדגום את תמונות היסטולוגיה המקוריות פי 5 ההגדלה.
    2. לחתוך את האזור של עניין באחת תמונות היסטולוגיה.
    3. לחשב את מיקומו של אזור זה בתמונות היסטולוגיה אחרות 5x באמצעות השילוב של התמורות הנוקשה משני השלבים של רישום.
    4. חתוך את regiפיירפוקס של עניין לאותו אזור בגודל בכל תמונות היסטולוגיה האחרות.
    5. לבסוף לחדד את התיאום בין האזורים באופן ידני. לכתוב תכנית ששכבות שתי תמונות ומאפשרת בחירת הערכים עבור סיבוב ותרגום של אחת התמונות על השני ולאחר מכן שומרת את התמונה הופכת כאשר היישור מקובל.
    6. צפה בערימות של אזורי היסטולוגיה 5x המיושרים באמצעות תוכנת 3D להדמיה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

מלכודת של שיטות מיקרוסקופיה המסורתיות היא שההבנה של איבר ברמה המיקרוסקופית מוגבלת לשדה של נוף אחד בכל פעם. אפילו שקופיות "בסך הכל גילוי", אשר מספקות חלקי שקופית כולה, אינן מספקות מידע תלת ממדים. עם התפתחותה של כל שקופית, טכנולוגיות סריקה דינמיות, היכולת שלנו לראות סעיף זה בכללותו גדלה, עם זאת חיוץ מבנים דורש שחזור היסטולוגיה נפח 3D.

כדי לאפיין את החוסר של עכבר Igfbp7-null טוב יותר, 3D-שחזור של בלוטות הח...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

במחקר זה, פיתחנו תהליך עבודה רישום תמונה לשחזר 3D היסטולוגיה נפח מתמונות סידורי 2D היסטולוגיה, אשר אינו מחייבות את ציוני דרך פנימיות שנבחרו באקראי או סמני fiducial מושתלים בתוך הרקמה, הדבר שעלול לעוות את הרקמות. בשיטה שתוארה, תמונות blockface אופטיות עצמם משמשות כהפנית התמונות לפני חתך. אנו משתמשים חורים חיצוניים נקדחו בבלוק פרפין כדי לסייע ביישור תמונות blockface ולתקן לתנועה הרוחבית 2D של בלוק פרפין מול המצלמה. תמונות היסטולוגיה 2D מיושרות לתמונות blockface 2D המתאימות כדי למנוע...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף

תודות

המחברים רוצים להודות למעבדת המחקר להדמיית סמנים ביולוגיים (BIRL) במכון המחקר סאניברוק על שירותי ההיסטולוגיה שלהם. תמיכה בעבודה זו ניתנה על ידי קרן טרי פוקס, הקרן הקנדית לסרטן השד - הערבה - NWT וכן מענק CIHR, #MOP-97996.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
16% PFAVWR International1571016% תמיסת פרפורמלדהיד
קלטות לעיבוד רקמות קטנותVWR InternationalCA95029-956
Leica ASP300 מעבד רקמות אוטומטיLeica14047643515
100% אתנולפישר סיינטיפיקS25307B
קסילןVWR International CA95057-822
פרפין תרמו פישר39501006הטמעת רקמות פרפלסט בינוני
Leica EG 1160 מרכז הטבעהLeica
מיקרוטום סיבוביLeica
מכונת כרסוםארגו
מיקרוסקופ שקופיותVWR International CA48312-015
H& E stainVWR International
Automatic stainer
Coverslips VWR בינלאומי 48404-452
MEDITE RCM 7000 כיסוי זכוכיתMEDITE
Leica SCN400 סורק שקופיותLeica
MATLABMathWorks IncMATLAB 2007bתוכנת פיתוח
MeVisLabMeVis Medical Solutions AGMeVisLab 2.1תוכנת הדמיה תלת מימדית

