הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

ניתוח של סטרס חמצוני בעוברי דג הזברה

37.8K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/51328

⸱

7 ביולי 2014

 ,  , 
1Department of Molecular Biotechnology and Health Science, University of Torino, 2Laboratory of Endothelial Molecular Biology, Vesalius Research Center, VIB

במאמר זה

סיכום

כאן אנו מדווחים על פרוטוקול למדידת מתח חמצוני בעוברי דג זברה חיים. הליך זה מאפשר זיהוי מיני חמצן תגובתיים (ROS) הן ברקמות עובר שלמות והן באוכלוסיות תאים בודדים. פרוטוקול זה יבצע ניתוחים איכותיים וכמותיים כאחד.

תקציר

רמות גבוהה של מיני חמצן מגיבים (ROS) עלולות לגרום לשינוי במצב חיזור הסלולרי למצב עקה חמצונית. מצב זה גורם לחמצון של מולקולות (שומנים בדם, ה-DNA, חלבונים) ומוביל למותם של תאים. סטרס חמצונים גם משפיע על ההתקדמות של כמה מצבים פתולוגיים כגון סוכרת, Retinopathies, ניוון מוחיים, וסרטן. לפיכך, חשוב להגדיר בכלים כדי לחקור תנאי עקה חמצונית לא רק ברמה של תאים בודדים, אלא גם בהקשר של כל האורגניזמים. כאן, אנו רואים את עובר דג הזברה כשימושי במערכת vivo לבצע מחקרים כאלה ומציגים פרוטוקול למדידת לחץ חמצוני in vivo. ניצול של בדיקות ROS ניאון וקווי ניאון מהונדסים דג הזברה, אנו מפתחים שתי שיטות שונות למדידת לחץ חמצוני in vivo: ט) "שיטה כל עובר ROS איתור" למדידה איכותית של סטרס חמצונים וii) "תא בודד שיטת ROS זיהוי "למדידות כמותיות של סטרס חמצונים. בזאת, אנחנו מדגימים את יעילותם של הליכים אלה על ידי הגדלת לחץ חמצוני ברקמות על ידי סוכני חמצון ושיטות פיסיולוגיות או גנטיות. פרוטוקול זה הוא נוח למסכים גנטיים קדימה וזה יעזור לי יחסי כתובת סיבה ותוצאה של ROS במודלים של בעלי חיים של פתולוגיות הקשורות ללחץ חמצוני כגון הפרעות נוירולוגיות וסרטן.

מבוא

סטרס חמצונים מוגדר באופן ספציפי כתנאי הנובע ממצב חיזור סלולארי לא מאוזן. תגובות חיזור מורכבות המתרחשות באופן שיגרתי בתוך תאים לקבוע את חיזור המדינה הסלולרית. תגובות חיזור מורכבות מכל התגובות כימיות מורכבות בהעברת אלקטרונים בין האטומים של מולקולות ביולוגיות ייצור חיזור וחמצון של מולקולות (כלומר תגובות חיזור). התגובות הללו הן זרז על ידי מינים מופעלים באופן אלקטרוני (כלומר מינים פרו חמצוני-), המתאפיינים בחוסר יציבות מבנית קיצונית והפעלה ספונטנית של אלקטרונים לא מאוזנים שיחליפו עם ביומולקולות השכנה. תגובות לא סדירות אלה לגרום לניזק לדנ"א, carboxylation חלבון, וחמצון שומנים בדם, וסופו של דבר להוביל למוות של תאי 1. הרמות גבוהות של סטרס חמצונים כבר הקשורות להזדקנות וההתפתחות של מצבים פתולוגיים שונים 2. יש סטרס חמצוניםדווח להיות אחראי לשינויים בכלי הדם בסוכרת ומחלות לב וכלי דם 3,4. זה גם משחק תפקיד קריטי בניוון עצבי במחלת אלצהיימר ופרקינסון 5. יתר על כן, סטרס חמצונים הוכח כגורם קריטי בשלטון התקדמות סרטן ואירועים גרורתי 6,7. בנוסף, תגובות דלקתיות והחיסוניות עשויות לעורר לחץ חמצוני ותמיכה נוספת 8.

