מאמר שיטה

Polysome היפוך חלוק וניתוח של יונקי Translatomes בקנה מידת הגנום

69.8K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/51455

⸱

17 במאי 2014

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Lady Davis Institute and Department of Oncology, McGill University, 2Department of Oncology-Pathology, Karolinska Institutet, 3Goodman Cancer Centre and Department of Biochemistry, McGill University

במאמר זה

סיכום

הריבוזומים לשחק תפקיד מרכזי בסינתזה של חלבונים. חלוקה Polyribosome (polysome) על ידי צנטריפוגה שיפוע צפיפות סוכרוז מאפשרת קביעה ישירה של יעילות תרגום של mRNAs הבודד בקנה מידת הגנום כולו. בנוסף, בשיטה זו ניתן להשתמש לצורך הניתוח ביוכימי של הריבוזום וגורמים הקשורים polysome כגון מלווים ומולקולות איתות.

תקציר

תרגום mRNA משחק תפקיד מרכזי בוויסות של ביטוי גנים, ומייצג את תהליך האנרגיה הרב ביותר בתאי יונקים. בהתאם לכך, חוסר ויסות של תרגום ה-mRNA נחשבת לשחק תפקיד מרכזי במגוון רחב של מצבים פתולוגיים כוללים סרטן. הריבוזומים גם לארח מלווים, המאפשרים קיפול של פוליפפטידים המתהווים, ובכך ויסות תפקוד ויציבות של פוליפפטידים מסונתזים חדש. בנוסף, הנתונים מצביעים על כך שמתעוררים הריבוזומים ישמשו כפלטפורמה לרפרטואר של מולקולות איתות, שהם מעורבים במגוון רחב של שלאחר translational שינויים של פוליפפטידים מסונתזים חדש כפי שהן עולות מהריבוזום, ו / או רכיבים של מכונות translational. בזאת, שיטה מבוססת היטב של חלוקה הריבוזום באמצעות צנטריפוגה שיפוע צפיפות סוכרוז מתוארת. בשילוב עם האלגוריתם בבית פיתח "anota" שיטה זו מאפשרת קביעה ישירה של diffeתרגום rential של mRNAs הבודד בקנה מידת הגנום כולו. יתר על כן, פרוטוקול זה צדדי יכול לשמש למגוון רחב של מחקרים ביוכימיים במטרה לנתח את הפונקציה של מתחמים הקשורים חלבון הריבוזום, כולל אלו שמשחקים תפקיד מרכזי בקיפול והשפלה של פוליפפטידים מסונתזים חדש.

מבוא

רשתות הרגולטורים ששולטים בביטוי גנים נחקרו רבות בשני העשורים האחרונים. הרוב המכריע של מאמצי המחקר האלה התמקדו בתקנת תעתיק, לפיה שינויים ברמות ה-mRNA מצב היציב בקנה מידת הגנום שימשו לקביעת פרופילים "ביטוי גנים" מה שנקרא. מחקרים שנעשה לאחרונה עולים כי רמות ה-mRNA מצב יציב רק באופן רופף מתאימות להרכב של proteome 1,2, ובכך מצביעים על כך שהמנגנונים שלאחר התעתיק, כולל תרגום ה-mRNA, לשחק תפקיד מרכזי בויסות של ביטוי גני 3,4. ואכן, זה כבר העריך כי ~ 50% מרמות החלבון נקבעים ברמה של תרגום ה-mRNA בfibroblasts העכבר הנציח 5.

תרגום ה-mRNA הוא תהליך מוסדר מאוד שבמהלכו mRNAs מתורגמים לחלבונים באמצעות פעולה מתוזמרת של הריבוזומים, RNAs העברה (tRNAs) ושיתוף גורמי אבזרהמכונה גורמי תרגום (TFS) 6 mmonly. סינתזה של חלבונים היא התהליך הגוזל האנרגיה ביותר בתאי יונקים 7 ולכן שיעורי תרגום mRNA הגלובליים מותאמים כדי להתאים לזמינות חומרי מזון ושיעורי התפשטות תאי 8. בנוסף לשינויים בשערי הגלובליים תרגום ה-mRNA, גירויים שונים תאיים (למשל הורמונים וגורמי גדילה), רמזים תאיים (רמות חומצת אמינו למשל) וסוגים שונים של לחץ (למשל ER-מתח) לגרום לשינויים סלקטיבית בבריכות של mRNAs ה מתורגם (translatome) 6. בהתאם לסוג של גירוי, פעילות תרגום של חלק, אבל לא כל mRNAs מושפעים באופן דרמטי, ובכך וכתוצאה משינויים בproteome הנדרשים לעלות תגובה תאית מהירה 6. שינויים איכותיים וכמותיים אלו בtranslatome הם חשבו להיות מתווכים על ידי יחסי הגומלין בין גורמי טרנס משחק (לדוגמא: רכיבים של מכונות translational, גורמי עזר או miRNAs) וcis-אלמנטים (יסודות RNA או תכונות) קיימים בתת נבחרת של mRNAs 6,9. לדוגמא, שינויים ברמות ו / או בפעילות של ייזום תרגום שער הגבלת גורמי eIF4E וeIF2 סלקטיבי לווסת את התרגום של תמלילים המבוססים על תכונות 5'UTR הספציפיות 6. eIF4E וeIF2 נדרשים לגיוס של mRNA והיוזם tRNA לריבוזום, בהתאמה 6. גידול בפעילות באופן סלקטיבי eIF4E מחזק תרגום של mRNAs מחסה 5'UTRs הארוך ומובנה מאוד כולל אלו התפשטות קידוד והישרדות גירוי חלבונים כוללים cyclins, c-myc וBcl-XL 10. בתורו, איון של eIF2 מוביל לכיבוי סינתזת חלבון עולמי, בעוד באופן סלקטיבי את ויסות תרגום של mRNAs המכיל מסגרות קצרות מעכבות במעלה הזרם קריאה פתוחה (uORFs) ב5'UTRs, כמו t קידוד ההורים אלהרגולטורים ranscriptional של תגובת פרש החלבון (לדוגמא ATF4). בתגובה לגירויים שונים, כולל חומרים מזינים, גורמי גדילה והורמונים, יעד מכניסטית / יונקי מסלול rapamycin (mTOR) ממריץ את פעילות eIF4E ידי inactivating חלבון 4E מחייבת משפחה (4E-BP) של מדכאי תרגום, ואילו מסלול MAPK ישירות phosphorylates eIF4E 6,11. בתורו, קינאזות eIF2α (כלומר הטבה, PKR, HRI וGCN2) לעכב eIF2 ידי phosphorylating מקטע הרגולציה eIF2α בתגובה למחסור באבות מזון, ER-מתח וזיהום בנגיף 6,12. שינויים בפעילות ו / או הביטוי של TFS, רכיבים אחרים של מכונות translational וגורמי רגולציה כוללים miRNAs נצפו במצבים פתולוגיים שונים, כולל סרטן, תסמונות המטבולית, הפרעות נוירולוגיות ופסיכיאטריות, ומחלות כליות ולב וכלי דם 13-19. באופן קולקטיבי, נתונים אלה מצביעים על כך שTranslationalchanisms לשחק תפקיד מרכזי בשמירה על הומיאוסטאזיס וכי ביטולם משחק תפקיד מרכזי באטיולוגיה של מחלות אנושיות שונות.

