תאי גזע יעיל דור מושרה אדם פלוריפוטנטיים מתאים הסומטיים של אדם עם סנדאי וירוס

סיכום

כאן, אנו מציגים שיטה הוקמה לתכנת מחדש תאים סומטיים אנושיים לiPSCs אדם נטול transgene בוירוס סנדאי, אשר מראה תוצאות עקביות ויעילות משופרת.

תקציר

לפני כמה שנים, הקמת התאים האנושיים מושרה גזע pluripotent (iPSCs) הובילה עידן חדש ביו. שימושים פוטנציאליים של iPSCs אדם כוללים פתוגנזה מודלים של מחלות גנטיות אנושיות, טיפול בתאים עצמיים לאחר תיקון הגן, והקרנת תרופה מותאמת אישית על ידי מתן מקור של תאים רלוונטיים מטופל ספציפי וסימפטום. עם זאת, ישנם מספר מכשולים להתגבר, כגון ביטול ביטוי transgene גורם תכנות מחדש שנותר לאחר ייצור iPSCs האדם. חשוב מכך, ביטוי transgene שייר בiPSCs אדם שלא עברו התמיינות יכול לעכב בידול נכון ולהטעות את הפרשנות של מחלה רלוונטית בפנוטיפים מבחנה. עם מסיבה זו, ללא אינטגרציה ו / או iPSCs אדם נטול transgene פותחו באמצעות מספר שיטות, כגון אדנווירוס, מערכת piggyBac, וקטור minicircle, וקטורי episomal, אספקת חלבון ישירה ומסונתזת ה-mRNA. עם זאת, יעילות של reprogramming תוך שימוש בשיטות ללא אינטגרציה הוא נמוך למדי ברוב המקרים.

כאן, אנו מציגים שיטה לבודד iPSCs אדם באמצעות סנדאי וירוס מערכת מבוססת תכנות מחדש (וירוס RNA). שיטת תכנות מחדש זה מראה תוצאות עקביות ויעילות גבוהה באופן חסכוני.

מבוא

תאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) יש יכולת pluripotency העצמי לחדש במבחנה ויש לי, שיכול להיות שעשוי להיות שימושי עבור מודלים מחלה, להקרנת סמים, ולפתח טיפולים מבוססי תאים לטיפול בפציעות מחלות ורקמות. עם זאת, יש לי hESCs הגבלה לטיפול בתחליפי תא בגלל מחסומים חיסוניים, אונקולוגי ואתיים, וללמוד גנים הקשורים למחלות, יכול להיות מבודד hESCs ספציפי למחלה באמצעות אבחון גנטי טרום השרשה (PGD) מתקרב, אבל זה עדיין מאתגר מבחינה טכנית ותרומות העובר הן די נדירות. סוגיות אלה קשורות להתקדמות בביולוגיה של תאי גזע, מה שהוביל להתפתחותם של תאים מושרה pluripotent גזע (hiPSCs).

iPSCs האנושי לתכנות מחדש מבחינה גנטית מתאי סומטיים מבוגר אנושיים ונמל תכונות גזע pluripotent דמוי תא דומה לhESCs, מה שהופך אותם למקור שימושי עבור רפואת רגנרטיבית כגון דגילוי שטיח, דוגמנות מחלה וטיפול בתאים ^ב1,2 אופן ספציפי למטופל.

עד עכשיו, יש כמה ^3, מערכת אספקת חלבון ^5-7 (מערכת BAC וtransfection וקטורים) שאינו וירוס בתיווך ⁴ transductions גן, ושיטות ליצירת iPSCs אדם, לרבות בתיווך וירוסים (רטרווירוס וadenovirus).

