ניתוח של סטרס חמצוני בעוברי דג הזברה

סטרס חמצונים מוגדר באופן ספציפי כתנאי הנובע ממצב חיזור סלולארי לא מאוזן. תגובות חיזור מורכבות המתרחשות באופן שיגרתי בתוך תאים לקבוע את חיזור המדינה הסלולרית. תגובות חיזור מורכבות מכל התגובות כימיות מורכבות בהעברת אלקטרונים בין האטומים של מולקולות ביולוגיות ייצור חיזור וחמצון של מולקולות (כלומר תגובות חיזור). התגובות הללו הן זרז על ידי מינים מופעלים באופן אלקטרוני (כלומר מינים פרו חמצוני-), המתאפיינים בחוסר יציבות מבנית קיצונית והפעלה ספונטנית של אלקטרונים לא מאוזנים שיחליפו עם ביומולקולות השכנה. תגובות לא סדירות אלה לגרום לניזק לדנ"א, carboxylation חלבון, וחמצון שומנים בדם, וסופו של דבר להוביל למוות של תאי ^1. הרמות גבוהות של סטרס חמצונים כבר הקשורות להזדקנות וההתפתחות של מצבים פתולוגיים שונים ^2. יש סטרס חמצוניםדווח להיות אחראי לשינויים בכלי הדם בסוכרת ומחלות לב וכלי דם ^3,4. זה גם משחק תפקיד קריטי בניוון עצבי במחלת אלצהיימר ופרקינסון ^5. יתר על כן, סטרס חמצונים הוכח כגורם קריטי בשלטון התקדמות סרטן ואירועים גרורתי ^6,7. בנוסף, תגובות דלקתיות והחיסוניות עשויות לעורר לחץ חמצוני ותמיכה נוספת ^8.

בתאים חיים, מינים הפרו חמצוני נגזרים מהחמצן (ROS; מיני חמצן תגובתי) או חנקן (RNS; מיני חנקן תגובתי). ROS כולל הידרוקסיל רדיקלי, אניון superoxide ^(OH). (O ₂ ^-), ומי חמצן (H ₂ O _2). RNS העיקרי הוא תחמוצת חנקן ^(NO).. סדרה של מינים תגובתי משניים יכולה להיות שנוצרה על ידי אינטראקציות ספונטניות between ROS וRNS או מתכות בחינם יוני ^9. לדוגמא, אניון סופראוקסיד מגיב עם תחמוצת חנקן ליצירת peroxynitrate (ONOO ^-), ואילו H ₂ O ₂ מגיב עם Fe ^{2 +} יוצר רדיקלים הידרוקסיל. ROS וRNS, בשל יכולתם להגיב עם כמה ביומולקולות, נחשבים איום מסוכן לשמירה על מדינת חיזור הפיזיולוגית ^10. כדי לשמור על תאי מדינת חיזור מצוידים בסדרה של רעלים מולקולות נוגד חמצון ואנזימים. סופראוקסיד דיסמוטאז (SOD), Catalase, peroxidase גלוטתיון וPeroxiredoxins בעצם מהווים האנזימטית-הארסנל נוגד חמצון המספק הגנה תאית ממינים פרו חמצוני כוללים H ₂ O _2, OH וOONO ^{-. 11.} גם מולקולות נוגדת חמצון כמו הוויטמין C ו-E, פוליפנולים וCoenzymeQ10 (CoQ10) הן בעלי חשיבות קריטית כדי להרוות ROS ודה המסוכנת שלהםrivatives ^12,13. עם זאת, ייצור מוגבר של ROS וRNS, או חוסר תפקוד במערכת נוגד החמצון, מסיט את חיזור המדינה הסלולרית לסטרס חמצונים ^14.

חוץ מהקונוטציה השלילית שלהם, ROS יכול לשחק תפקידים פיסיולוגיים שונים בתאים ממוצא שונה. תאים בדרך כלל מייצרים ROS כמולקולות איתות לתווך אירועים ביולוגיים נורמלים כגון הגנת מארחת ותיקון פצע ^15-17. מינים תגובתי בדרך כלל מיוצרים בתאים על ידי אנזימים תאיים כגון NOX (NADPH אוקסידאז) וXO (Xantine אוקסידאז) בתגובה לגורמי איתות, גורמי גדילה, ותנודות תאיים של רמות סידן ^18,19. זה כבר דווח כי ROS עשוי דיפרנציאלי לווסת את פעילותם של גורמים גרעיניים חשובים כגון p53 או מרכיבים תאיים כגון ATM-kinase, רגולטור של התגובה לנזק לדנ"א ^20. באנלוגיה ROS מאוד להשפיע איתות הסלולר על ידי תיווך החמצון דואר ואיון של phosphatases החלבון טירוזין (PTPs), אשר הוקם כמכרעת בויסות העברת האותות ^21. יתר על כן, שיטות proteomic מבוססים להוכיח כי RNS כן הם אחראים לשינויים חלבון מסוימים ושינויים של איתות מולקולרית. RNS להגיב עם קבוצות תיאול ציסטאין שינוים לS-nitrothiols (SNO) ומפעילות מסלולים מולקולריים במקביל למצבים פתולוגיים כגון מחלות דלקתיות ואוטואימוניות ^22,23.