בתאים חיים, מינים הפרו חמצוני נגזרים מהחמצן (ROS; מיני חמצן תגובתי) או חנקן (RNS; מיני חנקן תגובתי). ROS כולל הידרוקסיל רדיקלי, אניון superoxide (OH). (O 2 -), ומי חמצן (H 2 O 2). RNS העיקרי הוא תחמוצת חנקן (NO).. סדרה של מינים תגובתי משניים יכולה להיות שנוצרה על ידי אינטראקציות ספונטניות between ROS וRNS או מתכות בחינם יוני 9. לדוגמא, אניון סופראוקסיד מגיב עם תחמוצת חנקן ליצירת peroxynitrate (ONOO -), ואילו H 2 O 2 מגיב עם Fe 2 + יוצר רדיקלים הידרוקסיל. ROS וRNS, בשל יכולתם להגיב עם כמה ביומולקולות, נחשבים איום מסוכן לשמירה על מדינת חיזור הפיזיולוגית 10. כדי לשמור על תאי מדינת חיזור מצוידים בסדרה של רעלים מולקולות נוגד חמצון ואנזימים. סופראוקסיד דיסמוטאז (SOD), Catalase, peroxidase גלוטתיון וPeroxiredoxins בעצם מהווים האנזימטית-הארסנל נוגד חמצון המספק הגנה תאית ממינים פרו חמצוני כוללים H 2 O 2, OH וOONO -. 11. גם מולקולות נוגדת חמצון כמו הוויטמין C ו-E, פוליפנולים וCoenzymeQ10 (CoQ10) הן בעלי חשיבות קריטית כדי להרוות ROS ודה המסוכנת שלהםrivatives 12,13. עם זאת, ייצור מוגבר של ROS וRNS, או חוסר תפקוד במערכת נוגד החמצון, מסיט את חיזור המדינה הסלולרית לסטרס חמצונים 14.

חוץ מהקונוטציה השלילית שלהם, ROS יכול לשחק תפקידים פיסיולוגיים שונים בתאים ממוצא שונה. תאים בדרך כלל מייצרים ROS כמולקולות איתות לתווך אירועים ביולוגיים נורמלים כגון הגנת מארחת ותיקון פצע 15-17. מינים תגובתי בדרך כלל מיוצרים בתאים על ידי אנזימים תאיים כגון NOX (NADPH אוקסידאז) וXO (Xantine אוקסידאז) בתגובה לגורמי איתות, גורמי גדילה, ותנודות תאיים של רמות סידן 18,19. זה כבר דווח כי ROS עשוי דיפרנציאלי לווסת את פעילותם של גורמים גרעיניים חשובים כגון p53 או מרכיבים תאיים כגון ATM-kinase, רגולטור של התגובה לנזק לדנ"א 20. באנלוגיה ROS מאוד להשפיע איתות הסלולר על ידי תיווך החמצון דואר ואיון של phosphatases החלבון טירוזין (PTPs), אשר הוקם כמכרעת בויסות העברת האותות 21. יתר על כן, שיטות proteomic מבוססים להוכיח כי RNS כן הם אחראים לשינויים חלבון מסוימים ושינויים של איתות מולקולרית. RNS להגיב עם קבוצות תיאול ציסטאין שינוים לS-nitrothiols (SNO) ומפעילות מסלולים מולקולריים במקביל למצבים פתולוגיים כגון מחלות דלקתיות ואוטואימוניות 22,23.

מאז ניסויי תרבית תאים באופן חלקי בלבד לשכפל מספר רב של גורמים הפועלים בvivo, זה הוא עניין רב לבצע מחקרי חיזור במודלים של בעלי החיים 24,25. כדי להשיג זאת, דג הזברה כבר נחשב מודל בעלי חיים בעלי חוליות מתאים ללמוד דינמיקת סטרס חמצונים 26. דג הזברה היא מודל למערכת חדשה המעניקה מספר יתרונות ללמוד אירועים תאיים וגנטיים בdev חוליותelopment ומחלות. אשכולות גדולים של עוברים יכולים להיות שנוצרו וזמינים שבועיים לצרכי ניסוי. יתר על כן הבהירות יוצאת דופן האופטית של עוברי דג הזברה, כמו גם גודלם הזעיר, מאפשר הדמיה תא בודדת ומעקב דינמי באורגניזמים שלמים 27. בעשור האחרון, מספר לא מבוטל של מוטציות דג הזברה כבר נוצר למודל מצבים פתולוגיים אדם כגון סרטן ומחלות גנטיות 28-31. והכי חשוב, מספר רב של קווים מהונדסים הופק כדי לאפשר הזדמנויות נרחבות של מניפולציות גנטיות וביולוגיות 32. לדוגמא, קווי דג הזברה רקמות ספציפיות מהונדסים מנוצלים באופן קבוע במחקרי vivo. קווים אלה מבטאים חלבון פלואורסצנטי תחת השליטה של אמרגן שנבחר, המציע את היכולת לזהות תאים בודדים in vivo, כמו גם את המבנה האנטומי שהם מהווים.

