הדמיה ברזולוציה סופר של שלפוחית ​​צפופות ליבות עצבית

סיכום

אנו מתארים כיצד ליישם מיקרוסקופיה לוקליזציה photoactivated (PALM) מבוסס מחקרים של שלפוחית ​​בנוירונים קבוע, בתרבית. רכיבי מפתח של הפרוטוקול שלנו כוללים שלפוחית ​​תיוג עם מפלצות photoconvertible, איסוף תמונות גולמיות נדגמו בדלילות עם מערכת מיקרוסקופיה ברזולוציה סופר, ועיבוד התמונות גולמיות כדי לייצר תמונה ברזולוציה סופר.

תקציר

זיהוי של הקרינה מספק את הבסיס לשיטות מיקרוסקופיה רבות מנוצלים באופן נרחב ומתקדמות במהירות המועסקות ביישומים ביולוגיים ורפואיים מודרניים. עוצמות של הקרינה כוללות את הרגישות שלו, סגוליות, ותאימות עם הדמיה לחיות. למרבה הצער, צורות מקובלות של מיקרוסקופ פלואורסצנטי סובלות מחולשה, ברזולוציה אחת גדולה עקיפה מוגבלת במטוס ההדמיה, אשר פוגעת לימודים של מבנים עם ממדים קטנים יותר ~ 250 ננומטר. לאחרונה, מגבלה זו כבר להתגבר עם ההקדמה של טכניקות מיקרוסקופ פלואורסצנטי רזולוציה סופר, כגון מיקרוסקופיה photoactivated הלוקליזציה (PALM). שלא כמו עמיתיהם קונבנציונליים שלה, PALM יכול להפיק תמונות ברזולוציה רוחב של עשרות ננומטרים. זה ובכך ניתן כיום להשתמש בקרינה, עם העוצמות עצום שלו, על מנת להבהיר ספקטרום של תכונות נגישים בעבר של מבנה וארגון תאיים. _content "> לרוע המזל, PALM הוא לא טריוויאלי ליישם, ואסטרטגיות מוצלחות לעתים קרובות חייבת להיות מותאם לסוג המערכת תחת מחקר. במאמר זה, אנו מראים כיצד ליישם מחקרי PALM יחיד צבע של מבנים בועי בנוירונים קבועים, בתרבית. PALM הוא אידיאלי למחקר של שלפוחית, אשר יש ממדים, כי בדרך כלל נעים בין ~ 50-250 ננומטר. צעדי מפתח בגישה שלנו כוללים תיוג נוירונים עם photoconvertible (מירוק לאדום) מפלצות מטענים שלפוחית, איסוף תמונות גולמיות שנדגמו בדלילות עם מערכת מיקרוסקופיה ברזולוציה סופר, ועיבוד התמונות גולמיות כדי להפיק תמונת PALM ברזולוציה גבוהה. אנחנו גם להדגים את היעילות של הגישה שלנו על ידי הצגת תמונות יוצאת דופן נפתרו היטב של שלפוחית ​​צפופות ליבות (DCVs) בנוירונים בהיפוקמפוס בתרבית, שלהפריך את ההשערה כי סחר extrasynaptic של DCVs מתווך בעיקר על ידי אשכולות DCV.

מבוא

מספר התהליכים התאיים תלוי בסחר בתיווך שלפוחית ​​מדויק ויעיל של ביומולקולות ליעדי subcellular ספציפיים. דוגמא בולטת אחת היא הרכבה הסינפטי, אשר קדמה משלוח נע ארוך, בתיווך שלפוחית ​​של מרכיבים הסינפטי מאתרים של קיום חיים בסומה העצבית לאתרים מראש וpostsynaptic פוטנציאל דיסטלי ^1.