מאז ניסויי תרבית תאים באופן חלקי בלבד לשכפל מספר רב של גורמים הפועלים בvivo, זה הוא עניין רב לבצע מחקרי חיזור במודלים של בעלי החיים ^24,25. כדי להשיג זאת, דג הזברה כבר נחשב מודל בעלי חיים בעלי חוליות מתאים ללמוד דינמיקת סטרס חמצונים ^26. דג הזברה היא מודל למערכת חדשה המעניקה מספר יתרונות ללמוד אירועים תאיים וגנטיים בdev חוליותelopment ומחלות. אשכולות גדולים של עוברים יכולים להיות שנוצרו וזמינים שבועיים לצרכי ניסוי. יתר על כן הבהירות יוצאת דופן האופטית של עוברי דג הזברה, כמו גם גודלם הזעיר, מאפשר הדמיה תא בודדת ומעקב דינמי באורגניזמים שלמים ^27. בעשור האחרון, מספר לא מבוטל של מוטציות דג הזברה כבר נוצר למודל מצבים פתולוגיים אדם כגון סרטן ומחלות גנטיות ^28-31. והכי חשוב, מספר רב של קווים מהונדסים הופק כדי לאפשר הזדמנויות נרחבות של מניפולציות גנטיות וביולוגיות ^32. לדוגמא, קווי דג הזברה רקמות ספציפיות מהונדסים מנוצלים באופן קבוע במחקרי vivo. קווים אלה מבטאים חלבון פלואורסצנטי תחת השליטה של אמרגן שנבחר, המציע את היכולת לזהות תאים בודדים in vivo, כמו גם את המבנה האנטומי שהם מהווים.

מספר מחקרי טוקסיקולוגי כבר השתמשו tהוא דג הזברה כדי להעריך את השפעת vivo של כימיקלים על הומאוסטזיס חיזור, מה שמראה את התאמתם של חוליות זו כמודל חיה לתחום של גילוי תרופות וסטרס חמצונים ^33-35. למרות כמה בדיקות ניאון נבדקו כדי לפקח על סטרס חמצונים בזחלי דג הזברה ^36,37, אין מבחני הוקמו כדי לזהות ולמדוד את הרמות של סטרס חמצונים ברקמות דג הזברה ותאי חיים. כאן אנו מתארים הליך לכימות in vivo של סטרס חמצונים בתאים חי של עוברי דג הזברה. כל כלי הדמיה, FACS מיון, בדיקות ניאון ותנאים פרו חמצוני משולבים כדי ליצור assay פשוט לאיתור והכימות של מיני חמצוני בעוברים ורקמות דג הזברה.