למרות שמשלוח של גנים בתיווך וירוס יכול להבטיח רמה מסוימת של יעילות, וקטורים ויראליים יכולים להשאיר טביעת רגל גנטית, כי הם להשתלב בכרומוזומים מארח לבטא גנים תכנות מחדש באופן בלתי מבוקר. גם כאשר אינטגרציה נגיפית של גורמי שעתוק יכולה להפעיל או להשבית גנים מארח ^8, זה יכול לגרום לסטייה גנטית בלתי צפויה ואת הסיכון להיווצרות גידול ^ב5,9. מצד השני, ההקדמה הישירה של חלבונים או RNA לתאים סומטיים דווחו, אבל יש כמה חסרונות כגון transf עתיר עבודה, חוזר ונשנהection, ורמה הנמוכה של תכנות מחדש של ^7,10. וקטורי adenovirus אפילו episomal ולא שילוב, וירוס adeno הקשורים, ופלסמיד עדיין יחסית פחות יעילים ^11. מסיבות אלה, סביר לבחור שיטות תכנות מחדש ללא שילוב עם יעילות גבוהה של דור iPSC ומומים גנטיים פחות. במחקר זה, אנו משתמשים בתכנות מחדש המבוסס סנדאי וירוס. שיטה זו ידועה להיות שאינה משתלב בגנום המארח ובעקביות מייצרת iPSCs האנושי ללא אינטגרציות transgene.

פרוטוקול

1. הכנת נייד ומדיה (יום 1)

1. תרבות ולהרחיב פיברובלסטים אנושיים עם תקשורת DMEM המכילה 10% FBS.
2. fibroblasts צלחת אדם (איור 1) על גבי צלחת 24 גם בצפיפות המתאימה לכל גם ביום שלפני התמרה.
   הערה: דילולים סדרתי הבאים מומלצים (200K, 100K, 50K, 25K, 12.5K ו6.25K) בגלל שיש לי תאים מסוגים שונים יכולת התקשרות שונה.
3. דגירה תאים לעוד יום אחד במעלות צלזיוס 37, 5% CO ₂ באינקובטור, על מנת להבטיח את התאים יש דבק באופן מלא ומורחבים.

2. בצע התמרה (יום 2)

1. ביום של התמרה, לבדוק את צפיפות התאים ובחר בארות צפיפות היעילה ביותר (איור 2). עדיף לבחור שלוש צפיפויות שונות: (80 ~ 90%) גבוהים, (20 ~ 40%) באמצע (50 ~ 70%) ונמוכים.
2. שעה לפחות 1 לפני התמרה, לשאוב fibroblתקשורת AST מהתאים ולשנות 300 μl החדש של מדיום פיברובלסטים.
3. הסר סט אחד של 4 צינורות וירוס סנדאי שונים מ-80 ° C האחסון. להפשיר צינור אחד באותו הזמן באמבט מים C ° 37 לכמה שניות, ולאחר מכן לקחת את הצינורות החוצה מאמבט המים. אחרי זה, להפשיר אותם לטמפרטורת חדר; צינורות צנטריפוגות ב 6,000 XG במשך 10 שניות ומניחים אותם על קרח עד שימוש. אל מחדש הקפאה ולהפשיר את הווירוס מאז כותרות לא לשמור.
4. הוסף את הכרכים מצויינים של כל אחד מארבעת צינורות וירוס סנדאי (אוקטובר -4, KLF-4, c-Myc וסוקס-2) לצינור מיקרו צנטריפוגות. ודא כי הפתרון הוא מעורב היטב על ידי pipetting בעדינות.
   לדוגמא, אם 50K תאים / גם אחד lookwell צלחת 24 גם לתמרה:
   (כייל מבוסס על תעודת ניתוח מחיים טכנולוגיים, יכול להיות שונה מיצווה כדי תצווה)
   צינור hOct-4 = 6.0 x 10 ⁷ CIU, 3 משרד הפנים = 5 μl
   צינור hSox-2 = 6.5 x 10 ⁷ CIU, 3 משרד הפנים = 4.6 μ; L
   צינור hKlf-4 = 6.3 x 10 ⁷ CIU, 3 משרד הפנים = 4.8 μl
   צינור HC-Myc = 7.8 x 10 ⁷ CIU, 3 משרד הפנים = 3.8 μl
   סה"כ = 18.2 μl של ארבעה גורמי וירוס תערובת / טוב אחד (50K תאים) של צלחת 24 גם
5. בהתאם לצפיפויות תא; להוסיף 2X, 1X, ו0.5x נפח של תערובת הווירוס לתוך הבאר. נער בעדינות את הצלחת קדמית לגב, משמאל ומימין (2X: 36.4 μl של תערובת וירוס, 1X: 18.2 μl ו0.5x: 9.1 μl).
6. מניחים את התאים במעלות צלזיוס 37, 5% CO ₂ באינקובטור ודגירת הלילה.