מיקרוסקופ פלואורסצנטי הוא שיטה חזקה והפופולרית של לימוד סחר בשלפוחית. נקודות חוזק של הטכניקה כוללות את הרגישות שלו, סגוליות, ותאימות עם הדמיה לחיות ^2. למרבה הצער, עד יחסית לאחרונה, הטכניקה סבלה מחולשה אחת גדולה, ברזולוציה מוגבלת דיפרקציה ^2, דבר המקשה מחקרים של מבנים עם ממדים קטנים יותר ~ 250 ננומטר. לאחרונה, ברזולוציה רוחב במיקרוסקופ פלואורסצנטי עלתה המחסום העקיפה עם ההקדמה של מיל הקרינה רזולוציה סופרטכניקות croscopy, כגון PALM ^3. ברזולוציה הרוחב של PALM, עשרות ננומטרים, היא אידיאלית למחקר של שלפוחית, אשר יש ממדים שבדרך כלל נעים בין 50-250 ננומטר ~ ^4. זה ובכך ניתן כיום להשתמש בקרינה, עם העוצמות עצום שלו, על מנת להבהיר ספקטרום של תכונות נגישים בעבר של שלפוחית, כוללים כמה היבטים של הסחר שלהם לאתרי subcellular ספציפיים.

PALM הוא לא טריוויאלי ליישם, ואסטרטגיות מוצלחות לעתים קרובות חייבת להיות מותאמים לסוג המערכת תחת מחקר. כאן אנו מתארים כיצד ליישם מחקרי PALM של מבני ועי, ואנחנו מדגימים את היעילות של הגישה שלנו למקרה של DCVs בנוירונים בהיפוקמפוס. בפרט, אנו משתמשים PALM להתייחס להשערה כי הסחר של DCVs לסינפסות בנוירונים בהיפוקמפוס מתווך על ידי אשכולות DCV ^5-8.

סחר בתיווך Cluster של שלפוחית ​​לסינפסות בפיתוח neurons היא אפשרות מעניינת, כי זה עשוי להקל על ייצוב הסינפטי מהיר והרכבה ^9,10. חסידי סחר באשכולות של DCVs לצטט את הגודל נראים הגדול של puncta ניאון extrasynaptic מחסה מטען DCV אקסוגני כראיות התומכות באשכולות ^6. עם זאת, puncta אלה מופיעים בתמונות שנוצרו תוך שימוש בטכניקות עקיפה מוגבל הקרינה מיקרוסקופית, שאינם מתאימות לגודל אפקטים ייחודיים הנובעים מעקיפה מאלה הנובעים מאשכולות.

כדי לפתור בעיה זו, אספנו הקרינה widefield קונבנציונלית ותמונות PALM של נוירונים בהיפוקמפוס להביע מפלצות ממוקדות לDCVs. ניתוח של התמונות הללו נחשף כי> 92% מאשכולות DCV extrasynaptic המשוערת בתמונות קונבנציונליות נפתרים כ80 ננומטר puncta ¹¹ (פרט DCV בגודל) בתמונות PALM. לפיכך, נתונים אלה במידה רבה לפסול את השערת האשכולות כפי שהוחל על DCVs בפיתוח hippocaנוירונים mpal.