מספר מחקרי טוקסיקולוגי כבר השתמשו tהוא דג הזברה כדי להעריך את השפעת vivo של כימיקלים על הומאוסטזיס חיזור, מה שמראה את התאמתם של חוליות זו כמודל חיה לתחום של גילוי תרופות וסטרס חמצונים 33-35. למרות כמה בדיקות ניאון נבדקו כדי לפקח על סטרס חמצונים בזחלי דג הזברה 36,37, אין מבחני הוקמו כדי לזהות ולמדוד את הרמות של סטרס חמצונים ברקמות דג הזברה ותאי חיים. כאן אנו מתארים הליך לכימות in vivo של סטרס חמצונים בתאים חי של עוברי דג הזברה. כל כלי הדמיה, FACS מיון, בדיקות ניאון ותנאים פרו חמצוני משולבים כדי ליצור assay פשוט לאיתור והכימות של מיני חמצוני בעוברים ורקמות דג הזברה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. הכנת הכלים ופתרונות עבודה

  1. הכן את פתרון המים דגים. הפוך פתרון מניות על ידי המסת 2 גרם של 'אושן מיידי "מלחי ים ב50 מיליליטר של מים מזוקקים. הוסף 1.5 מיליליטר מים דגי המניה לליטר מים מזוקק 1 להכין מוכנה להשתמש במי דגים (ריכוז סופי 60 מיקרוגרם / מלחי ים מיליליטר). החיטוי מוכן לשימוש במי דגים לפני השימוש. פתרון זה משמש כמדיום עובר דג הזברה.
  2. הכן methylcellulose להרכבת עובר. ממיסים 1.5 גרם של methylcellulose ב50 מיליליטר מים דגי סטרילי. להקל על הפירוק על ידי שימוש במגנט על צלחת ומערבבים. פירוקה של האבקה המלאה עשוי לארוך מספר שעות. בדוק את הפתרון לבהירות וaliquot לתוך צינורות קטנים. חנות ב -20 מעלות צלזיוס למשך חודשים ולהפשיר aliquots בשימוש. צנטריפוגה methylcellulose ב950 XG במשך 5 דקות לפני השימוש. הימנע להקפיא להפשיר מחזורים של aliquots.
  3. הכן 50 מיליליטר של tricaine / 3 מ-aminobenzoate אתילמלח ethanesulphonate (פתרון מניות) על ידי המסת 200 מ"ג tricaine ב100 מיליליטר מים ולהתאים את ה-pH ל 7.0 באמצעות טריס-HCl M 1 (pH 9). אחסן את המניה הזו ב 4 מעלות צלזיוס למשך לא יותר מ 30 ימים. זהירות: tricaine היא רעילה. השתמש על פי הנחיות בטיפול מתאימות.
  4. גרימת עקה חמצונית בעוברי דג הזברה
    1. הכן את פתרון חמצון לזירוז סטרס חמצונים הגנרית: הפוך 50 מיליליטר של תמיסת חמצון על ידי הוספת H 2 O פתרון 2 מניות (מי חמצן; 100 מ"מ) למים דגים. השתמש H 2 O 2 של ריכוז סופי בין 2 מ"מ ו100 מיקרומטר. הכן את הפתרון הזה, זמן קצר לפני השימוש בו. פתרון החמצון יכול להיות מיושם גם ההר ROS-זיהוי שלם ושיטות ROS איתור מתא בודד. אין לאחסן את הפתרון הזה. זהירות: H 2 O 2 היא מסוכנת, ומזיק על ידי שאיפה, ואם בלע. מגע עם חומר דליק עלול לגרום לשריפה. ידית מתחת למכסת מנוע קטר וללבוש מצו מתאימיםציוד מגן onal.
    2. הכן את פתרון חמצון לזירוז סטרס חמצונים הנגזר מיטוכונדריה: בצע פתרון חמצון המניה (5 מ"מ) על ידי המסת 3.9 מ"ג rotenone ב2 מיליליטר של sulfoxide דימתיל (DMSO). שמור פתרון זה בטמפרטורת חדר בחושך.
      1. ממיסים פתרון מניות rotenone ל10 מיליליטר מים דגים כדי להפוך מוכן לשימוש פתרון. השתמש rotenone בריכוז שבין 5-50 מיקרומטר. אין להשתמש בrotenone בריכוזים גבוהים יותר מאשר 100 מיקרומטר. בריכוזים מתאימים, פתרון חמצון זה יכול להיות מיושם על שני ההר ROS-זיהוי שלם ושיטות ROS איתור מתא בודד. זהירות: Rotenone הוא רעיל ומסוכן. להתמודד על פי הצהרות זהירות מתאימות.
    3. לגרום ללחץ חמצוני על ידי גן לדפוק למטה: Knock-למטה ביטוי גני nrf2a בעוברי דג הזברה על ידי microinjection morpholino כפי שדווח בעבר על ידי Timme-Laragy א ואח', 2012 38..
    4. לגרום אוקסידative מתח לאחר נזק לרקמות: לייצר שולי פצע בסנפיר הזנב של עוברי דג הזברה ב72 hpf כפי שתואר בעבר על ידי Niethammer ואח', 2009 39..
  5. הכן 5 מיליליטר של תמיסת ROS איתור לשיטת ROS איתור תא בודד:
    1. פתרון לגילוי ROS כללי: ממיסים את הבדיקה המולקולרית ROS רגישה גנריים בHBSS (תמיסת מלח מאוזנת של הנקס) על מנת להכין פתרון עובד (טווח ריכוז: בין 2.5-10 מיקרומטר). פתרון זה חייב להיות מוכן זמן קצר לפני השימוש בו.
    2. פתרון לגילוי ספציפי הנגרם על ידי ROS המיטוכונדריה: זמן קצר לפני השימוש, לפזר בדיקה ROS רגישה המיטוכונדריה עם DMSO מה שהופך את פתרון מניות 5 מ"מ. ממיסים פתרון מניות בHBSS כדי להכין פתרון עובד (טווח ריכוז: בין 2.5-10 מיקרומטר).
      הערה: הימנע מחשיפה לאור וחמצן של פתרונות עובדים ROS איתור ופתרונות המניות שלהם. להגן על הצינור מפני אור על ידי שימושרדיד אלומיניום. אל תאחסנו או בדיקות שימוש חוזר מומסים בHBSS. אחסן את פתרונות המניות ב -20 מעלות צלזיוס במשך חודש.
      התראה: טפל בבדיקות מולקולריות וDMSO מתחת למכסה המנוע קטר בהתאם להנחיות מתאימות.
  6. הכן 5 מיליליטר של תמיסת ROS איתור לכל שיטת ההר ROS-זיהוי: ממיסים את הפתרון גנרי ROS רגיש מניית הבדיקה (התייצב בDMSO) בHBSS כדי להכין פתרון עובד (טווח ריכוז: 2.5-5 מיקרומטר). הימנע מחשיפה לאור וחמצן. להגן על הצינור מפני אור. הכן את הפתרון הזה לפני השימוש. אין לאחסן מחדש או להשתמש בפתרון זה. התראה: טפל בבדיקות מולקולריות מתחת למכסה המנוע קטר בהתאם להנחיות מתאימות.
  7. הפוך 25 מיליליטר של Stop פתרון על ידי הוספת 10 מיליליטר של סרום שור עוברי ל15 מיליליטר של PBS 1X. שמור על תמיסה סטרילית. אחסן את הפתרון הזה ב 4 ° C. פתרון זה נדרש אך ורק לתא בודד - שיטת זיהוי ROS.
  8. הגדר את החממה באוויר דג הזברה ב28 &# 176; ג
  9. הגדר את צנטריפוגות ב 4 ° C למשך שיטת ROS איתור תא הבודד.