1. הכנת הכלים ופתרונות עבודה

1. הכן את פתרון המים דגים. הפוך פתרון מניות על ידי המסת 2 גרם של 'אושן מיידי "מלחי ים ב50 מיליליטר של מים מזוקקים. הוסף 1.5 מיליליטר מים דגי המניה לליטר מים מזוקק 1 להכין מוכנה להשתמש במי דגים (ריכוז סופי 60 מיקרוגרם / מלחי ים מיליליטר). החיטוי מוכן לשימוש במי דגים לפני השימוש. פתרון זה משמש כמדיום עובר דג הזברה.
2. הכן methylcellulose להרכבת עובר. ממיסים 1.5 גרם של methylcellulose ב50 מיליליטר מים דגי סטרילי. להקל על הפירוק על ידי שימוש במגנט על צלחת ומערבבים. פירוקה של האבקה המלאה עשוי לארוך מספר שעות. בדוק את הפתרון לבהירות וaliquot לתוך צינורות קטנים. חנות ב -20 מעלות צלזיוס למשך חודשים ולהפשיר aliquots בשימוש. צנטריפוגה methylcellulose ב950 XG במשך 5 דקות לפני השימוש. הימנע להקפיא להפשיר מחזורים של aliquots.
3. הכן 50 מיליליטר של tricaine / 3 מ-aminobenzoate אתילמלח ethanesulphonate (פתרון מניות) על ידי המסת 200 מ"ג tricaine ב100 מיליליטר מים ולהתאים את ה-pH ל 7.0 באמצעות טריס-HCl M 1 (pH 9). אחסן את המניה הזו ב 4 מעלות צלזיוס למשך לא יותר מ 30 ימים. זהירות: tricaine היא רעילה. השתמש על פי הנחיות בטיפול מתאימות.
4. גרימת עקה חמצונית בעוברי דג הזברה
   1. הכן את פתרון חמצון לזירוז סטרס חמצונים הגנרית: הפוך 50 מיליליטר של תמיסת חמצון על ידי הוספת H ₂ O פתרון ₂ מניות (מי חמצן; 100 מ"מ) למים דגים. השתמש H ₂ O ₂ של ריכוז סופי בין 2 מ"מ ו100 מיקרומטר. הכן את הפתרון הזה, זמן קצר לפני השימוש בו. פתרון החמצון יכול להיות מיושם גם ההר ROS-זיהוי שלם ושיטות ROS איתור מתא בודד. אין לאחסן את הפתרון הזה. זהירות: H ₂ O ₂ היא מסוכנת, ומזיק על ידי שאיפה, ואם בלע. מגע עם חומר דליק עלול לגרום לשריפה. ידית מתחת למכסת מנוע קטר וללבוש מצו מתאימיםציוד מגן onal.
   2. הכן את פתרון חמצון לזירוז סטרס חמצונים הנגזר מיטוכונדריה: בצע פתרון חמצון המניה (5 מ"מ) על ידי המסת 3.9 מ"ג rotenone ב2 מיליליטר של sulfoxide דימתיל (DMSO). שמור פתרון זה בטמפרטורת חדר בחושך.
      1. ממיסים פתרון מניות rotenone ל10 מיליליטר מים דגים כדי להפוך מוכן לשימוש פתרון. השתמש rotenone בריכוז שבין 5-50 מיקרומטר. אין להשתמש בrotenone בריכוזים גבוהים יותר מאשר 100 מיקרומטר. בריכוזים מתאימים, פתרון חמצון זה יכול להיות מיושם על שני ההר ROS-זיהוי שלם ושיטות ROS איתור מתא בודד. זהירות: Rotenone הוא רעיל ומסוכן. להתמודד על פי הצהרות זהירות מתאימות.
   3. לגרום ללחץ חמצוני על ידי גן לדפוק למטה: Knock-למטה ביטוי גני nrf2a בעוברי דג הזברה על ידי microinjection morpholino כפי שדווח בעבר על ידי Timme-Laragy א ואח', 2012 ^38..
   4. לגרום אוקסידative מתח לאחר נזק לרקמות: לייצר שולי פצע בסנפיר הזנב של עוברי דג הזברה ב72 hpf כפי שתואר בעבר על ידי Niethammer ואח', 2009 ^39..
5. הכן 5 מיליליטר של תמיסת ROS איתור לשיטת ROS איתור תא בודד:
   1. פתרון לגילוי ROS כללי: ממיסים את הבדיקה המולקולרית ROS רגישה גנריים בHBSS (תמיסת מלח מאוזנת של הנקס) על מנת להכין פתרון עובד (טווח ריכוז: בין 2.5-10 מיקרומטר). פתרון זה חייב להיות מוכן זמן קצר לפני השימוש בו.
   2. פתרון לגילוי ספציפי הנגרם על ידי ROS המיטוכונדריה: זמן קצר לפני השימוש, לפזר בדיקה ROS רגישה המיטוכונדריה עם DMSO מה שהופך את פתרון מניות 5 מ"מ. ממיסים פתרון מניות בHBSS כדי להכין פתרון עובד (טווח ריכוז: בין 2.5-10 מיקרומטר).
      הערה: הימנע מחשיפה לאור וחמצן של פתרונות עובדים ROS איתור ופתרונות המניות שלהם. להגן על הצינור מפני אור על ידי שימושרדיד אלומיניום. אל תאחסנו או בדיקות שימוש חוזר מומסים בHBSS. אחסן את פתרונות המניות ב -20 מעלות צלזיוס במשך חודש.
      התראה: טפל בבדיקות מולקולריות וDMSO מתחת למכסה המנוע קטר בהתאם להנחיות מתאימות.
6. הכן 5 מיליליטר של תמיסת ROS איתור לכל שיטת ההר ROS-זיהוי: ממיסים את הפתרון גנרי ROS רגיש מניית הבדיקה (התייצב בDMSO) בHBSS כדי להכין פתרון עובד (טווח ריכוז: 2.5-5 מיקרומטר). הימנע מחשיפה לאור וחמצן. להגן על הצינור מפני אור. הכן את הפתרון הזה לפני השימוש. אין לאחסן מחדש או להשתמש בפתרון זה. התראה: טפל בבדיקות מולקולריות מתחת למכסה המנוע קטר בהתאם להנחיות מתאימות.
7. הפוך 25 מיליליטר של Stop פתרון על ידי הוספת 10 מיליליטר של סרום שור עוברי ל15 מיליליטר של PBS 1X. שמור על תמיסה סטרילית. אחסן את הפתרון הזה ב 4 ° C. פתרון זה נדרש אך ורק לתא בודד - שיטת זיהוי ROS.
8. הגדר את החממה באוויר דג הזברה ב28 &# 176; ג
9. הגדר את צנטריפוגות ב 4 ° C למשך שיטת ROS איתור תא הבודד.