פרוטוקול

1. לדוגמא הכנה

1. הכן את ה-DNA מקודד הכימרה photoconvertible או photoactivatable הממוקד לDCVs, תוך שימוש בטכניקות ביולוגיה מולקולרית סטנדרטיות.
   הערה: אפשרות אחת היא קידוד DNA plasminogen activator רקמות-Dendra2 הכימרה (tPA-Dendra2). Dendra2 הוא חלבון photoconvertible שעובר מירוק לפליטה אדומה בחשיפה ^ל12 אור אולטרה סגול.
2. נוירונים בהיפוקמפוס תרבות ב# כיסוי 1.5 ביצועים גבוהים מחליק ל~ 5-10 ימים, בעקבות פרוטוקולים סטנדרטיים ^13.
3. Transfect לפתח נוירונים בהיפוקמפוס באמצעות מגיב שומנים קטיוני.
   הערה: הזיהום בתיווך ויראלי הוא יעיל יותר לתאים בוגרים. גישה חלופית זו תוארה בפירוט במקומות אחרים ^14.
   1. הכן את צינור 1.5 מיליליטר מכיל ~ 1 מיקרוגרם של ה-DNA ו250 μl של מדיום מינימאלי חיוני (MEM) וצינור 1.5 מיליליטר שני המכיל 4 μl של מגיב השומנים קטיוני ו250 μlשל ממ.
   2. דגירה הפתרונות למשך 5 דקות.
   3. לשלב בין שני פתרונות ודגירה את התערובת במשך 30 דקות נוספות וכתוצאה מכך.
   4. במהלך הדגירה, להכין את מנה המכילה כמה מיליליטר של מדיום התרבות חיממה 37 ° C.
   5. בעדינות להעביר את התלושים לכסות מכילים נוירונים לצלחת המכילה מדיום חם ומוסיף את תערובת transfection.
   6. הטה את הצלחת בעדינות ולאחר מכן למקם אותו בחממה ב37 מעלות צלזיוס במשך 90 דקות.
   7. לחזור לנוירונים "הצלחת הביתה" שלהם ולחכות ~ 12-18 שעה.
4. תקן את תאי דקות 45 ב4% paraformaldehyde סוכרוז 4% / בופר פוספט (PBS, pH 7.4) חימם ל37 ° C.
   הערה: בניסויי PALM, חשוב להשיג שימור טוב של ultrastructure, ופרוטוקולי קיבעון פורמלדהיד סטנדרטיים המשמשים עבור מכתים immunofluorescence הם בדרך כלל לא מספיק ^15. אחת סיבות חשובות לשימור מבני עניים היא f מספיקזמן ixation בגלל קיבעון פורמלדהיד כרוך היווצרות adduct וcrosslinking חלבון, והתהליך השני הוא איטי למדי ^16. קיבעון דקות 45 מסייע להפחית את הבעיה הזו ללא הפסד הנגרם overfixation לגילוי של הקרינה.
5. כיסוי לשטוף מחליק ~ 10x עם PBS המסונן.
   הערה: זו מפחיתה מזהמים ניאון. דגימות תמונה במהירות יחסית לאחר קיבוע. בתאי ביניים, לאחסן ב 4 ° C בPBS המסונן במכל אור חזק.
6. התלושים לכסות הר המכילים תאי עצב בתא ב-PBS המסונן.
   הערה: המדגם חייב להיות מותקן במדיום מימית, כמו PBS, עם מקדם שבירה נמוכה מזו של זכוכית, ליישם הקרינה כוללת פנימית השתקפות (TIRF) מבוססת תאורה. תאורה מבוססת TIRF היא מאוד שימושית כי fluorophores להחליק הפרוקסימלי כיסוי רק שמחים, ויש ירידה קשורה גדולה בקרינת רקע ^17.