3. החלפה של תרבות בינונית (יום 3 והיום 5)

1. 24 שעות לאחר התמרה, להחליף את המדיום עם 500 בינוני פיברובלסטים μl טריים.
2. ביום 5, לשנות בינוני עם תקשורת פיברובלסטים טרי.

4. להכין מנות MEF לעמית התרבות (יום 8)

1. הכן את תאי MEF ב60 תרבות מנות מ"מ עם 10% FBS הכיל מדיום DMEM דה אחדy לפני passaging פיברובלסטים transduced על מזין תאי MEF.
   הערה: אנו משתמשים 5 x 10 ⁵ של MEF בכל מנה 60 מ"מ.

5. התחל משותף תרבות transduced תאים עם תאי מזין MEF (יום 9)

1. לפני ציפוי תאי transduced, לשאוב 10% FBS הכיל DMEM תקשורת ממנות מזין MEF ולהוסיף טריים 10% FBS הכיל מדיום DMEM.
2. הוצא את המדיה מfibroblasts transduced שנמצאים בצלחת 24 היטב ולשטוף תאי פעם אחת עם D-PBS. הוסף 200 μl של 0.25% טריפסין / EDTA לתוך תאי פיברובלסטים ביישום לוח 24 גם צלחת. לאחר פחות מ -5 דקות דגירה עם טריפסין / EDTA, כאשר התאים מתחילים להתנתק מהצלחת, אוסף את התאים עם מדיום גידול ב15 מיליליטר צינור חרוטי. אז צנטריפוגות ב6,000 XG במשך 4 דקות.
   הערה: איגום 2X, 1X, ווירוס 0.5x פיברובלסטים transduced מומלץ.
3. הסר את מדיום supernatant ולשטוף מחדש להשעותהתא גלולה עם 4-5 מיליליטר של מדיום פיברובלסטים טרי לנטרול מטריפסין. אז צנטריפוגות ב135 XG במשך 4 דקות.
4. פלייט תאים כמו צפיפות דילול סדרתי ולהתחיל לתרבות משותפת עם תקשורת פיברובלסטים על MEF: כגון 1/2, 1/4, 1/8, 1/16, 1/32, 1/64, ו1/128 ל60 מנה מ"מ. בהתאם לשיעור המוות של תאים במהלך השבוע של התמרה הראשון, אחד עשוי שלא צריך לדלל עד 1/2 או 1/128 צפיפות. לשים בצד את התאים שנותרו כדי לחלץ רנ"א הכל כביקורת חיובית לtransgene RT-PCR.
5. הנח 60 מנות מ"מ ב37 מעלות צלזיוס, 5% CO ₂ באינקובטור במשך לילה.

6. Feed תאי גזע עוברי האנושי בינוניים ולפקח על תאים (יום 10)

1. למחרת, לשנות את תקשורת פיברובלסטים לתקשורת ES אדם עם 10 מיקרומטר Y-27632. אחרי זה, לשנות בינוני יומי עם מדיום ES אנושי: 800 מיליליטר DMEM/F12 + 200 מיליליטר החלפת נוק סרום + 10 מיליליטר של L-גלוטמין + 10 מיליליטר של 10 חומצות אמינו מ"מ MEM מינימום שאינו חיוניות+ 1 מיליליטר של 2-mercaptoethanol + 10 / מיליליטר ng הבסיסי פיברובלסטים Growth Factor.
2. האם שינוי בתקשורת יומיומי עם תקשורת ES אדם טרי. אחרי שבוע, לבדוק את הכלים פעם אחת לכל 2 ~ 3 ימים תחת מיקרוסקופ להיווצרות של גושי תאים כמו מושבה-ES. בהתאם לסוג התא, התרבות תיקח יותר או פחות זמן לפני שהמושבות נמצאות.