2. זיווג של דגים למבוגרים ובחירה של עוברי דג הזברה

  1. זוג דג הזברה מבוגר ההגדרה חוצה על פי פרוטוקולים סטנדרטיים 40. בחר את הקו המהונדס המתאים בהתאם לצרכי ניסוי ספציפיים.
  2. לאסוף את הביצים ומניחים אותם לתוך צלחת 90 ​​מ"מ עם מדיום מים דגים / עובר. שמור על ביצים ב28 ° C עד עוברים יתפתחו ויגדלו לשלב ההתפתחותי הרצוי (למשל, 48 hpf, 72 hpf; hpf: שעות שלאחר הפריה).
  3. מסך לפיתוח עוברים. אל תכלול את כל ביצים מופרה או עובר לא מפותח.
  4. הרדימי עוברים על ידי הוספת 1 מיליליטר של tricaine (פתרון מניות) ב50 מיליליטר מים דגים.
  5. בחר עוברי ניאון Tg תחת סטראו.

3. טיפול בעוברים עם אוקסידנט סוכן

  1. השתמש לפחות 30 עוברים בין 48 שעותPF ו72 HPF למצב שונה. שטוף עוברים פעמיים עם מים דגים טריים על מנת להסיר tricaine.
  2. פיצול עוברי ניאון לשלוש מנות. שים לא יותר מ 30 עוברים / צלחת.
  3. הסר את פתרון הכביסה ולהוסיף 10 מיליליטר של פתרון החמצון או 10 מיליליטר מים דגים כפתרון שליטה.
  4. דגירה עובר במשך 10 דקות לשעה 1 ב28 ° C. תקופת הדגירה תלויה ברמה של סטרס חמצונים להיות מושרה ברקמות ספציפיות. תקופות קצרות הן הטובות ביותר כתאים מושפעים מלחץ חמצוני בהדרגה לעבור מוות של תאים.
  5. העברה עובר לתוך צלחת חדשה המכילה HBSS ועוברים שטיפה על ידי מתערבל. HBSS טרום חם ב28 ° C.