2. זיווג של דגים למבוגרים ובחירה של עוברי דג הזברה

1. זוג דג הזברה מבוגר ההגדרה חוצה על פי פרוטוקולים סטנדרטיים ^40. בחר את הקו המהונדס המתאים בהתאם לצרכי ניסוי ספציפיים.
2. לאסוף את הביצים ומניחים אותם לתוך צלחת 90 ​​מ"מ עם מדיום מים דגים / עובר. שמור על ביצים ב28 ° C עד עוברים יתפתחו ויגדלו לשלב ההתפתחותי הרצוי (למשל, 48 hpf, 72 hpf; hpf: שעות שלאחר הפריה).
3. מסך לפיתוח עוברים. אל תכלול את כל ביצים מופרה או עובר לא מפותח.
4. הרדימי עוברים על ידי הוספת 1 מיליליטר של tricaine (פתרון מניות) ב50 מיליליטר מים דגים.
5. בחר עוברי ניאון Tg תחת סטראו.

3. טיפול בעוברים עם אוקסידנט סוכן

1. השתמש לפחות 30 עוברים בין 48 שעותPF ו72 HPF למצב שונה. שטוף עוברים פעמיים עם מים דגים טריים על מנת להסיר tricaine.
2. פיצול עוברי ניאון לשלוש מנות. שים לא יותר מ 30 עוברים / צלחת.
3. הסר את פתרון הכביסה ולהוסיף 10 מיליליטר של פתרון החמצון או 10 מיליליטר מים דגים כפתרון שליטה.
4. דגירה עובר במשך 10 דקות לשעה 1 ב28 ° C. תקופת הדגירה תלויה ברמה של סטרס חמצונים להיות מושרה ברקמות ספציפיות. תקופות קצרות הן הטובות ביותר כתאים מושפעים מלחץ חמצוני בהדרגה לעבור מוות של תאים.
5. העברה עובר לתוך צלחת חדשה המכילה HBSS ועוברים שטיפה על ידי מתערבל. HBSS טרום חם ב28 ° C.

4. ההר שלם ROS איתור שיטה

1. איסוף עובר לאחר טיפול חמצון ולשים לא יותר מ 10 עוברים בשפופרת קטנה. לשטוף עם HBSS ככל האפשר. להגן על הצינור מפני אור באמצעות רדיד אלומיניום.
2. הוסף 1 מיליליטר של תמיסת ROS איתור לצינור אחד.
3. דגירה עובר בחושך במשך 15 דקות ב28 ° C כדי למנוע חשיפה לאור.
4. במהלך זמן הדגירה להכין שקופיות זכוכית לניתוח עובר שלם. שים 300 μl של methylcellulose בשקופית זכוכית "דיכאון" ופרש אותה על משטח הזכוכית עם קצה פיפטה. למנוע בועות בזמן שחרור methylcellulose.
5. בסוף זמן הדגירה, להסיר באופן מיידי את פתרון ROS איתור ולשטוף פעמיים עם 2 מיליליטר של HBSS. שטוף עוברים על ידי צינור היפוך כמה פעמים. אל פיפטה או מערבולת.
6. עוברים לשאוב לתוך זכוכית פיפטה פסטר. עוברי עמדה ליד הפתח של פיפטה ובעדינות להוציא אותם לתוך methylcellulose. להתמצא העוברים כראוי עם קו ניילון דק.
7. השווה את הקרינה של עוברי שליטה עם עוברים שטופלו. לחלופין, לתקן את הפרמטרים של סטראו הקרינה או מיקרוסקופ confocal, כך שכל העוברים הם צילמו באמצעות אותוהגדרות הדמיה.