7. בחירת המושרה pluripotent גזע מושבות תאים ומרחיב את התאים (יום 20 ~)

1. שלושה שבועות לאחר התמרה, מושבות צריכה להיראות גדלו כראוי לקטיף.
2. היום לפני לקטוף את המושבות, להכין מזין MEF בצלחת 24 גם.
   הערה: אנו משתמשים 12.5 x 10 ⁵ של MEF בצלחת אחת 24 גם.
3. למחרת, לשנות בינוני של מנות MEF מתקשורת פיברובלסטים לתקשורת ES אדם עם 10 מיקרומטר Y-27632. באופן ידני לבחור מושבה אחת בכל פעם מתחת למיקרוסקופ בקטיף מכסה המנוע ולהפוך את הגושים קטנים יותר על ידי pipetting ולהעביר אותםגבי הכין חדש MEF dishes.Try לאסוף כמה שיבוטים.
4. מעבר ולהרחיב את כל טוב מצלחת 24 גם לצלחת גם 6 בתחילה. ואז מצלחת 6 היטב ל60 מ"מ כלים לפני התפשטות נוספת.

8. אפיון iPSCs האדם (לאחר 10 מעברים)

1. Immunofluorescence
   1. iPSCs צלחת אדם בצלחת 24 גם ותרבות במהלך 4-5 ימים עם שינוי תקשורת מדי יום.
   2. להתחלת assay Immunofluorescence, לשטוף את הצלחת עם D-PBS פעם אחת. ואז לתקן את התאים באופן מיידי בparaformaldehyde 0.4% למשך 30 דקות. אחרי זה לשטוף שלוש פעמים בD-PBS במשך 5 דקות.
   3. טיפול בתאים קבועים עם 0.1% טריטון ב PBS פתרון X-100 15 דקות בטמפרטורת חדר.
   4. לשאוב את פתרון permeablization (0.1% פתרון X-100 טריטון), ולאחר מכן להוסיף 0.5% פתרון חסימת BSA במשך שעה 1 בטמפרטורת חדר.
   5. לבצע זיהוי של Nanog, אוקטובר -4, SSEA (antig העוברי בשלב מסויםen) וTRA-1-81 (אנטיגן הסרטני דחייה) באמצעות נוגדן אנטי אנושי ב0.5% פתרון BSA (לבדוק את טבלת חומר לשיעור דילול נוגדנים). דגירה העיקרית נוגדן ל2 שעות בטמפרטורת חדר. לאחר מכן לשטוף שלוש פעמים בD-PBS במשך 5 דקות כל אחד.
   6. בדוק באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי לאחר 1 שעות של דגירה עם 488 עיזים נוגדני IgG אנטי עכבר Alexa פלואוריד כנוגדן 2 ^nd, אשר בדילול 1:2,000 ב0.5% פתרון BSA בטמפרטורת חדר. להכתים את כל הגרעינים של כל תאי MEF מזין וhiPSCs עם DAPI.
2. RT-PCR של אישור transgene
   1. תמצית ה-mRNA הכולל מתא גלולה באמצעות ריאגנטים מיצוי RNA.
   2. האם שעתוק לאחור על aliquots (1 מיקרוגרם) של רנ"א הכל וcDNA הנגזר לPCR הגברה על ידי הפוך transcriptase.
   3. הכן את תערובות PCR להכיל 2 μl של תבנית cDNA, 10 μl של תערובת אמן 2X PCR, 2 μl של 2 pmol של פריימרים(קדימה: μl 1 הפוך: μl 1) ו -6 μl של DW. כדי לזהות את ביטוי גנים, לעשות RT-PCR עם פריימרים המופיעים בטבלה 1.
   4. בצע RT-PCRs עם גן GAPDH כביקורת על יעילות של תגובות ההגברה. לחזות ולנתח מוצר ה-PCR ב -1% אלקטרופורזה agarose ג'ל.