4. ההר שלם ROS איתור שיטה

  1. איסוף עובר לאחר טיפול חמצון ולשים לא יותר מ 10 עוברים בשפופרת קטנה. לשטוף עם HBSS ככל האפשר. להגן על הצינור מפני אור באמצעות רדיד אלומיניום.
  2. הוסף 1 מיליליטר של תמיסת ROS איתור לצינור אחד.
  3. דגירה עובר בחושך במשך 15 דקות ב28 ° C כדי למנוע חשיפה לאור.
  4. במהלך זמן הדגירה להכין שקופיות זכוכית לניתוח עובר שלם. שים 300 μl של methylcellulose בשקופית זכוכית "דיכאון" ופרש אותה על משטח הזכוכית עם קצה פיפטה. למנוע בועות בזמן שחרור methylcellulose.
  5. בסוף זמן הדגירה, להסיר באופן מיידי את פתרון ROS איתור ולשטוף פעמיים עם 2 מיליליטר של HBSS. שטוף עוברים על ידי צינור היפוך כמה פעמים. אל פיפטה או מערבולת.
  6. עוברים לשאוב לתוך זכוכית פיפטה פסטר. עוברי עמדה ליד הפתח של פיפטה ובעדינות להוציא אותם לתוך methylcellulose. להתמצא העוברים כראוי עם קו ניילון דק.
  7. השווה את הקרינה של עוברי שליטה עם עוברים שטופלו. לחלופין, לתקן את הפרמטרים של סטראו הקרינה או מיקרוסקופ confocal, כך שכל העוברים הם צילמו באמצעות אותוהגדרות הדמיה.

5. שיטת ROS איתור תא בודד

  1. להתחיל מצעד: 3.5. לוודא שיש לפחות 35 עוברים לכל מצב.
  2. העבר את העוברים לתוך צלחת חדשה. הסר מים דגים עד כמה שניתן. הוסף 10 מיליליטר של קר כקרח PBS 1X ו400 μl של קוקטייל מעכבי פרוטאז. ידני dechorionate עוברים עם מלקחיים ולהסיר את שק החלמון עם מחט עדינה. הערה: הסרת שק חלמון מבטיחה דגימות נקיות לניתוח FACS הבא. ניתן להימנע בשלב זה על פי מכשיר FACS.
  3. העברת עוברים-yolked דה לתוך צלחת 24 גם multiwell (15 עוברים / טוב) ולהסיר את כל המים הדגים.
  4. הוסף 300 μl של HBSS, 30 P collagenase μl, 50 μl טריפסין-EDTA בכל טוב.
  5. Homogenize עוברים על ידי pipetting בעדינות מעלה ומטה עם טיפ חזק פיפטה (1,000 μl).
  6. לדגור על C ° 28 עבור 20 דקות וhomogenize דגימות על ידי pipetting כל 5 דקות.
  7. בדוק disr רקמהuption ידי התבוננות aliquot של homogenate במיקרוסקופ המתחם. להקל על השעיה תא בודדת על ידי pipetting. אל דגירה עובר במשך יותר מ 30 דקות.
  8. עצור את התגובה על ידי הוספת 200 μl של להפסיק פתרון. מערבבים על ידי pipetting בעדינות.
  9. העבר את ההשעיה תא לתוך צינור מראש צונן עם תחתית צמודה. שמור צינור על קרח ולהימנע מחשיפה לאור.
  10. צנטריפוגה במשך 5 דקות ב 250 XG ב 4 ° C.
  11. הסר את השלב העליון ותאים מחדש להשעות עם HBSS הקר כקרח בעדינות על ידי pipetting.
  12. ספירת תאים ולוודא שיש לך את אותו המספר של תאים בכל הדגימות שלך. אל תשתמשו בפחות מ -2 x 10 6 תאים.
  13. תאי צנטריפוגה במשך 5 דקות ב250 XG ב 4 ° C.
  14. הסר supernatant ולהשעות את גלולה עם 1 מיליליטר של HBSS המקורר קרח המכיל את הבדיקה ROS רגישה.
  15. דגירה הצינור בטמפרטורת חדר למשך 3 דקות בחושך. להשתנות זמן דגירה על פי הרמה של סטרס חמצונים וכדי לאהוא הרגישות של הבדיקה.
  16. העבר את התאים לצינור FACS. שמרו צינורות על קרח ולהימנע מחשיפה לאור לפני ניתוח FACS.
  17. למיין תאים עם סדרן הקרינה המופעל תא (FACS). אורכי גל נקבע בהתאם לקרינת Tg רקמות (לדוגמא, ה-GFP) ואת ספקטרום עירור / פליטה של החללית המולקולרית המשמשת לזיהוי ROS (למשל, בדיקות ROS רגישות המיטוכונדריה ספציפיות, בדיקות ROS רגישות גנריות).
  18. עבור כל תנאי, למדוד את כל הדגימות באותה ההפעלה הניסיונית על ידי יישום אותן הגדרות FACS. לחשב את אחוז תאי ניאון כממוצע של משכפל ביולוגי שונה. לנתח לפחות שתי חזרות לכל מצב.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

על ידי יישום השיטה שתוארה כאן, אנו יכולים בקלות למדוד ולזהות סטרס חמצונים (ורמות ROS) ברקמות עוברי דג הזברה. לאחר חציית דג הזברה מבוגר, ביצים נאספות ואפשרו לפתח ב28 C ° 72 הודעה hr הפריה (hpf). על מנת לגרום ללחץ חמצוני, אנו מציעים שתי גישות שונות: 1) טיפול בעוברים עם ריאגנטים פרו חמצון חזקים או 2) ההשקעה בROS קידום לאחר פגיעה ברקמות.