בזאת, פרוטוקול לחלוקה של polysomes ידי צנטריפוגה סוכרוז צפיפות שיפוע בתאי יונקים, המשמשת להפרדת polysomes מmonosomes, יחידות משנה ריבוזומלי וחלקיקי ribonucleoprotein השליח (mRNPs) הוא תאר. זה מאפשר אפליה בין תורגם ביעילות (הקשורים polysomes כבד) מmRNAs תורגם בצורה גרועה (הקשורים polysomes אור). ב assay זה, הריבוזומים הם משותקים על ה-mRNA באמצעות מעכבי התארכות תרגום כגון cycloheximide 20 ותמציות cytosolic מופרדות על הדרגות צפיפות סוכרוז ליניארי 5-50% על ידי ultracentrifugation. חלוקה הבאה של הדרגתיים סוכרוז מאפשרת בידוד של mRNAs לפי מספר הריבוזומים הם נקשרים אליו. RNA המופק מכל חלק ניתן לאחר מכן נעשה שימוש כדי לקבועשינויים בהפצות של mRNAs מעבר ההדרגתי בין מצבים שונים, לפיה עליות יעילות translational מהחלק העליון לחלק התחתון של השיפוע. הצפון סופג או תגובת שרשרת כמותית שעתוק לאחור פולימרז (qRT-PCR) משמשות כדי לקבוע רמות של mRNAs בכל חלק.

לחלופין, ברים המכילים polysomes הכבד (יותר מ -3 הריבוזומים בדרך כלל) הם אספו ורמות ה-mRNA הקשורים polysome הגנום נקבעות באמצעות microarray או עמוק רצף. זה הוא בעל חשיבות עליונה להדגיש כי הרמות של mRNAs הקשורים polysome הן, בנוסף לתרגום, שנפגעו על ידי מנגנוני שעתוק ולאחר תעתיק המשפיעים על רמות mRNAs cytosolic 21. לכן, כדי לקבוע את ההבדלים בתרגום באמצעות נתוני הגנום מmRNA הקשורים polysome יש צורך לתקן את ההשפעות משלבים במסלול ביטוי גנים שנמצאות במעלה הזרם של תרגומיםtion 21. כדי לאפשר תיקון כזה, RNA cytosolic מוכן במקביל עם RNA הקשורים polysome מכל מדגם ורמות ה-mRNA מצב יציב הגנום נקבעים 21. נכון לעכשיו, מה שנקרא "תרגום יעיל" ציונים (TE) (כלומר לוג היחס בין נתוני ה-mRNA הקשורים polysome ונתונים mRNA cytosolic) לעתים קרובות עובד כדי לתקן את ההשפעות של שינויים ברמות ה-mRNA cytosolic על יעילות תרגום של ניתנו mRNA 22. עם זאת, שימוש בציוני TE לזהות תרגום ההפרש קשור למספרים משמעותיים של ממצאים שליליים חיוביים ושקר שקר בשל רכוש מתמטי של ציוני TE מכונה מתאם מזויף כ27. ואכן סקר של ערכות נתונים ממעבדות רבות מצביע על כך שנראה מתאמים מלאכותיים כל כך להיות בלתי נמנע בעת ניתוח שינויים בtranslatomes 23. זה מתבקש פיתוח של "הניתוח של TR ההפרש אלגוריתם anslation "(anota), שאינו סובל מהליקויים האמורים 23. במהלך anota-ניתוח מודל רגרסיה המשמש לחישוב מדדים של פעילות translational בלתי תלויים ברמות RNA cytosolic. אמצעים אלה הושוו בין התנאים ונתונים סטטיסטיים מחושבים. למשתמש יש את האפשרות של החלת שיטת הצטמקות שונות, אשר משפרת את הכוח סטטיסטי ומפחיתה את התרחשותם של ממצאים חיוביים כוזבים במחקרים עם כמה חזרות 24. באופן משמעותי, זה היה הוכיח לאחרונה כי הפרעות בtranslatome שנתפסו על ידי anota, אבל ציונים לא TE, לתאם עם שינויים בproteome 25. לכן, מומלץ מאוד ליישם את ניתוח anota לזיהוי שינויים בתרגום בקנה מידת הגנום כולו. בעוד היסודות התיאורטיים של אלגוריתם anota נדונו בפירוט בעבר 21,23,26, כאן דגש הוא על איך ליישם אותו הלכה למעשה.

ve_content "> בנוסף ללימוד שינויים בפעילות תרגום mRNA בתא, פרוטוקול חלוקה הריבוזום זה יכול לשמש כדי לבודד וביוכימית ותפקודית מאפיין את הריבוזומים ולמתחמים הקשורים החלבון polysome. גישה זו בהצלחה נפרסה בעבר לזהות מתחמים המסדירים את היציבות של פוליפפטידים מסונתזים חדש 27 ו / או מעורבים בזירחון של רכיבים של מכונות translational. זה יישום של שיטת חלוקה polysome יהיה גם דנו בקצרה.

פרוטוקול

1. סוכרוז Gradient הכנה

  1. הכן 60% 100 מיליליטר (w / v) פתרון סוכרוז בDDH 2 O. פתרון צריך להיות מסונן דרך מסנן 0.22 מיקרומטר כדי למנוע סתימה של צינורות במהלך שלב חלוקה (שלב 3.5).
  2. הכן 5 מיליליטר של חיץ 10x שיפוע סוכרוז: 200 HEPES מ"מ, 100 יחידות / מעכב RNase מיליליטר (pH 7.6), 1 M KCl, 50 מ"מ MgCl 2, 100 מיקרוגרם / מיליליטר cycloheximide, מעכבי פרוטאז קוקטייל 1x (ללא EDTA).
  3. שימוש בפתרון 60% מוכנים כמתואר בשלב 1.1, להפוך 40 מיליליטר של 5% ופתרונות סוכרוז 50% במאגר שיפוע סוכרוז 1x.
  4. השתמש בגוש מרקר מסופק עם יצרנית השיפוע כדי לסמן את נקודת חצי מלאה על כל צינור ultracentrifugation polyallomer לשכבות (6 צינורות ultracentrifugation בסך הכל). שימוש במכשיר שכבות מסופק עם יצרנית השיפוע, להוסיף 5% תמיסת סוכרוז עד שהוא מגיע לנקודה שחצי מלא. לאחר מכן, להוסיף 50% תמיסת סוכרוז מלמטה עד interfאס בין שני הפתרונות מגיע לנקודת חצי מלאה. טיפול מיוחד יש לנקוט בצעד הזה, כך שהדרגתי דומה ככל האפשר, שכן זו היא חיונית לקבלת שחזור גבוה (ראה להלן).
  5. לאטום צינורות עם כובעי אזורי שיעור המסופקים עם יצרנית השיפוע ולהעביר את הצינורות האטומים לבעל הצינור על יצרנית השיפוע.
  6. הפעל את יצרנית השיפוע כדי לקבל 5% עד 50% שיפוע ליניארית. 6 הדרגתיים ליניארי תוקם בכמה דקות על ידי סיבוב בזווית הטיה גבוהה.
    הערה: ניתן להשתמש בו באופן מיידי או הדרגתיים סוכרוז מאוחסן ב -80 מעלות צלזיוס במשך 6 חודשים.