תוצאות

fibroblasts הנגוע בדרך כלל לא מראה שינויים מורפולוגיים במספר ימים לאחר התמרה וירוס סנדאי, אבל חמישה ימים לאחר מכן, הם מתחילים לקבל צורות שונות (איור 1). כפי שתואר בפנל ימני של איור 1, אין לי תאים פיברובלסטים מורפולוגיה טיפוסית יותר. יש להם צורה עגולה וגדול יותר מגרעין ציטופלסמה. גם כאשר התמרה מתבצעת ב80% confluency הסלולרי, זה נראה כאילו הם פחות מחוברות בהרבה אחרי שהם מתחילים לתכנת מחדש. אם סוגים של שינויים מורפולוגיים אלה מתחילים לראות ברוב טובים...

דיון

תכנות מחדש של תאים סומטיים אדם לhiPSCs מחזיק הבטחות חסרות תקדים בביולוגיה בסיסית, תרופות אישיות, והשתלה ^12. בעבר, דורות iPSC אדם הנדרשים וירוס ה-DNA כי יש סיכון אינטגרציה לתוך הגנום המארח, אשר יכול ליצור מוטציות גנטיות לא רצויות המגבילות את יישומים קליניים נוספים כגון טיפולי פיתוח תרופות והשתלה ^13. עם מסיבה זו, מחקרים רבים כבר דיווחו לייצר וקטור וiPSCs האנושי המערכת ללא transgene על ידי מספר שיטות אלטרנטיביות, אבל באותו הזמן, את היעילות של בידוד 'רגל הדפס...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
ערכת תכנות מחדש של CytoTune-iPS	Invitrogen	A1378002
CF-6, MEFs, עמיד לניאומיצין, טיפול במיטומיצין C	גזע גלובלי	GSC-6105M	5 x 105/6 ס"מ או 12.5 x 105/24 בארות
צלחת טריפסין EDTA 0.25% טריפסין עם EDTA 4Na 1X	Invitrogen	25200114
DMEM/F-12 בינוני	Invitrogen	11330-032
צלחת תרבית תאים 24 בארות, תחתית שטוחה עם מכסה	BD	353935
Y-27632	TOCRIS	1254	10 & #956; M (מלאי: 10 מ"מ)
גורם גדילה פיברובלסטים בסיסי	LIFE TECHNOLOGIES	PHG0263	10 ng (מלאי: 100 ug)
תחליף סרום נוק-אאוט	Gibco	10828028
Dulbecco' s Modified Eagle Medium (D-MEM, DMEM) (1X), נוזלי (גלוקוז גבוה)	Invitrogen	11965118
סרום בקר עוברי	Thermo Scientific Fermentas	SH30071.03
L-גלוטמין-200 מ"מ (100X), נוזלי	GIBCO	25030-081	1/100
MEM תמיסת חומצות אמינו לא חיוניות, 100X	LIFE TECHNOLOGIES		1/100
2-מרקפטואתנול (1,000X), נוזלי	GIBCO	21985023	1/1,000
Hausser שלב ניגודיות Hemacytometers	Hausser Scientific	02-671-54
EmbryoMax 0.1% תמיסת ג'לטין	Millipore	ES-006-B
SSEA-4	DSHB	MC-813-70	1/200
אנטי-Tra-1-81	איתות תאים	4745S	1/200
נוגדן חד שבטי של עכבר Oct4	סנטה קרוז	SC-5279	1/1,000
ננוג	מו"פ D	AF1997	1/1,000
Alexa Flouor 488 עז נגד עכבר	Invitrogen	948492	1/2,000
DPBS (Dulbecco' s תמיסת מלח עם חומצה פוספט), 1X ללא סידן & מגנזיום	Cellgro	21-031-CV
ערכת שעתוק הפוך QuantiTect	QIAGEN	205313
PCR Master Mix [2X]	Thermo Scientific Fermentas	K0171
Trizol	Invitrogen	15596018
קולט אדים	NuAire	NU-301
ניתוח היקף	ניקון	SMZ745