5. שיטת ROS איתור תא בודד

1. להתחיל מצעד: 3.5. לוודא שיש לפחות 35 עוברים לכל מצב.
2. העבר את העוברים לתוך צלחת חדשה. הסר מים דגים עד כמה שניתן. הוסף 10 מיליליטר של קר כקרח PBS 1X ו400 μl של קוקטייל מעכבי פרוטאז. ידני dechorionate עוברים עם מלקחיים ולהסיר את שק החלמון עם מחט עדינה. הערה: הסרת שק חלמון מבטיחה דגימות נקיות לניתוח FACS הבא. ניתן להימנע בשלב זה על פי מכשיר FACS.
3. העברת עוברים-yolked דה לתוך צלחת 24 גם multiwell (15 עוברים / טוב) ולהסיר את כל המים הדגים.
4. הוסף 300 μl של HBSS, 30 P collagenase μl, 50 μl טריפסין-EDTA בכל טוב.
5. Homogenize עוברים על ידי pipetting בעדינות מעלה ומטה עם טיפ חזק פיפטה (1,000 μl).
6. לדגור על C ° 28 עבור 20 דקות וhomogenize דגימות על ידי pipetting כל 5 דקות.
7. בדוק disr רקמהuption ידי התבוננות aliquot של homogenate במיקרוסקופ המתחם. להקל על השעיה תא בודדת על ידי pipetting. אל דגירה עובר במשך יותר מ 30 דקות.
8. עצור את התגובה על ידי הוספת 200 μl של להפסיק פתרון. מערבבים על ידי pipetting בעדינות.
9. העבר את ההשעיה תא לתוך צינור מראש צונן עם תחתית צמודה. שמור צינור על קרח ולהימנע מחשיפה לאור.
10. צנטריפוגה במשך 5 דקות ב 250 XG ב 4 ° C.
11. הסר את השלב העליון ותאים מחדש להשעות עם HBSS הקר כקרח בעדינות על ידי pipetting.
12. ספירת תאים ולוודא שיש לך את אותו המספר של תאים בכל הדגימות שלך. אל תשתמשו בפחות מ -2 x 10 ⁶ תאים.
13. תאי צנטריפוגה במשך 5 דקות ב250 XG ב 4 ° C.
14. הסר supernatant ולהשעות את גלולה עם 1 מיליליטר של HBSS המקורר קרח המכיל את הבדיקה ROS רגישה.
15. דגירה הצינור בטמפרטורת חדר למשך 3 דקות בחושך. להשתנות זמן דגירה על פי הרמה של סטרס חמצונים וכדי לאהוא הרגישות של הבדיקה.
16. העבר את התאים לצינור FACS. שמרו צינורות על קרח ולהימנע מחשיפה לאור לפני ניתוח FACS.
17. למיין תאים עם סדרן הקרינה המופעל תא (FACS). אורכי גל נקבע בהתאם לקרינת Tg רקמות (לדוגמא, ה-GFP) ואת ספקטרום עירור / פליטה של החללית המולקולרית המשמשת לזיהוי ROS (למשל, בדיקות ROS רגישות המיטוכונדריה ספציפיות, בדיקות ROS רגישות גנריות).
18. עבור כל תנאי, למדוד את כל הדגימות באותה ההפעלה הניסיונית על ידי יישום אותן הגדרות FACS. לחשב את אחוז תאי ניאון כממוצע של משכפל ביולוגי שונה. לנתח לפחות שתי חזרות לכל מצב.

על ידי יישום השיטה שתוארה כאן, אנו יכולים בקלות למדוד ולזהות סטרס חמצונים (ורמות ROS) ברקמות עוברי דג הזברה. לאחר חציית דג הזברה מבוגר, ביצים נאספות ואפשרו לפתח ב28 C ° 72 הודעה hr הפריה (hpf). על מנת לגרום ללחץ חמצוני, אנו מציעים שתי גישות שונות: 1) טיפול בעוברים עם ריאגנטים פרו חמצון חזקים או 2) ההשקעה בROS קידום לאחר פגיעה ברקמות.

בגישה הראשונה, שהעסקנו שני חומרים כימיים שונים, בהתאם לצרכים הספציפיים: מי חמצן (H 2 O 2), כסוכן ROS הסלולרי הגנרית להרכיב, וrotenone, כנהג ROS המיטוכונדריה הספציפי. Rotenone הוא מעכב שלי מורכב של ETC, שderegulations הוא סיבתי של סטרס חמצונים 41.