2. בידוד ושקיעה של Polysomes

  1. בהתאם לסוג התא, תאי זרע ל1-5 מנות 15 ס"מ פטרי (~ 15 x 10 6 תאים) לפחות יום אחד לפני תמוגה. ביום של הניסויים בתאים צריכים להיות ~ 80% ומחוברות. הערה: confluency האופטימלי הוא קריטי, כי שיעורי תרגום וההפצה באופן ישירמידתי 8, ולכן יש לנתח polysomes בתאים פעיל מתרבים (שיעורי תרגום כלומר יירד באופן משמעותי בלמעלה מ תאים ומחוברות ואילו confluency הנמוך של תאים לא יכול לספק מספיק חומר לניתוח נוסף). חריגים לכלל זה יכול להתבצע אם למשל הנסיין הוא מעוניין ללמוד את ההשפעה של עיכוב מגע על תרגום. עם זאת, לא צריכים להיות כל הזמן תחת תאים על תנאי מחוברות במשך זמן רב מדי, מכיוון שהדבר עלול להיות השפעות שלא במתכוון על translatome.
    אם נדרש transfection, רוב ערכות הזמינות המסחרית אינו משפיעים על רמות polysome. כי ביום של תאי transfection חייב להיות מחוברות 80-90%, מומלץ להפיץ תאים 24 לאחר transfection שעה ולבודד polysomes 48 לאחר transfection שעות מהתאים ~ 80% ומחוברות.
  2. דגירה תאים עם cycloheximide בריכוז סופי של 100 מיקרוגרם / מיליליטר בתקשורת צמיחה במשך 5 דקות ב37 ° C ו 5% CO 2; ולשטוף את התאים פעמיים עם 10 מיליליטר של קר כקרח 1x PBS המכיל 100 מיקרוגרם / מיליליטר cycloheximide. Cycloheximide הוא מעכב התארכות תרגום זה "קופא" הריבוזומים על mRNA, ובכך למנוע הריבוזום לברוח 20.
  3. לגרד תאים בעדינות, ב 5 מיליליטר של קר כקרח 1x PBS המכיל 100 מיקרוגרם / מיליליטר cycloheximide ולאסוף אותם בצינור 50 מיליליטר. חשוב כי צעד זה מתבצע במהירות סבירה כמו השארת תאים על קרח לתקופה ממושכת של זמן יהיה דרסטי להקטין את האיכות של תכשיר polysome.
  4. איסוף תאים על ידי צנטריפוגה ב XG 200 במשך 5 דקות ב 4 ° C.
  5. בטל תאי supernatant ו resuspend ב 425 μl של חיץ hypotonic [(5 מ"מ טריס-HCl (pH 7.5), 2.5 מ"מ MgCl 2, 1.5 מ"מ KCl ומעכבי פרוטאז קוקטייל 1x (ללא EDTA)], להוסיף 5 μl של 10 מ"ג / מיליליטר CHX, μl 1 של 1 M DTT, של מעכב RNAse מערבולת של 5 שניות אחריו תוספת של 25 μl של 10% טריטו 100 יחידותn X-100 (ריכוז סופי 0.5%) ו25 μl של 10% נתרן Deoxycholate (ריכוז סופי 0.5%) ו מערבולת במשך 5 שניות. בשל נפיחות תא, חיץ hypotonic ישבש את קרום הפלזמה, ואילו תנאי חומר הניקוי עדינים המשמשים לsolubilize cytosolic והריבוזומים הקשורים reticulum endoplasmic מבלי לשבש את מעטפת הגרעין.
  6. lysates צנטריפוגות ב XG 16,000 ל7 דקות ב 4 ° C ו supernatant ההעברה (~ μl 500) לצינור מיליליטר 1.5 מראש צונן חדש. מדוד OD ב 260 ננומטר עבור כל דגימה באמצעות ספקטרופוטומטר ולשמור 10% מlysate כקלט שישמש לקביעת רמות ה-mRNA מצב יציב cytosolic. לדלל את הקלט ל750 μl בH RNase ללא 2 O, להוסיף 750 μl של Trizol ופלאש הקפאה בחנקן נוזלי.
  7. העבר את צינורות ultracentrifuge המכילים סוכרוז הדרגתיים בדליים הרוטור טרום צוננים. הסר 500 μl מהחלק העליון של הדרגות סוכרוז. התאם lysates, כך שהם מכילים את אותו OD (10-20 OD ב 260 ננומטר) ב500 μl של חיץ תמוגה (מתואר בשלב 2.5) ומעלה אותם על כל שיפוע סוכרוז.
    הערה: חשוב לטעון באופן מיידי lysates על ההדרגות, כמו זה באופן ביקורתי ישפר את האיכות של הכנות polysome.
  8. לשקול ולאזן כל שיפוע לפני אולטרה צנטריפוגה.
  9. צנטריפוגה ב XG 222,228 (36,000 סל"ד), במשך שעה 2 על 4 מעלות צלזיוס באמצעות הרוטור SW41Ti.
    הערה: על מנת לא לשבש הדרגתיים סוכרוז, אפשרות בלמים "נמוכה" צריכה להיות נבחרת.