בגישה הראשונה, שהעסקנו שני חומרים כימיים שונים, בהתאם לצרכים הספציפיים: מי חמצן ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

שלבים קריטיים

ההליך לגילוי עקה חמצונית בעוברי דג הזברה שתוארו במסמך זה כולל שתי שיטות שונות. שיטת ההר ROS איתור כולו היא בעיקר assay איכותי לROS איתור, ואילו בשיטת ROS איתור התא הבודד מאפשרת מדידות כמותיות ספציפיות יותר (איור 1). שני השיטות מציעות דרך קלה ומהירה כדי להעריך את in vivo ROS איתור על עוברי דג הזברה. עם זאת, שניהם יציגו כמה שלבים קריטיים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

התמיכה במעבדת מאסימו סנטורו מגיעה מ-HFSP, Marie Curie Action, Telethon ו-AIRC. אנו מודים לדפנה גייס ולאמיליאנו פניירי על הקריאה הביקורתית של כתב היד.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
תמיסת מי חמצןSIGMA516813אין לאחסן דילולים
תמיסת מלח מאוזנת של האנק 1xGIBCO14025
מתיל תאיתSIGMAM0387
אינסטנט אוקיינוס אקווריום תערובת מלח יםINSTANT OCEANSS15-10
טריקאיןSIGMAA5040
בדיקה רגישה ל-ROS של Cgeneric: מגיב אדום עמוק של CellROXINVITROGENC10422
בדיקה רגישה ל-ROS ספציפית למיטוכונדריה: MitoSOX INVITROGENM36008ממיסים בקבוקון אחד עם 13 μ l של DMSO
הידרואתידיןINVITROGEND23107
רוטנוןSIGMAR8875הכן תמיסת מלאי של 5 מ"מ ב-DMSO. 
דימתיל סולפוקסידSIGMAD2650
VAS2870; 3-בנזיל-7-(2-בנזוקסזוליל)תיו-1,2,3-טריאזולו(4,5-d)פירימידיןEnzoLifeScienceBML-EI395ממיסים את האבקה ב-DMSO; דילויט במי דגים
פרופידיום יודי בדיקות מולקולריות
(Life Technologies)		P3566
7-aminoactinomycin D (7-AAD) בדיקות מולקולריות
(Life Technologies)		A1310
Nrf2a MorpholinoGeneTools5'-CATTTCAATCTCCAT
CATGTCTCAG-3'Ref		: Timme-LaLaragy et al.; 2012 (PMID: 22174413); קוביאשי et al.; 2002 (PMID:12167159)
קולגנאז PROCHE11213857001להמיס את האבקה ב-100 מ"ג/מ"ל ב-HBSS סטרילי. אחסן את הכמויות בטמפרטורה של -20 מעלות; C
תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS)GIBCO10010-056
סרום בקר עוברי GIBCO10082-147
טבליות קוקטייל מעכב פרוטאז מלאROCHEממיסים טבליה אחת ב-1 מ"ל מים
0.5% טריפסין-EDTA (10x), ללא פנול אדוםGIBCO15400-054הכן תמיסת עבודה אחת לפני השימוש
מיקרוסקופ מורכב ZEISS
עם תאורת פלואורסצנטמצלמת NikonAZ100
ZEISSAxioCamMRm
לרכישת תמונות פלואורסצנטיותZEISSZEN 2011
סדרן תאים המופעל על ידי פלואורסצנטיBD FACSצנטריפוגת קליבור
 FACS של Eppendorf5417R
 BD342065
Multiwell Plate BD Falcon353047
צלחות פטרי מעוקרות ולא מטופלות 90 מ"מVWR391-1915
מיקרוסקופ קונפוקליLeicaLeica SP5
מיקרוסקופ סטריאו תוכנת צינורות