2. רכישת תמונה

1. הפעל את מערכת ההדמיה ברזולוציה סופר.
   1. הדלק את מנורת הקשת.
   2. להעיף את "מערכת / המחשב" ומתגים "מרכיב" (במתג מרחוק הכוח) ל" על ".
   3. הפעל את המחשב (אחרי תחנת לוח / עגינה שליטת מיקרוסקופ מגיע על).
      הערה: תחנת העגינה יכולה לשמש כדי לשלוט ולפקח על תכונות רבות של אופטיקה ונתיב אור, בעיקר בחירה של מטרה ומיקוד.
   4. לחץ לחיצה כפולה על סמל התוכנה ולבחור באפשרות "מערכת ההפעלה" בשיח הכניסה.
2. לבחון את הדגימה.
   1. פתח את החזית ולוחות גישה עליונה על ארון בטיחות לייזר.
   2. הטה את זרוע האור המועברת לגשת לבמה ויעדים.
   3. שים שמן על הצמצם המספרי אלפא Plan-Apochromat 100X / NA = 1.46 אובייקטיבי (TIRF).
      הערה: מטרה גבוה NA 63X ניתן להשתמש בם במקום 100X.
   4. הר את המדגם על הבמה, ולהעלות את המטרת דואר למדגם.
   5. לנטר את מיקום העדשה באמצעות פונקצית XYZ של תחנת העגינה. עצור כאשר העדשה היא באצטדיון של התמקדות (למשל, z ~ 2.50 מ"מ).
   6. באופן מלא לסגור את לוחות הגישה.
      הערה: כדי לעסוק בטיחות הלייזר.
   7. לכוונן את הפוקוס באמצעות oculars ולחצנים בכרטיסיית אתר.
      הערה: כרטיסיית אתר מספקת גישה לכפתורים המייצרים תאורה מבוססת מנורת קשת ומאפשר תצפית ישירה של המדגם עם oculars. בדומה לכך, כרטיסיית הרכישה מספקת גישה לכלים המייצרים תאורה מבוססת לייזר ומאפשר ללכוד תמונה על ידי המצלמה.
      1. עבור לכרטיסייה לאתר, לבחור "טראנס על".
      2. לחץ על סמל ההרחבה העיני.
         שים לב: זה מעלה את סכמטי של נתיב האור. תכונות של נתיב האור ניתן לשנות על ידי לחיצה השמאלית סמלים מתאימים בסכמטית או על ידי שימוש במסך המגע בתחנת העגינה. לדוגמא, מסנןמתאים לצפייה פליטה מDendra2 ניתן לבחור באמצעות סמל אקדח רפלקטור.
      3. תסתכל לתוך העיני, ולהביא את התאים אל מוקד באמצעות תחנת העגינה כמדריך.
         הערה: המדגם יהיה מאוד מאוכלס בדלילות עם תאי ניאון כי נוירונים בהיפוקמפוס קשים transfect, ולכן יכולים להיות קצת מסובך להתמקד באמצעות התאורה באה לידי ביטוי. אם זה המקרה, השתמש בתאורה משודרת וקריאת z של תחנת העגינה כמדריך.
      4. למתג את האור "כבוי" לאחר ההתמקדות.
3. זהה את תא שהוא די בהיר, מציג הקרינה punctate, ויש לו מורפולוגיה קלאסית שמעידה על בריאות טובה.
   1. בחר אור מוחזר ומתאים מסנן לצפייה פליטה ירוקה מDendra2.
   2. סרוק את תלוש לכסות לתאים לבטא מפלצות Dendra2 באמצעות עירור בעצימות נמוך אור.
4. לעבור לACQכרטיסיית uisition.
   1. השתמש "מנהל הניסוי" כדי לטעון את תצורת רכישת PALM אשר נועדה כראוי או בקלות שונה.