3. Polysome היפוך חלוק וRNA חילוץ

  1. הכן את אספן שבריר על ידי ניקוי אותו עם מים חם המכילים RNase ללא RNase ZAP (כמה תרסיסים). חזור על שלב זה עם מים RNase חינם חמים בלבד. החלף מנורת UV ולחכות לאור הירוק כדי להופיע.
  2. מוציא בזהירות את צינורות מהרוטור ומניח אותם על קרח. לעבור על מחשב, משאבה, גלאי UV ואספן שבריר. משאבה נקבעה על 3 מיליליטר / דקה וfill צינורות עם הפתרון הרודף [60% (w / v) סוכרוז המכיל 0.02% (w / v) bromophenol הכחול], עד שהוא מגיע למחט. הקפד לראות טיפה אחת לפחות יוצאת מהמחט, ולוודא שאין בועות הם הציגו במזרק המשאבה או צינורות.
  3. מניחים 2 מיליליטר צינורות באספן שבריר. השקת תכנית ניתוח ולהגדיר רגישות ל+ / - 10 MeV. הגדרה "timebase" ל100 שניות.
  4. מקם כל צינור ultracentrifugation לגלאי UV תוך הקפדה כי הצינור נמצא במצב מאונך. לנקב את הצינור עם המחט על ידי מסובב את הידית מתחת לבעל הצינור.
  5. הגדר את המשאבה ב1.5 מיליליטר / דקה ולאסוף את השברים הגדרת הזמן 30 שניות על אספן שבריר (זה יביא ~ 750 μl בכל חלק). שים את המשאבה ב" העמדה המרוחקת ", להתחיל אספן המשאבה ושבריר, ובה בעת להתחיל בהקלטה באמצעות נותב DAQ. זה יתחיל תזוזה כלפי מעלה של הגר"א סוכרוזdient וזיהוי בו זמני של ספיגת UV ב254 ננומטר. לחדול מגבייה בהקדם הירידה הראשונה של פתרון רודף נופל ב2 מיליליטר איסוף צינור.
  6. שמור את המעקב בפורמט CSV ו( פעם צעד 3.7 הושלם), ביישום של גיליון אלקטרוני, בצע את הפעולות הבאות כדי לזהות את מיקומו של כל חלק בפרופיל ספיגת UV.:
    1. בחר את העמודה המכילה ערכים המתאימים לספיגה ב 254 ננומטר (ערוץ 0).
    2. יצירת עלילת פיזור קו חלקה של absorbances.
    3. הגדר את היחידה המרכזית של ציר X כדי 300 (ערך המתקבל על ידי חלוקת הנפח של 5% -50% שיפוע סוכרוז (~ 12 מיליליטר) עד שהאוסף של כל חלק (30 שניות).
  7. הוסף 750 μl של Trizol בכל חלק ופלאש להקפיא את השברים בחנקן נוזלי.
  8. בודד RNA הקשורים polysome וcytosolic (מ2.6) באמצעות פרוטוקול Trizol על פי הוראות יצרן. כדי להגדיל את תשואת RNA, להמשיך עם preci RNApitation ב -80 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות או -20 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
    הערה: בגלל כמות הרנ"א זירזה משברי polysomal לא יכולה להיות לעין מומלץ להוסיף מוביל. הוסף 1 μl של מוביל לצינור לפני שלב הממטרים RNA במהלך פרוטוקול Trizol.
  9. לקבוע אילו שברים מתאימות לmRNA הקשורים> 3 הריבוזום (שימוש בגישה שתוארה 3.6) וברכה שברים אלה. השתמש בערכת ניקוי רנ"א כדי לבצע ניקוי של RNA ונקווה וcytosolic הקשורים polysome (מ2.6). שלח דגימות למתקן כדי לקבוע את רמות ה-mRNA הגנום באמצעות מערכים או עמוק רצף.
    אם תרגום של mRNAs הספציפי צריך להיות במעקב על ידי RT-qPCR, מומלץ להשתמש 500 ng של RNA (משברים ונקווה שמכילים> 3 הריבוזומים או רנ"א הכל) לסנתז cDNA.
    הערה: mRNAs הקשורים> 3 הריבוזומים מוגדר באופן שרירותי כדי לייצג mRNAs תורגם ביעילות ובמכיל יותר מ -80% מsynthe חדשפוליפפטידים בגודל 28,29. כולל שברים מתאימים לאור (1-2), בינוני (2-3) וpolysomes הכבד (> 3) יהיה יתרון, אבל אלה יהיו להגדיל את מספר הדגימות על ידי פי 2 (4 לעומת 2 לכל מצב) ובכך עלות הניסוי. על אף שהוא צפוי כי הירידה בעלות של ניתוח עמוק רצף וmicroarray בעתיד, צריכה להעדיף את הגישה השנייה, מומלץ כי במהלך אימות, הפצה של mRNAs הבודד מנוטרת בכל חלק.

4. ניתוח הגנום של mRNA תרגום

  1. R להתקין, BioConductor וחבילת anota:
    1. התקן R (להורדה מr-project.org) ולהתחיל R-פגישה.
      הערה: R הוא זמין לכל מערכות ההפעלה וanota ירוץ על כולן.
    2. התקן BioConductor (bioconductor.org). קוד R מתפרש דרך (למשל קונסולת R-מסוף R ב-Windows - אשר הושקה על ידי מטלותUBLE לחיצה על קיצור R). BioConductor מותקן על ידי הקלדה (בR-מסוף):

      מקור ("http://bioconductor.org/biocLite.R")

      biocLite ()
    3. התקן את חבילת anota BioConductor (וחבילת qvalue שanota דורשת) על ידי הקלדה (בR-מסוף):

      מקור ("http://bioconductor.org/biocLite.R")

      biocLite (ג (, "qvalue" "anota"))
    4. מבחן שהחבילה הותקנה בהצלחה ולפתוח את המדריך לanota ידי הקלדה (בR-מסוף):

      ספרייה ("anota")

      vignette ("anota")
    5. הערה: ניתן למצוא עזרה נוסף עבור כל הפונקציות הנמצאים בשימוש בחבילת anota או בדף האינטרנט anota (http://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/anota.html) או על ידי שימוש פונקצית העזרה בתוך ר 'לדוגמה, כדי לקבל עזרה על פונקצית anotaPerformQc ללכת לR-terminal וסוג (שים לב שזה עובד רק כאשר חבילת anota כבר טעונה):

      # ספרייה ("anota") טוען את חבילת anota

      ? AnotaPerformQc # פותח עזרה עבור פונקציה זו
  2. נתוני יבוא לR:
    1. הכן את נתוני ביטוי לניתוח. הנתונים צריכים להיות מראש מעובד (למשל מנורמל ואיכות מבוקרת) ביחס לטכניקה ששימשה למדידת רמות ה-mRNA. ערכי קלט חייבים להיות מחוברים הפכו, הנפוץ ביותר הוא log2. לקמפל שולחן אחד עם נתונים עבור כל דגימות RNA הקשורים polysome ואחד בשביל כל דגימות RNA cytosolic. העמודה הראשונה צריכה להכיל את הגן-מזהה ואחרי עמודת נתונים אחת לדגימה; השורה הראשונה צריכה לכלול שמות לדגימות. זה קריטי, כי יש להם את השולחנות כדי מדגם זהה וסדר גן זהה. לשמור את הקבצים כקבצי טקסט מופרד באמצעות טאבים הנקראים "myPolysomeData.txt" ו "myCytosolicData.txt".
    2. בדוגמא זו שתי כיתות מדגם משמשות (שליטה או חולה) עם 3 חזרות לכל כיתה, ובכך לייצר 6 דגימות עם הסדר הזה: C1, C2, C3, D1, D2, D3 בשני קבצי myCytosolicData.txt וmyPolysomeData.txt. Anota דורש לפחות 3 חזרות לכל מצב שבו יש שתי כיתות מדגם. אלה צריכים להיות משכפל ביולוגי עצמאי.
    3. ליצור ספרייה המכילה את קבצי קלט נתונים (myPolysomeData.txt וmyCytosolicData.txt). R פתוח מהספרייה זו. ב-Windows / Mac זה יכול להיעשות על ידי העתקת R-קיצור לספרייה זו ומשיק R באמצעות קיצור זה (עובד באופן ישיר גם ניתן לשנות באמצעות התפריטים הנפתחים).
    4. צור קובץ בשם myCode.R בתוך הספרייה החדשה שנוצרה ולפתוח אותו באמצעות תוכנה לעריכת טקסט. לכתוב את הקוד בקובץ זה.
    5. כדי לטעון את הנתונים לR לכתוב את הקוד הבא לקובץ myCode.R (זוכר מחדש לשמור קובץ זה לאחר כל הוספה של קוד). להלן של צעד אחרהסבר TEP של הקוד אבל כל הקוד יכול גם להיות כתוב תחילה ופונקצית המקור (המפעיל את הקוד, ראה בהמשך) המשמש רק פעם אחת:

      # # זה טוען את ספריית anota

      ספרייה (anota)

      # # זה טוען נתוני קלט לR

      dataCyto <- as.matrix (read.table ("myCytosolicData.txt", כותרת = row.names = 1, Sep = " t" נכון,))

      dataPoly <- as.matrix (read.table ("myPolysomeData.txt", כותרת = row.names = 1, Sep = " t" נכון,))
    6. הפעל את הקוד במחקר על ידי הקלדה ישירה לתוך הטרמינל R:

      מקור ("myCode.R")
    7. בדוק שהנתונים היו טעונים בהצלחה על ידי הקלדה (לR-מסוף):
      # הראש (dataCyto) יציג החלק העליון של טבלת dataCyto
      ראש (dataPoly)
  3. זיהוי של גנים תורגמו באופן דיפרנציאלי:
    1. צור וקטור המתארקטגוריות המדגם (וקטור הוא סוג של אובייקט בR). וקטור זה צריך לשקף את הסדר לדוגמא בmyPolysomeData.txt וmyCytosolicData.txt כך שלכל שלושת האובייקטים כדי זהה של הדגימות. הווקטור ישמש כאשר מורה anota על שדגימות כדי להשוות. להוסיף את הדברים הבאים לקובץ myCode.R:

      # # שים לב שיש להם את הדגימות לשכפל זהה כיתת מדגם

      # # תיאורים ("C", כלומר או "D") בווקטור הזה.

      myPhenotypes <- ג ("C", "C", "C", "D", "D", "D")
    2. לבצע בקרת איכות של ערכת הנתונים. ישנם מספר מדדי איכות שצריך להיות מוערכים לפני anota יכול לשמש לניתוח. אלה הם דנו בפירוט במדריך anota. הוסף קוד זה לקובץ myCode.R ולשמור:

      anotaQcOut <- anotaPerformQc (dataT = dataCyto, dataP = dataPoly,phenoVec = myPhenotypes)

      anotaResidOut <- anotaResidOutlierTest (anotaQcObj = anotaQcOut)
    3. הפעל את הקוד על ידי הקלדה לתוך R-מסוף:

      מקור ("myCode.R")

      זה יפיק מספר קבצי פלט, שניתן לבחון בהתאם להוראות במדריך anota.
    4. זיהוי גנים תורגמו באופן דיפרנציאלי. דוגמאות תהיה בהשוואה על בסיס הסדר א"ב של השמות המסופקים לפרמטר "phenoVec" (כלומר הווקטור "myPhenotypes"), אלא אם כן הם שצוינו על ידי המשתמש (באמצעות הפרמטר "ניגודים"). הוסף את הקוד הבא לmyCode.R קובץ ולסיים באמצעות הפקודה "המקור" בתוך R-מסוף כפי שתואר לעיל:

      anotaSigOut <- anotaGetSigGenes (dataT = dataCyto, dataP = dataPoly, phenoVec = myPhenotypes, anotaQcObj = anotaQcOut)
    5. השתמש בעזרה לanotaGetSigGenes להבין כיצד output מעוצב ולראות איך לבחור קטגוריות מדגם כדי להשוות על ידי הקלדה (בR-מסוף):

      ? AnotaGetSigGenes
    6. גנים סינון ועלילה שמתורגמים באופן דיפרנציאלי. יש ספים מרובים שניתן ליישם בתוך פונקצית anotaPlotSigGenes ובאמצעות עזרה יפשט שילוב מותאם אישית של ספים כזה. כדי לבחור לגנים ניתחו באופן מהימן להחיל (-0.5) minSlope, maxSlope (1.5) וslopeP (0.01) הגדרות.
      הערה: בנוסף, הגדרות החלות על 23,26,30 שיעור RVM שווא גילוי (רוזוולט) (0.15) ולקפל שינויים (log2 [1.5]) עשוי למשל לשמש לזיהוי גנים תורגמו באופן דיפרנציאלי. מסננים אחרים כגון "selDeltaPT" יכולים להיות שימושיים לסינון מחמיר יותר (לדוגמא: הגדרת selDeltaPT לlog2 [1.5]). כמו כן יש לציין שהשוואה צריכה להיות מסוננת (על ידי שימוש בטיעון selCont). להחיל את ההגדרות שתוארו על ידי הוספת השורה הבאה לmyCode.Rקובץ:

      anotaSigFiltered <- anotaPlotSigGenes (anotaSigObj = anotaSigOut, selContr = 1, minSlope = (-0.5), maxSlope = 1.5, slopeP = 0.01, maxRvmPAdj = 0.15, minEff = log2 (1.5), selDeltaPT = log2 (1.5))
    7. לבצע את הניתוח על ידי שימוש בפונקצית המקור מR-מסוף כפי שתואר לעיל. זה גם יפיק פלט גרפי. בדיקת פלט זה היא נקודת התחלה טובה כדי להעריך את הביצועים של הניתוח ולזהות את כל שינויים נדרשים בהגדרות.
    8. ליצור טבלת פלט. הוסף את הקוד הבא לקובץ myCode.R:

      write.table (anotaSigFiltered selectedRvmData $, קובץ = "MySignificantGenes.txt", Sep = " t")
    9. הפעל את הקוד באמצעות פונקצית המקור בR-המסוף. העמודות בטבלה וכתוצאה מכך הם הסבירו בעזרה לפונקצית anotaPlotSigGenes.