מקורות

  1. Alfadda, A. A., Sallam, R. M. Reactive oxygen species in health and disease. J Biomed Biotechnol. 2012, (2012).
  2. Lu, T., Finkel, T. Free radicals and senescence. Exp Cell Res. 314, 1918-1922 (2008).
  3. Chen, A. F., et al. Free radical biology of the cardiovascular system. Clin Sci (Lond. 123, 73-91 (2012).
  4. Selvaraju, V., et al. Diabetes, oxidative stress, molecular mechanism, and cardiovascular disease--an overview. Toxicol Mech Methods. 22, 330-335 (2012).
  5. Gandhi, S., Abramov, A. Y. Mechanism of oxidative stress in neurodegeneration. Oxid Med Cell Longev. 2012, (2012).
  6. Shi, X., Zhang, Y., Zheng, J., Pan, J. Reactive oxygen species in cancer stem cells. Antioxid Redox Signal. 16, 1215-1228 (2012).
  7. Cui, X. Reactive oxygen species: the achilles' heel of cancer cells. Antioxid Redox Signal. 16, 1212-1214 (2012).
  8. Park, H., Bourla, A. B., Kastner, D. L., Colbert, R. A., Siegel, R. M. Lighting the fires within: the cell biology of autoinflammatory diseases. Nat Rev Immunol. 12, 570-580 (2012).
  9. Nathan, C., Ding, A. SnapShot: Reactive Oxygen Intermediates (ROI). Cell. 140, 951-951 (2010).
  10. Brown, G. C., Borutaite, V. Interactions between nitric oxide, oxygen, reactive oxygen species and reactive nitrogen species. Biochem Soc Trans. 34, 953-956 (2006).
  11. Brieger, K., Schiavone, S., Miller, F. J., Krause, K. H. Reactive oxygen species: from health to disease. Swiss Med Wkly. 142, (2012).
  12. Littarru, G. P., Tiano, L., Belardinelli, R., Watts, G. F. Coenzyme Q(10), endothelial function, and cardiovascular disease. Biofactors. 37, 366-373 (2011).
  13. Landete, J. M. Dietary intake of natural antioxidants: vitamins and polyphenols. Crit Rev Food Sci Nutr. 53, 706-721 (2013).
  14. Finkel, T. Oxidant signals and oxidative stress. Curr Opin Cell Biol. 15, 247-254 (2003).
  15. Murphy, M. P. How mitochondria produce reactive oxygen species. Biochem J. 417, 1-13 (2009).
  16. Sarsour, E. H., Kumar, M. G., Chaudhuri, L., Kalen, A. L., Goswami, P. C. Redox control of the cell cycle in health and disease. Antioxid Redox Signal. 11, 2985-3011 (2009).
  17. Nathan, C., Shiloh, M. U. Reactive oxygen and nitrogen intermediates in the relationship between mammalian hosts and microbial pathogens. Proc Natl Acad Sci U S A. 97, 8841-8848 (2000).
  18. Finkel, T. Signal transduction by reactive oxygen species. J Cell Biol. 194, 7-15 (2011).
  19. Autreaux, B., Toledano, M. B. ROS as signalling molecules: mechanisms that generate specificity in ROS homeostasis. Nat Rev Mol Cell Biol. 8, 813-824 (2007).
  20. Maryanovich, M., Gross, A. A ROS rheostat for cell fate regulation. Trends Cell Biol. 23, 129-134 (2013).
  21. Tonks, N. K. Redox redux: revisiting PTPs and the control of cell signaling. Cell. 121, 667-670 (2005).
  22. Antelmann, H., Helmann, J. D. Thiol-based redox switches and gene regulation. Antioxid Redox Signal. 14, 1049-1063 (2011).
  23. Foster, M. W., Hess, D. T., Stamler, J. S. Protein S-nitrosylation in health and disease: a current perspective. Trends Mol Med. 15, 391-404 (2009).
  24. Albrecht, S. C., Barata, A. G., Grosshans, J., Teleman, A. A., Dick, T. P. In vivo mapping of hydrogen peroxide and oxidized glutathione reveals chemical and regional specificity of redox homeostasis. Cell Metab. 14, 819-829 (2011).
  25. Knoefler, D., et al. Quantitative in vivo redox sensors uncover oxidative stress as an early event in life. Mol Cell. 47, 767-776 (2012).
  26. Fang, L., Miller, Y. I. Emerging applications for zebrafish as a model organism to study oxidative mechanisms and their roles in inflammation and vascular accumulation of oxidized lipids. Free Radic Biol Med. 53, 1411-1420 (2012).
  27. White, R. M., et al. Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis. Cell Stem Cell. 2, 183-189 (2008).
  28. Amatruda, J. F., Patton, E. E. Genetic models of cancer in zebrafish. Int Rev Cell Mol Biol. 271, 1-34 (2008).
  29. Jing, L., Zon, L. I. Zebrafish as a model for normal and malignant hematopoiesis. Dis Model Mech. 4, 433-438 (2011).
  30. Shin, J. T., Fishman, M. C. From Zebrafish to human: modular medical models. Annu Rev Genomics Hum Genet. 3, 311-340 (2002).
  31. Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat Rev Genet. 8, 353-367 (2007).
  32. Lawson, N. D., Wolfe, S. A. Forward and reverse genetic approaches for the analysis of vertebrate development in the zebrafish. Dev Cell. 21, 48-64 (2011).
  33. Duan, J., Yu, Y., Li, Y., Sun, Z. Cardiovascular toxicity evaluation of silica nanoparticles in endothelial cells and zebrafish model. Biomaterials. 34, 5853-5862 (2013).