בגישה השנייה, שנגרמים הצטברות של ROS על ידי יצירת פצע בסנפיר הזנב של עובר דג הזברה39. לחלופין, ניתן לקדם תנאי עקה חמצונית ברקמות דג הזברה על ידי דריסה עם הזרקת morpholino מסלול תגובת חמצון Nrf2 שהוא ההגנה סלולרית העיקרית כנגד ההשפעות הרעילות של סטרס החמצונים 38.

ברגע שסטרס החמצונים הוא מושרה בעוברי דג הזברה, ההצטברות של מיני חמצן תגובתי (ROS) ניתן למדוד באמצעות בדיקות כלליות או ספציפיות ROS המיטוכונדריה רגישות, אשר הופכות ניאון עם הפעלה (כלומר חמצון).

ניתן לנתח עוברים שטופלו על ידי שימוש בכל שיטת ההר ROS-זיהוי או על ידי יישום שיטת זיהוי תא ROS אחת כפי שסוכם באיור 1. הבחירה בין השיטות מסתמכת על הצורך בביצוע מדידה איכותית או כמותית של סטרס חמצונים. נציג תוצאות של שני השיטות מיוצגות באיור 2 ואיור 3.

שיטת ההר ROS איתור כל

איור 2 מראה את יישום שיטת ההר ROS איתור השלם לin vivo הדמיה של סטרס החמצונים. בפרט, בשיטה זו יושמה כדי לעקוב אחרי שתינו לחץ "חזק" חמצוני שנוצר על ידי טיפולים פרו חמצון אקסוגניים כמו גם סטרס חמצונים שנוצרו על ידי יותר מצבים פיסיולוגיים כגון פציעות פצע או מחיקת גן "נמוכים".

רמות פיסיולוגיות של מיני חמצוני הנגרמות על ידי יצירת מיקרו פציעה או פצע רחב בסנפיר הזנב של עובר דג הזברה לחיות ב72 hpf. הוכח כי לאחר פציעה, H 2 O 2 מצטבר בדקות פצע שוליים 20 לאחר הפצע 39. על מנת להמחיש את ההצטברות של לחץ חמצוני בשוליים הפצע, עוברים הודגרו עם גנריבדיקה ROS רגישה וצלם ב20 דקות לאחר פציעתם 39. על ידי השוואת סנפירי זנב שלמים עם זנבות פצועים, אפשר להבחין הצטברות של הבדיקה הניאון בשוליים הפצע (איור 2 א). אות הקרינה חלשה שאינו ספציפית מזוהה בכל רחבי רקמת סנפיר הזנב בשני התנאים.

על מנת לאמת את ההצטברות הספציפית של החללית ROS רגישה בשוליים הפצע, H 2 O 2 הרמות בפצע כבר הוריד בגישה תרופתית. מאז זה כבר הוכיח כי H שולי פצע 2 O 2 צבירה היא מאוד רגיש לVAS2870 DUOX-מעכב 39, טופלו מראש עובר עם מעכב זה לפני פציעתם. השוואה של הקרינה של הבדיקה ROS רגישה, מעוברים ובקרות המתאימות טרום טיפול VAS, מצביעה על כך שהאות תלויה בהצטברות ROS (כלומר H 2 O 2) (איור 2).

בנוסף, יצרו רמות גבוהות של מיני חמצוני ברקמות דג הזברה על ידי טיפול בעוברי דג הזברה עם rotenone. עוברים שטופלו Rotenone ובקרות הודגרו עם בדיקה ROS רגישה גנריות כדי לזהות באופן ספציפי מיני ROS. לאחר מכן, הבדיקה נשטפה החוצה והעוברים היו הדמיה תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי סטריאו. סטרס החמצונים זוהו בכל הגוף של העוברים (איור 2 ג). תמונות בהגדלה גבוהה מראות אזורי אנטומיים שבו החללית עוברות מטבוליזם בהצלחה (איור 2 ד). תמונות שדה בהיר (פנלים העליונים) מבחינות מבנים אנטומיים, בעוד תמונות הקרינה (לוחות נמוכים) מצביעות על תאי ROS-חיוביים. כפי שמוצג על ידי תמונות ניאון התוצאות הן בעיקר דיווח איכותי של זיהוי סטרס חמצונים, אשר מושגת על ידי השוואת שליטה עם עוברים שטופלו.