תוצאות

mTOR הוא צומת מרכזית של הרשת הסלולרית, המרכזת את שיעורי סינתזת חלבון העולמיים עם זמינות חומרי הזנה 19. תרגום mRNA מוסדר בעיקר בשלב ייזום שער הגבלת 6. חלקם של הריבוזומים העוסקים בpolysomes חיובי בקורלציה עם שיעורי חניכה תרגום 28. דוגמא ליישום שיטת חלוקה polysome כדי לחקור את התפקיד של איתות mTOR בתיווך ההשפעות של אינסולין על תרגום ה-mRNA מוצגת. לשם כך, תאי סרטן השד אנושיים MCF7 נשמרו בסרום נמוך ולאחר מכן מגורה עם אינסולין לבד או בשילוב עם מעכב mTOR הפעיל באתר Torin1. תאים שאינו מגורה שהוחזקו ברציפות בסרום נמוך, שימשו כבקרה. mRNPs, monosome (80S) והשברים polysome הופרדו בשיטת חלוקה polysome. יחסית לתאי בקרה, אינסולין הנגרם עלייה בספיגה בשברי שיפוע המתאיםלpolysomes, לוו בירידה מקבילה בספיגה בשבריר monosome (איור 1). ממצאים אלה מראים כי חלקם של הריבוזומים העוסקים בpolysomes מוגבר באינסולין שטופל בהשוואה לתאי בקרה, ולכן מצביע על כך, כצפוי, אינסולין מגרה שיעורי התחלת התרגום עולמיים. Torin1 התהפך ההשפעות של אינסולין על פרופילים ספיגת (איור 1), ובכך מאמת את הממצאים שאיתות mTOR משחקת תפקיד מרכזי בתיווך ההשפעות של אינסולין על מכונות תרגום 19.

בהתבסס על עיקרון שלא ניתן להימנע מחוסר העקביות בהכנה הדרגתית, שאלות הועלו לגבי שחזור של נתונים המתקבלים בשיטת חלוקה polysome 22. כדי לבדוק סוגיה זו עלולה להיות מזיקה, cytosolic ו-RNA הכבד הקשורים polysome (mRNA הקשורים 4 ויותר הריבוזומים) באופן אמפירי היו מבודדים מMCF7 תאים שטופלו באינסולין לבד או אינסולין בשילוב עם Torin1 מ4 משכפל ביולוגי עצמאי (איור 2). ההשפעות של אינסולין וTorin1 על הרכב cytosolic וmRNA הקשורים polysome הכבד בכל אחד לשכפל נקבעו בקנה מידת הגנום באמצעות גישת microarray. כדי לקבוע את שחזור של שיטת חלוקה polysome הניתוח העיקרי הרכיב (PCA) יושם. ניתוח כזה הראה כי הדגימות שייכות לכל תנאי הוצבו בחוזקה בשני המרכיבים הראשונים בזמן שהתנאים השונים הופרדו (איור 2) כן. ממצאים אלה מראים כי שיטת חלוקה polysome כפי שמתואר כאן היא מאוד לשחזור, ולכן מתאים ללמוד שינויים כמותיים ואיכותיים בתרגום ברמה הגנום כולו.

"Src =" ad/51455/51455fig1highres.jpg / files/ftp_upload/51455/51455fig1.jpg "/>
איור 1. פרופילי Polysomal מראים את ההשפעות של רעב בסרום, אינסולין וmTOR איתות על תרגום העולמי בתאי MCF7. MCF7 תאים נשללו של חומרים מזינים (נשמרו ב0.1% FBS) ל16 שעות וטופלו באינסולין 5 ננומטר (Ins) לבד או בשילוב עם 250 ננומטר Torin1 (Ins + Torin1) למשך 4 שעות. תאים שלא טופלו שנשללו ברציפות של חומרים מזינים (0.1% FBS) שימשו כביקורת. תמציות cytosolic המקבילות היו משקעות על ידי צנטריפוגה במילויי סוכרוז 5-50%. יחידות משנה חינם ריבוזומלי (40S ו60S), monosomes (80S) ומספר הריבוזומים בשברי polysome מצוינים.

figure-results-1
איור 2. נתוני הגנום שהושגו באמצעות polysome פרופיל הוא מאוד לשחזור. טופלו MCF7 תאים כמו באיור 1. Cytosolic ו-RNA הקשורים polysome (> 3 הריבוזומים) היה שחולצו מן 4 משכפל ביולוגי עצמאי ורמות ה-mRNA הגנום שלהם נקבעו באמצעות מערכי GeneTitan (Affymetrix). PCA שימשה כדי להעריך את שחזור של הנתונים מתקבל. מוצגים הם שני המרכיבים הראשונים PCA עבור כל הטיפולים (T1 = טורין 1; ctrl = שליטה; Ins = אינסולין), מקורו של RNA (C = cytosolic, P = הקשורים polysome) ומשכפלים. דוגמאות מאותו המצב ומוצא RNA מוצבות בשיתוף פעולה הדוק המצביעות שחזור גבוה.

דיון

מאמר זה מתאר פרוטוקול חלוקה polysome מבוסס היטב ואחריו שיטת ניתוח שפותח בבית עבור לכידת שינויים איכותיים וכמותיים בפעילות translational בקנה מידת הגנום בתאי יונקים. לסיום מוצלח של תשומת לב מיוחדת בפרוטוקול זה צריך להיות משולם על 1 confluency הנייד) (כשיעורי תפוצה וזמינות חומרי הזנה לתאם עם פעילות תרגום mRNA והוא יכולים להשפיע על הרכב translatome, confluency התא צריך להיות עקבי בחזרות ותנאי ניסוי), 2) תמוגה תא מהירה (על אף נוכחותם של cycloheximide ומעכבי RNAse במאגרים, תמוגה צריכה להיות מהירה ותמציות סלולריות צריכה להיות מעולף על הדרגתיים סוכרוז מייד לאחר תמוגה כדי למנוע השפלה RNA וניתוק של polysomes), 3) הכנת צבע (על מנת להבטיח שחזור נתונים גבוה, צריך להיות מוכן הדרגתיים סוכרוז באמצעות יצרנית השיפוע וspeיש להקפיד cial בעת הטיפול בהם).

בנוסף לומד את השינויים בפעילות translational, פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לבודד מתחמים הקשורים חלבון הריבוזום ולבסס פונקציות הפיזיולוגיות שלהם. לשם כך, ניתן לקבוע רמות ומעמד זירחון של חלבונים הקשורים הריבוזום השונים על ידי המשקעים TCA, ואחריו מערבי סופג, ואילו ניתן immunoprecipitated משברי שיפוע קומפלקסי חלבוני הריבוזום הקשורים ונותחו על ידי מערבי סופג או ספקטרומטר מסה. חסרון של שיטה זו הוא ששיטת שבריר השיפוע האיטית עלולה לגרום לניתוק של חלבונים אפילו קשורים בחוזקה קינטיקה שהכריכה הן בשיתוף / ניתוק מהיר. גורמים הקשורים לפוליפפטידים מסונתזים חדש הם דוגמאות טיפוסיות. פוליפפטידים מסונתזים חדש מתפתחים בצורת הריבוזומים יכולים להיות משותקים בקומפלקסי חלבונים הקשורים הריבוזומים באמצעות linkers הצולבת הכימית כגון 3, 3'-dithiobis [sulfosuccinimidylpropionate] (DTSSP) ביום 31. גישה זו עולה כי קולטן לקינאז C 1 (RACK1) הופעל קינאז N-המסוף / ג יוני / גורם התארכות תרגום אוקריוטים (JNK) 1A2 מורכב (eEF1A2) מסדיר השפלה של פוליפפטידים מסונתזים חדש בתגובה ללחץ 27. בנוסף, במתודולוגיה דומה במחקרים המראים כי חלבון קינאז C bII (PKCbII) מגויס לריבוזומים ידי RACK1 32 והפעלה של mTOR מורכב 2 (mTORC2) מתרחש על הריבוזומים שבו phosphorylates פוליפפטידים AKT מסונתזים חדש ומווסתים אותם יציבות 33,34.