      הערה: אם אין ניסוי כזה קיים, לעצב תצורה ניסיונית החל שימוש בהגדרות הבאות כמדריך: מחווני כוח לייזר: 405 ננומטר (~ 0.01% לליזר mW 50); 488 ננומטר (~ 3% לליזר mW 100); 561 ננומטר (~ 40% לליזר mW 100); זמן חשיפה: ~ 50 אלפיות שניים; רווח מצלמה: ~ 200; רכישה רב ממדית: סדרת זמן (מחזורים = 30,000, מרווח = 0); שירים: ננומטר 488 עם עלית תאורה, וננומטר 561 עם תאורה מבוססת TIRF (ראה שלב 2.5.1); מטרה: 100X (NA = 1.46); מחוון זווית TIRF: שכיחות זווית ~ 67-72 °; גודל פיקסל: 100 ננומטר; שדה הראייה: TIRF (האפשרויות חלופיות להניב עוצמות לייזר גבוהות יותר ומשמשות לfluorophores שקשה יותר לאקונומיקה).
   2. לחץ על "כן" כאשר תפריט מוקפץ מופיע בשאילתא על מעבר בלייזרים.
5. להביא את התמונהשל התא אל מוקד במטוס המצלמה.
   1. בחר את מסלול לייזר עלית תאורת 488 ננומטר.
      שים לב: מסלולי תצורות קרן משמשות במהלך הדמיה. כאן, שמות רצועות נקבעות על ידי העירור באורך הגל שמייצר הפליטה כי הוא עבר למצלמה. לדוגמא, מסלול ננומטר 561 משתמש הן 405 ו561 קווי לייזר ננומטר, אבל קוביית הסינון עוברת רק פליטה מDendra2 photoconverted נרגשת על ידי 561 ננומטר אור למצלמה.
   2. למקד את התמונה של התא במצלמה באמצעות הכפתור "הרציף" הרכישה.
6. אסוף תמונת widefield קונבנציונלית.
   1. השתמש בלחצן "הצמד".
   2. שמור את התמונה על ידי לחיצה על התפריט "הקובץ" והבחירה באפשרות "שמירה / שמירה בשם."
7. הגדר את התאורה מבוססת TIRF.
   1. בחר מסלול 488 ולעבור ל" TIRF "באמצעות הלחצן EPI / TIRF.
   2. בחר רכישה "רציפה".
   3. התאם tמחוון תאורה הוא מבוסס TIRF.
      הערה: TIRF מושגת כאשר יש מחשיך פתאומי של רקע ויכול להיות ממוקד הדגימה באחת מטוס ^18. אם התכונות חדשות לעין באמצעות התמקדות עד למדגם, זווית השכיחות נמוכה מדי, כי בTIRF יש רק אחד מטוס של מוקד.
   4. בדוק את זווית TIRF באמצעות המסלול 561 עם לייזר 405 ננומטר "את".
   5. הפעל את לייזר 405 ננומטר בחזרה "על" לפני ביצוע ניסוי PALM.
8. איסוף נתונים PALM.
   1. להיט "להתחיל את ניסוי."
      הערה: אם ירצה, לפתוח את לשונית "אפשרויות עיבוד מקוונות" וסמן את "PALM המקוון עיבוד" ו "Fit Gauss2D" (לפני תחילת הניסוי) כדי לפקח על תמונת PALM שוחזרה במהלך איסוף הנתונים גולמי. זה יקל על הערכה של איכות הנתונים ובכך כדאיויות המשך תהליך איסוף הנתונים יחסית זמן רב.
   2. מבחינה ויזואליתלפקח photoconversion.
   3. הגבר את העצמה של לייזר 405 ננומטר (photoconverting) כאשר פוחת Dendra2 photoconversion (בדרך כלל לאחר רכישת ~ 10,000 תמונות גולמיות).
   4. להמשיך בניסוי אם עליות photoconversion. אחרת, לעצור את הניסוי (ללא אובדן נתונים) על ידי להכות את הכפתור "עצור" הצעד הנוכחי.
   5. שמור את התמונות כאשר איסוף הנתונים הושלם (לאחר ~ 15 דקות).