תא בודד-ROS איתור שיטה

איור 3 חלקות דיווחי FACS הנציג וכימות של סטרס חמצונים על ידי יישום שיטת זיהוי תא הבודד ROS. שיטה זו הותאמה כדי למדוד את רמות לחץ חמצוני בתאי דג הזברה שהיו נתונים לתנאים פרו חמצון כפי שדווחו בפרוטוקול ומפורט באגדות דמות. כפי שתואר, סטרס החמצונים כבר נמדדו על ידי דוגרים רקמות דג הזברה ניתקו לתוך תאים בודדים עם בדיקה מולקולרית ROS רגיש. מאז הליך הניתוק וFACS עצמו עלול לגרום לניזק לתאים, הניתוח של דגימות דורש שרק "תאי חיים" נחשבים לquantitation סטרס חמצונים. בהתאם לכך, תאים ניתקו מנותחים על ידי בחירה את החלק היחסי של תאים המציגים פרמטרים "תא חי" פיזיים (איור 3 א) ועל ידי לא כולל תאים מתים (איור 3 ב). לפיכך, הדגימות נבדקות ועבוררמות לחץ חמצוני על פי הקרינה של הבדיקה ROS רגישה ולהצגת הקרינה אנדוגני כגון החיוביות עבור ה-GFP (איור 3 ג). מדגם ביקורת שלילי לבדיקת ROS רגישה צריך להיות כלול על מנת להעריך את לחץ חמצוני הנגרם על ידי טיפול ונהלים טכניים (איור 3 ג; פנל: בקרה -). כימות עלילת FACS יחסית הפגין בהיסטוגרמות מראים מדידות של משכפל שונה ביולוגי (איור 3D-E).

חוץ לכמת את רמת לחץ חמצוני על טיפולים מי חמצן, שיטה זו יושמה כדי לכמת את רמות לחץ חמצוני בתנאים פיסיולוגיים כגון בmorphants nrf2a ובקרות המתאימות (איור 3F).

יתר על כן, על ידי שילוב של שיטת זיהוי ROS תא הבודד עם בדיקות ROS רגישות ספציפיות כגון RO המיטוכונדריהבדיקות ה-S-רגישה, אפשר גם למדוד לחץ חמצוני בהקשר של טיפולים ממוקדי מיטוכונדריה הספציפיים פרו חמצון (איור 3G).

איור 1. דמות סכמטי של השיטה למדידת רמות ROS בעוברי דג הזברה. מבוגרים דג הזברה הם חצו בטנקי הרבייה המתאימים. ביצים מופרות נאספות אז לתוך צלחות ומאוחסנות ב 28 ° C כדי לאפשר עובר להתפתח באופן מלא. אינדוקציה של סטרס חמצונים יכולה להיות מושגת בדרכים שונות, או על ידי טיפולי תרופות או על ידי עלבונות גנטיים או פיזיים. לחלופין, במקרה שעבר מוטציה גנטית הוא ניתח, ניתן לדלג דגירה זה ולהמשיך הלאה. בשלב זה, ניתן להמשיך לאחר שתי שיטות שונות. על פי "כל מ 'שיטת ount ROS איתור "(משמאל), עובר דג הזברה מודגרת מייד עם בדיקה (1) ולאחר מכן ניתחתי עם הקרינה או מיקרוסקופ confocal (2) ROS רגישה ניאון. בשיטת "תא בודד ROS איתור" (מימין), עובר דג הזברה הם ניתקו לתוך תאים בודדים (1), הודגרו עם בדיקה ROS רגישה ניאון (2) ונותח על ידי FACS לגילוי הקרינה ולכמת (3). בעוד שיטת "שלם ההר-ROS זיהוי" מאפשרת זיהוי עקה חמצונית בעוברי חיים כassay איכותי, "תא יחיד המבוססים" מענקי שיטה איכותיים ומדידות כמותיות של רמות סטרס חמצונים בעיקר.

איור 2. נציג תוצאות של כל שיטת ההר ROS איתור.) עוברי דג הזברה ב72 hpf היו נתוניםלפציעתם כפי שתואר בעבר על ידי Niethammer et al. 2009 39. תמונות confocal נציג להראות הצטברות מינים פרו חמצוני (ROS) (ראש חץ) בשוליים הפצע של סנפיר הזנב הפצוע. מיני חמצוני זוהו עם חללית ROS גנריות (CellROX; 2.5 מיקרומטר) 20 דקות לאחר שהפצע כבר עשה. בר סולם 20 מיקרומטר. ב ') תמונות confocal נציג מראים מרווח בסופו של עוברי דג הזברה ב72 hpf. עוברים טופלו קודם לכן בVAS2870 (20 מיקרומטר) או DMSO ל90 דקות לפני הפצע כבר עשה. ROS זוהו עם בדיקה הגנרית ROS רגישה (CellROX; 2.5 מיקרומטר) 20 דקות אחרי הפצע. בר סולם 20 מיקרומטר. C) תמונה של כל גוף מראה סטרס חמצונים הנגרם rotenone בעוברי דג הזברה. סטרס חמצונים הוא מאוד מזוהה באזור הזנב של העוברים כפי שמוצגים בפנל D). Rotenone הוא מעכב חזק של ETC המיטוכונדריה המשפיע בעיקר עלוב חייםתאי שריר etal בדג זברה. סרגל קנה מידה, 180 מיקרומטר.