מגבלות עיקריות של שיטת חלוקה polysome אחרי ניתוח anota הן: 1) דרישה למספר גבוה יחסית של תאים (~ 15 x 10 6 תאים), 2) חוסר מידע positional לגבי לוקליזציה של הריבוזום על מולקולת mRNA נתון, ו3 סוגיות) הקשורים להטרו התאי והמולקולריgeneity של רקמות נורמליות וסרטניות. נושאים הקשורים למספר תא הדרוש ניתן לפתור על ידי יישור פסגות ספקטרום ספיגת המתאימים monosomes (80S) של תאים שסכומי הגבלה עם אלו המתקבלות מהתאים גבוה שפע (למשל תאי הלה) 35. טכניקת אפיון ריבוזום (ראה להלן) ניתן להשתמש כדי לקבוע את מיקום של הריבוזום על מולקולת mRNA נתון מדויק, ואילו נושאים הקשורים לתופעות של בלבול של הטרוגניות רקמה על הפרשנות של שינויים בביטוי הגנים המתקבלים ממערכות מורכבות כגון רקמות אדם נדונים בפירוט בפרסום על ידי כרישה וסטורה 36.

לאחרונה, הריבוזום רומן פרופיל טכניקה פותח, שבו שברי הריבוזום מוגנים (RPFs) מופקים על ידי RNAse טיפול ונותחו על ידי עמוק רצף 22. טכניקה זו מאפשרת קביעת מיקום הריבוזום ברזולוציה נוקלאוטיד יחידה, ובכך לספק עד כה unprתובנות ecedented לביולוגית הריבוזום. לדוגמא, פרופיל הריבוזום יכול לשמש לקביעת צפיפות הריבוזום על מולקולת mRNA נתון או זיהוי של אלמנטים ששיעורי התחלת תרגום השפעה כגון אתרים חלופי ייזום, חניכה בקודונים שאינם, אוגוסט ואלמנטים רגולטוריים כמו uORFs. עם זאת, ישנן מספר מגבלות מתודולוגיות המגבילות את יכולתם של פרופיל הריבוזום להעריך את יעילות תרגום ה-mRNA בצורה מדויקת. אלה כוללים הטיות עצמאיות הוצגו על ידי פיצול אקראי וRNAse אני עיכול, הטיות שהוצגו על ידי מעכבי תרגום (למשל התארכות מעכבים כגון emetine וcycloheximide עשויים לגרום להצטברות הריבוזום באתרי חניכה תרגום), מספר רב של תוצאות שליליות חיוביות ושקר שקר קשור עם ציוני TE, כמו גם חוסר הדיוק שלהם בחיזוי קורא שמקורן mRNAs קידוד חלבון 37. ואולי הכי חשוב, ואילופרופיל הריבוזום מאפשר זיהוי ישיר של עמדה הריבוזום על מולקולת mRNA נתון, מספר הריבוזומים המשויך mRNA נתון מוערך בעקיפין על ידי נרמול תדרים שלה כתוב בRPFs (mRNA הקשורים הריבוזום) על פני אלו שנצפו בmRNAs באופן אקראי המקוטע (סה"כ mRNA). לדוגמא, בהגדרה פשוטה שבו ארבע מולקולות "B" mRNA (Ba, Bb, BC ו BD) תפוסות על ידי ארבעה הריבוזומים בעמדות 1, 2, 3 ו -4, חסרון הגלום בטכניקת פרופיל הריבוזום לא יתיר הבחנה בין תרחיש שבו כל 4 הריבוזומים לשייך רק עם ה-mRNA Ba בעמדות 1, 2, 3, ו -4 ותרחיש שבו Ba, Bb, BC ו-BD-mRNA כל אחד מהם נכבשו על ידי הריבוזום בודד בעמדה 1, 2 , 3, ו -4, בהתאמה. לעומת זאת, במהלך חלוקה polysome, polysome יושרה נשמרה, ובכך לאפשר בידוד של בריכות של mRNAs קשור למספר מוגדר של הריבוזומים (איור 1). יבוא זההבחנה בין נמלת חלוקה polysome ופרופיל הריבוזום עולה כי בעוד שהשיטה לשעבר יכולה לשמש כדי להשוות ישירות mRNAs בmRNP, שברי אור וpolysome הכבד, השיטה השנייה צפויה להיכשל כדי ללכוד שינויים בtranslatome שנגרמים על ידי mRNAs שהמעבר מ להדליק לpolysomes הכבד, תוך הערכת יתר התרומה של אלה שעוברים מחלק mRNP לpolysomes הכבד. המשמעות הביולוגית של הבדלים אלה בין השיטות הנ"ל מודגשת על ידי גוף גדול של נתונים המראה כי הפעלת translational של קבוצת משנה של mRNAs כמו אלה שהם eIF4E רגיש, מעבר מהאור לpolysomes כבד, ואילו כגון אלה, אחרים מחסה אלמנטי 5'TOP, מגויסים לpolysomes הכבד ישירות מבריכות של mRNA ללא הריבוזום 6. מעניין, את מסלול mTOR הוכח לווסת את התרגום של "eIF4E רגיש" ו5'TOP mRNAs 1 במקביל1. לכן, הבדלים מתודולוגיים שנדונו לעיל יכולים להסביר את חוסר ההתאמה לכאורה של המסקנה בין מחקרים באמצעות הריבוזום פרופיל 38,39 וחלוקת polysome 24 כדי להעריך את ההשפעות של עיכוב mTOR בtranslatome.

לסיכום, חלוקה polysome ופרופיל הריבוזום הם שיטות משלימות שמספקות בעיקר מידע לגבי מספר הריבוזומים הקשורים mRNA ואת המיקום של הריבוזום על mRNA, בהתאמה. חשוב מכך, על אף החסרונות ויתרונות של שיטות אלה, הוא נשאר חיוני כי נתוני הגנום מתקבלים על ידי שני ההליכים כראוי ניתחו ותפקודי ויוכימית אומתו.

גילויים

המחברים מצהירים שום אינטרסים כלכליים מתחרים.