  34. Sobrino-Figueroa, A. S. Evaluation of oxidative stress and genetic damage caused by detergents in the zebrafish Danio rerio (Cyprinidae). Comp Biochem Physiol A Mol Integr Physiol. 165, 528-532 (2013).
  35. Xu, H., et al. Oxidative stress and immune related gene expression following exposure to di-n-butyl phthalate and diethyl phthalate in zebrafish embryos. Ecotoxicol Environ Saf. 93, 39-44 (2013).
  36. Hermann, A. C., Millard, P. J., Blake, S. L., Kim, C. H. Development of a respiratory burst assay using zebrafish kidneys and embryos. J Immunol Methods. 292, 119-129 (2004).
  37. Rieger, S., Sagasti, A. Hydrogen peroxide promotes injury-induced peripheral sensory axon regeneration in the zebrafish skin. PLoS Biol. 9, (2011).
  38. Timme-Laragy, A. R., et al. Nrf2b, novel zebrafish paralog of oxidant-responsive transcription factor NF-E2-related factor 2 (NRF2). J Biol Chem. 287, 4609-4627 (2012).
  39. Niethammer, P., Grabher, C., Look, A. T., Mitchison, T. J. A tissue-scale gradient of hydrogen peroxide mediates rapid wound detection in zebrafish. Nature. 459, 996-999 (2009).
  40. Murphy, M. P., et al. Perspective. Cell Metabolism. 13 (4), 361-366 (2011).
  41. Li, N., et al. Mitochondrial complex I inhibitor rotenone induces apoptosis through enhancing mitochondrial reactive oxygen species production. J Biol Chem. 278, 8516-8525 (2003).
  42. Rhee, S. G., Chang, T. S., Jeong, W., Kang, D. Methods for detection and measurement of hydrogen peroxide inside and outside of cells. Mol Cells. 29, 539-549 (2010).
  43. Murphy, M. P., et al. Unraveling the biological roles of reactive oxygen species. Cell Metab. 13, 361-366 (2011).
  44. Covassin, L., et al. Global analysis of hematopoietic and vascular endothelial gene expression by tissue specific microarray profiling in zebrafish. Dev Biol. 299, 551-562 (2006).
  45. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203, 253-310 (1995).
  46. Beis, D., Stainier, D. Y. In vivo cell biology: following the zebrafish trend. Trends Cell Biol. 16, 105-112 (2006).
  47. Pan, Y. A., et al. Zebrabow: multispectral cell labeling for cell tracing and lineage analysis in zebrafish. Development. 140, 2835-2846 (2013).
  48. Moussavi Nik, S. H., et al. The BACE1-PSEN-AbetaPP regulatory axis has an ancient role in response to low oxygen/oxidative stress. J Alzheimers Dis. 28, 515-530 (2012).
  49. Matthews, R. P., et al. TNFalpha-dependent hepatic steatosis and liver degeneration caused by mutation of zebrafish S-adenosylhomocysteine hydrolase. Development. 136, 865-875 (2009).
  50. Mukaigasa, K., et al. Genetic evidence of an evolutionarily conserved role for Nrf2 in the protection against oxidative stress. Mol Cell Biol. 32, 4455-4461 (2012).
  51. Mugoni, V., et al. Ubiad1 is an antioxidant enzyme that regulates eNOS activity by CoQ10 synthesis. Cell. 152, 504-518 (2013).
  52. Dowling, J. J., et al. Oxidative stress and successful antioxidant treatment in models of RYR1-related myopathy. Brain. 135, 1115-1127 (2012).
  53. Sun, Y., Dong, Z., Khodabakhsh, H., Chatterjee, S., Guo, S. Zebrafish chemical screening reveals the impairment of dopaminergic neuronal survival by cardiac glycosides. PLoS One. 7, (2012).
  54. Zielonka, J., Kalyanaraman, B. Hydroethidine- and MitoSOX-derived red fluorescence is not a reliable indicator of intracellular superoxide formation: another inconvenient truth. Free Radic Biol Med. 48, 983-1001 (2010).
  55. Chen, X., Zhong, Z., Xu, Z., Chen, L., Wang, Y. 2',7'-Dichlorodihydrofluorescein as a fluorescent probe for reactive oxygen species measurement: Forty years of application and controversy. Free Radic Res. 44, 587-604 (2010).
  56. Karlsson, M., Kurz, T., Brunk, U. T., Nilsson, S. E., Frennesson, C. I. What does the commonly used DCF test for oxidative stress really show. Biochem J. 428, 183-190 (2010).
  57. Belousov, V. V., et al. Genetically encoded fluorescent indicator for intracellular hydrogen peroxide. Nat Methods. 3, 281-286 (2006).
  58. Bjornberg, O., Ostergaard, H., Winther, J. R. Measuring intracellular redox conditions using GFP-based sensors. Antioxid Redox Signal. 8, 354-361 (2006).
  59. Yoo, S. K., Starnes, T. W., Deng, Q., Huttenlocher, A. Lyn is a redox sensor that mediates leukocyte wound attraction in vivo. Nature. 480, 109-112 (2011).
  60. Uusitalo, L. M., Hempel, N. Recent Advances in Intracellular and In Vivo ROS Sensing: Focus on Nanoparticle and Nanotube Applications. Int J Mol Sci. 13, 10660-10679 (2012).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

גילוי ROSשיטת whole mountשיטת התא הבודדמיקרוסקופיה קונפוקליתציטומטריה זרימהגששים פלואורסצנטייםפירוק רקמהסריקות גנטיות
ניתוח של סטרס חמצוני בעוברי דג הזברה
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.