מקורות

  1. Sunkin, S. M., et al. Brain Atlas: An integrated spatiotemporal port for exploring the central nervous system. Nucleic Acids Research. 41, 996-1008 (2012).
  2. Shen, E. H., Overly, C. C., Jones, A. R. The Allen Human Brain Atlas: Comprehensive gene expression mapping of the human brain. Trends in Neurosciences. 35 (12), 711-714 (2012).
  3. Trifunović, D., Karali, M., Camposampiero, D., Ponzin, D., Banfi, S., Marigo, V. A high-resolution RNA expression atlas of retinitis pigmentosa genes in human and mouse retinas. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 49 (6), 2330-2336 (2008).
  4. Evdokimova, V., et al. IGFBP7 binds to the IGF-1 receptor and blocks its activation by insulin-like growth factors. Science Signaling. 5 (255), 92(2012).
  5. Burger, A., Leyland-Jones, B., Banerjee, K., Spyropoulos, D., Seth, A. Essential roles for IGFBP-3 and IGFBP-rP1 in breast cancer. European J. Cancer. 41 (11), 1515-1527 (2005).
  6. Amemiya, Y., et al. Insulin like growth factor binding protein-7 reduces growth of human breast cancer cells and xenografted tumors. Breast Cancer Res Treat. 126 (2), 373-384 (2011).
  7. Benatar, T., et al. IGFBP7 reduces breast tumor growth by induction of senescence and apoptosis pathways. Breast Cancer Res Treat. 133 (2), 563-573 (2012).
  8. Bardinet, E., et al. Co-registration of histological, optical and MR data of the human brain. Medical Image Computing and Computer-Assisted Intervention-Part I. , Springer-Verlag. London, UK. 548-555 (2002).
  9. Jacobs, M. A., Windham, J. P., Soltanian-Zadeh, H., Peck, D. J., Knight, R. A. Registration and warping of magnetic resonance images to histological sections. Medical Physics. 26 (8), 1568-1578 (1999).
  10. Zhan, Y., Ou, Y., Feldman, M., Tomaszeweski, J., Davatzikos, C., Shen, D. Registering histologic and MR images of prostate for image-based cancer detection. Academic radiology. 14 (11), 1367-1381 (2007).
  11. Dauguet, J., et al. Three-dimensional reconstruction of stained histological slices and 3D non-linear registration with in vivo MRI for whole baboon brain. Journal of Neuroscience Methods. 164 (1), 191-204 (2007).
  12. Lazebnik, R. S., Lancaster, T. L., Breen, M. S., Lewin, J. S., Wilson, D. L. Volume registration using needle paths and point landmarks for evaluation of interventional MRI treatments. IEEE Transactions on Medical Imaging. 22 (5), 653-660 (2003).
  13. Breen, M. S., Lazebnik, R. S., Wilson, D. L. Three-dimensional registration of magnetic resonance image data to histological sections with model-based evaluation. Annals of Biomedical Engineering. 33 (8), 1100-1112 (2005).
  14. Mori, H., Borowsky, A. D., Bhat, R., Ghajar, C. M., Seiki, M., Bissell, M. J. The American Journal of Pathology. 180 (6), 2249-2256 (2012).
  15. Gibb, M., et al. Resolving the three-dimensional histology of the heart. Computational Methods in Systems Biology. Gilbert, D., Heiner, M. , 2-16 Springer-Verlag. London, UK. 2-16 (2012).
  16. Wu, M. L., et al. Three-dimensional virtual microscopy of colorectal biopsies. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 129 (4), 507-510 (2005).
  17. Arganda-Carreras, I., et al. 3D Reconstruction of histological sections: Application to mammary gland tissue. Microscopy Research and Technique. 73 (11), 1019-1029 (2010).
  18. Song, Y., Treanor, D., Bulpitt, A. J., Magee, D. R. 3D reconstruction of multiple stained histology images. Journal of Pathology Informatics. 4 (2), 7(2013).
  19. Shojaii, R., Karavardanyan, T., Yaffe, M., Martel, A. L. Validation of histology image registration. SPIE Medical Imaging. 7962, 79621E, doi:10.1117/12.878762. 7962 (7962E), (2011).
  20. Ridler, T. W., Calvard, S. Picture thresholding using an iterative selection method. IEEE Transactions on Systems, Man, and Cybernetics. 8 (8), 630-632 (1978).
  21. Freeman, H. Computer processing of line-drawing images. ACM Computing Surveys (CSUR. 6 (1), 57-97 (1974).
  22. Giardina, C. Accuracy of curve approximation by harmonically related vectors with elliptical loci). Computer Graphics and Image Processing. 6 (3), 277-285 (1977).
  23. Shojaii, R., Martel, A. L. A novel edge point selection method for registration of histology images. Optical Tissue Image analysis in Microscopy, Histopathology and Endoscopy. (OPTIMHisE) Workshop, MICCAI. , (2009).
  24. Besl, P., McKay, N. A method for registration of 3-D shapes. IEEE Transactions on Pattern Analysis and Machine Intelligence. 14 (2), 239-256 (1992).
  25. Chatterjee, S., et al. Loss of Igfbp7 causes precocious involution in lactating mouse mammary gland. PLoS ONE. 9 (2), e87858(2013).
  26. Manjunath, B. S., Chellappa, R. Unsupervised texture segmentation using Markov random field models. IEEE Transactions on Pattern Analysis and Machine Intelligence. 13 (5), 478-482 (1991).
  27. Krishnamachari, S., Chellappa, R. Multiresolution Gauss-Markov random field models for texture segmentation. IEEE Transactions on Image Processing: a publication of the IEEE Signal Processing Society. 6 (2), 251-267 (1997).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

מאמרים קשורים