איור 3. תוצאות נציג של התאים בודדים בשיטת ROS איתור.) עלילת הנציג FACS מראה מדגם טיפוסי של עוברי דג הזברה ניתקה לתאים בודדים. תאי חיים הם מגודרים באזור R1 פי עם הפרמטרים FSC-H ו SSC-H. SSC-H: 539 (מתח), 1.0 (AmpGain), מצב: ליניארי; FSC-H:. E00 (מתח), 2.1 (AmpGain) B) עלילת הנציג FACS מראה מדגם טיפוסי של עוברי דג הזברה ניתקה לתאים בודדים. לפני ניתוח FACS, המדגם כבר הודגרו עם יודיד Propidium (PI; מיקרוגרם / מיליליטר 1) במשך 5 דקות. תאים מתים הם מגודרים באזור R2 פי עם הקרינה לצרכן (ערוץ fl2-H). FSC-H: E00 (מתח), 2.1 (AmpGain), מצב: ליניארי, SSC-H: 539 (מתח), 1.0 (AmpGain), מצב: liקרוב. ערוצי מתח: FL-2:. 613 חלקות FACS הנציג התחבר C) מראים ניתקו עוברי דג הזברה נתון לטיפול פרו חמצון (H 2 O 2) ובקרות המתאימות. תאי האנדותל הם דמיינו ידי ערוץ ה-GFP. חלקות FACS מייצגות את כל התאים מושפעים סטרס חמצונים (ROS) על UL ו UR. תאים שליליים נרשמות על רביעים נמוכים יותר (LL וLR). TG (Kdrl: GFP) עוברי דג הזברה s843 ב48hpf הודגרו עם H 2 O 2 (2 מ"מ) או H 2 O כשליטה ל10 דקות. לפני ניתוח FACS, עוברים מעובדים כמתואר בפרוטוקול. תאים מושפעים מלחץ חמצוני שזוהו באמצעות בדיקה הגנרית ROS רגיש ניאון (CellROX; 2.5 מיקרומטר). מדגם לא מודגרות עם החללית ROS רגישה נכלל כביקורת שלילית. השוואת המדגם נתון לטיפול פרו חמצון עם השליטה בהתאמה, את מספר התאים זמם על רביעים העליונים (UL + UR) הוא גבוה יותר. acquis FACSהגדרות ition היו כדלקמן: ערוצי מתח: FL-1: 582 התחבר; היסטוגרמה 410 התחבר ד ') מראה את אחוז התאים (UL + UR) מושפע מלחץ חמצוני בH 2 O עוברים שטופלו 2 ובקרה בהתאמה: FL-4.. מדידות הקשורים לדגימות שמוצגת ב-C. תאים מושפעים מלחץ חמצוני שזוהו באמצעות בדיקה הגנרית ROS רגיש ניאון (CellROX; 2.5 מיקרומטר). תוצאות הן הממוצעים של n = 2 משכפל ביולוגי שונה ± SD. E) היסטוגרמה המראה את אחוז תאי אנדותל (+ GFP) מושפע מלחץ חמצוני (ROS +) בH 2 O עוברים שטופלו 2 ובקרה בהתאמה. מדידות הקשורים לדגימות שמוצגת ב-C. תוצאות הן הממוצעת של n = 2 משכפל שונה ביולוגי ± SD. F) היסטוגרמה המראה את אחוז התאים המושפע מלחץ חמצוני (ROS +) בmorphants nrf2a (nrf2a MO) ובקרות המתאימות(Ctrl MO) ב24 hpf. תוצאות הן הממוצעים של n = 2 משכפל ביולוגי שונה ± סטיית תקן G) היסטוגרמה המראה את אחוז התאים המושפעים מלחץ חמצוני של המיטוכונדריה בעוברים שטופלו (Rotenone;. 10 מיקרומטר) ובקרות המתאימות (Ctrl; DMSO) ב72 hpf. לאחר הניתוק של עוברים לתוך תאים בודדים, מתח חמצוני של המיטוכונדריה (ROS המיטוכונדריה +) נמדד עם בדיקה של המיטוכונדריה ספציפית (MitoSOX; 5 מיקרומטר). תוצאות הן הממוצעים של n = 3 משכפל ביולוגי שונה ± SD.

למחברים אין מה לחשוף.