3. עיבוד תמונה, תצוגה וניתוח

1. בהעדר תמונות עיבוד, תהליך מקוון גלם שנשמרו בדיסק.
   1. לחץ על כרטיסיית העיבוד, פתח את כרטיסיית השיטה, ובחר "PALM".
   2. בחר "PALM" שוב מארבעה suboptions.
   3. לכו לתפריט הקובץ, לפתוח ולראות את הקובץ של עניין, ופגע "בחירה".
   4. Hit "חלים".
      הערה: פעולה זו תפעיל לוקליזציה שיא / ממצא fluorophore ושיא עם opti ברירת המחדלפיירפוקס. במידת צורך, פסגות גם יכולות להיות מקובצים באמצעות הכרטיסייה "PAL-הקבוצה". קיבוץ מקצה פסגות המופיעות במספר פריימים ברציפות למולקולה בודדת אם קואורדינטות שיא הן דומות מספיק. בנוסף, ניתן לתקן את הנתונים לסחף מדגם באמצעות אפשרות היישור של התוכנה מבוססת מודל להיסחף.
2. לסנן את הרכיבים בצורה גרועה מקומיים ונדגמו בצורה גרועה בנתונים מקומי השיא.
   1. בטל fluorophores בדיוק לוקליזציה, σ,> 35 ננומטר שימוש באפשרות "PAL-המסנן".
   2. בטל fluorophores באזורים שבם ממוצע המרחק בין פסגות, ד, הוא גדול מדי כדי לפתור שלפוחית ​​של קוטר, ד '
      1. חלץ את דיוק הלוקליזציה הממוצעת, σ, מהיסטוגרמה דיוק לוקליזציה.
      2. חישוב ערך מקסימאלי מקובל לד מבוסס על σ, וcriteron תנון-נייקוויסט ^19, המגולמת ברזולוציה קירוב ²⁰ R = D =[(2.35σ) ² + (2d) ^{2] 1/2.}
      3. לקבוע את הסף באפשרות "הסרה חריגים PALM" למחוק פסגות מוקפות בפחות מ πD ² / (4d ²⁾ שכנים בתוך מעגל ברדיוס של ד / 2.
   3. להמיר את נתוני PALM מעובדים לתמונת PALM שימוש באפשרות "PAL-Rendering"; ראה איור 1.
   4. לכמת גדלים והפרדות ידי בחירה בפונקציה "הפרופיל".
      1. בדוק את הקו המשויך ואפשרויות שולחן, ולמתוח קו לאורך הכיוון הרצוי בתמונה.
      2. לכמת קטרים ​​ידי קביעת רוחב מלא בעוצמה מקסימלי חצי.
      3. לכמת הפרדות על ידי קביעת מרווחים בין שיא לשיא של פרופילי עוצמה.

תוצאות

איור 1 מציג מוצר קצה אחד של הדמיה ועיבוד. בתמונת PALM זה, קואורדינטות רוחב של fluorophores מקומי מוצגות באמצעות מצב תצוגת centroid, והתמונה ברזולוציה העל של DCV הקשורים מוצגת באמצעות מצב תצוגת גאוס.

איור 2 א מראה widefield מקביל ותמונות PALM של סומה ותהליכים הפרוקסימלי של שמונה ימים בתא העצב בהיפוקמפוס מבחנה להביע tPA-Dendra2. תכונות חשובות של התמונות כוללות

דיון

PALM ושיטות מיקרוסקופיה קשורות רזולוציה סופר הקרינה צמחו לאחרונה כהשלמה חשובה לצורות מבוססות יותר של מיקרוסקופיה אופטית ומיקרוסקופי אלקטרונים (EM) ^22-24. תכונות חיוביות של PALM כוללות הכנת מדגם פשוט יחסית והפרעות מדגם מינימליות. באופן עקרוני, PALM גם יכול לשמש כדי לחקור תאי חיים. כנראה התכונה השלילית העיקרית של PALM היא רכישת נתונים זמן רב, אשר פוגעת באופן משמעותי את מחקרים של תהליכים דינמיים מהיר יותר בתאים חיים. בנוסף, PALM הוא חדש יחסית, ו, fluorophores חזק ובכך מתאי...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
צייס פאלם	קארל זייס בע"מ	Elyra PS.1	עם תוכנת ניווט יעיל (ZEN) של Zeiss ומסנן פלואורסצנטי סט 77 HE GFP/mRFP/Alexa633
ליפופקטמין 2000 טכנולוגיות חיים מגיב טרנספקציה		11668-019
טכנולוגיות חיים	בינוניות חיוניות מינימליות	11095-080
טכנולוגיות חיים	מלוחים עם חוצץ פוספט	10010049
מדעי מיקרוסקופיית אלקטרונים	פרפורמלדהיד	19208
סוכרוז	סיגמא-אולדריץ'	S-8501
כיסויי זכוכית צמיחה 18 מ"מ 1.5D	פישר סיינטיפיק	NC0059095