תודות

מחקר זה נתמך על ידי המכון הקנדי למענק מחקר הבריאות (CIHR MOP-115,195) וFRQ-S ל-IT, שהוא גם נמען CIHR פרס חוקר צעיר של; והמועצה למחקר השבדי והאגודה למלחמה בסרטן השבדית לOL

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
HEPESBiobasicHB0264
MgCl2SigmaM8266
KClVWRCABDH4532
Dithiothreitol (DTT)BiobasicDB0058
TrisBiobasicTB0196
GlycoblueAmbionAM9515RNA נשא משקעים
נתרן דאוקסיכולאט SigmaD6750
Triton X-100SigmaX100
CycloheximideSigmaC1988
קוקטייל מעכב פרוטאז 04693132001 של רוש(ללא EDTA)
מעכב RNase PromegaN2515
0.45 ומיקרו; m מערכת סינון 150 מ"לקורנינג431155
סוכרוזסיגמאS0389
RNeasy MinElute ערכת ניקוי Qiagen74204ערכת ניקוי RNA
צינורות אולטרה-צנטריפוגה פוליאלומר דק קיר בקמן קולטר331372
SW41Ti רוטור חבילה עם אביזריםבקמן קולטר331336
אופטימה L100 XP אולטרה צנטריפוגהבקמן קולטרDS-9340A
אספן שברים ISCO ברנדלFC-176-R1
סוג II גלאי עם מקליט תרשיםברנדלUA-6גלאי UV
פירסר צינור עם תא זרימה ומשאבת מזרקברנדלBR-A86-5
UA-6 כבל גלאיברנדל60-1020-211
FC-176 כבל תקשורתברנדלFCC-176
יחידת בסיס מאסטר שיפועBiocomp108-1יוצר שיפוע
קבצים מצורפים ליצירת שיפועBiocomp105-914A-1Rמצורף יוצר שיפוע מדידה
מחשוב 8 ערוצים 50 קילו-הרץ מכשיר רכישת נתוניםMicroDAQUSB-1208FSתוכנת ניתוח מצורף
מדידה מחשוב רכישת נתונים תוכנת ניתוחMicroDAQTracerDAQ Pro(להורדה בלבד)
מאגר 10x לשיפועי סוכרוז:
200 מ"מ HEPES (pH7.6)
1 M KCl
50 מ"מ MgCl<תת>2
100 ומיקרו; גרם/מ"ל ציקלוהקסימיד
1x קוקטייל מעכב פרוטאז (ללא EDTA)
100 יחידות/מ"ל מעכב
מאגר
5 מ"מ Tris-HCl (pH7.5)
2.5 מ"מ MgCl2
1.5 mM KCl 
קוקטייל מעכב פרוטאז 1x (ללא EDTA)]
לאחר מכן הוסף ציקלוהקסימיד (CHX), DTT, מעכב RNAse, טריטון ונתרן דאוקסיכולט כפי שמצוין בטקסט
טבליות RNaseליזה הראשי

מקורות

  1. Maier, T., Guell, M., Serrano, L. Correlation of mRNA and protein in complex biological samples. FEBS Lett. 583, 3966-3973 (2009).
  2. de Sousa Abreu, R., Penalva, L. O., Marcotte, E. M., Vogel, C. Global signatures of protein and mRNA expression levels. Mol Biosyst. 5, 1512-1526 (2009).
  3. Keene, J. D. RNA regulons: coordination of post-transcriptional events. Nat Rev Genet. 8, 533-543 (2007).
  4. Komili, S., Silver, P. A. Coupling and coordination in gene expression processes: a systems biology view. Nat Rev Genet. 9, 38-48 (2008).
  5. Schwanhausser, B., et al. Global quantification of mammalian gene expression control. Nature. 473, 337-342 (2011).
  6. Sonenberg, N., Hinnebusch, A. G. Regulation of translation initiation in eukaryotes: mechanisms and biological targets. Cell. 136, 731-745 (2009).
  7. Rolfe, D. F., Brown, G. C. Cellular energy utilization and molecular origin of standard metabolic rate in mammals. Physiol Rev. 77, 731-758 (1997).
  8. Johnson, L. F., Levis, R., Abelson, H. T., Green, H., Penman, S. Changes in RNA in relation to growth of the fibroblast. IV. Alterations in theproduction and processing of mRNA and rRNA in resting and growing cells. J Cell Biol. 71, 933-938 (1976).
  9. Fabian, M. R., Sonenberg, N., Filipowicz, W. Regulation of mRNA translation and stability by microRNAs. Annu Rev Biochem. 79, 351-379 (2010).
  10. De Benedetti, A., Graff, J. R. eIF-4E expression and its role in malignancies and metastases. Oncogene. 23, 3189-3199 (2004).
  11. Roux, P. P., Topisirovic, I. Regulation of mRNA translation by signaling pathways. Cold Spring Harb Perspect Biol. 4, (2012).
  12. Ron, D., Harding, H. P. Protein-folding homeostasis in the endoplasmic reticulum and nutritional regulation. Cold Spring Harb Perspect Biol. 4, (2012).
  13. Silvera, D., Formenti, S. C., Schneider, R. J. Translational control in cancer. Nat Rev Cancer. 10, 254-266 (2010).
  14. Proud, C. G. mTOR Signalling in Health and Disease. Biochem Soc Trans. 39, 431-436 (2011).
  15. Topisirovic, I., Sonenberg, N. mRNA Translation and Energy Metabolism in Cancer: The Role of the MAPK and mTORC1 Pathways. Cold Spring Harb Symp Quant Biol. , (2011).
  16. Pavitt, G. D., Proud, C. G. Protein synthesis and its control in neuronal cells with a focus on vanishing white matter disease. Biochem Soc Trans. 37, 1298-1310 (2009).
  17. Abe, M., Bonini, N. M. MicroRNAs and neurodegeneration: role and impact. Trends Cell Biol. 23, 30-36 (2013).
  18. Kasinath, B. S., et al. Regulation of mRNA translation in renal physiology and disease. Am J Physiol Renal Physiol. 297, 1153-1165 (2009).
  19. Zoncu, R., Efeyan, A., Sabatini, D. M. mTOR: from growth signal integration to cancer, diabetes and ageing. Nat Rev Mol Cell Biol. 12, 21-35 (2011).
  20. Schneider-Poetsch, T., et al. Inhibition of eukaryotic translation elongation by cycloheximide and lactimidomycin. Nat Chem Biol. 6, 209-217 (2010).
  21. Larsson, O., Tian, B., Sonenberg, N. Toward a genome-wide landscape of translational control. Cold Spring Harb Perspect Biol. 5, (2013).
  22. Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R., Weissman, J. S. Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling. Science. 324, 218-223 (2009).
  23. Larsson, O., Sonenberg, N., Nadon, R. Identification of differential translation in genome wide studies. Proc Natl Acad Sci U S A. , (2010).
  24. Larsson, O., et al. Distinct perturbation of the translatome by the antidiabetic drug metformin. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 8977-8982 (2012).
  25. Colman, H., et al. Genome-wide analysis of host mRNA translation during hepatitis C virus infection. J Virol. 87, 6668-6677 (2013).
  26. Larsson, O., Sonenberg, N., Nadon, R. anota: Analysis of differential translation in genome-wide studies. Bioinformatics. 27, 1440-1441 (2011).
  27. Gandin, V., et al. Degradation of Newly Synthesized Polypeptides by Ribosome-Associated RACK1/c-Jun N-Terminal Kinase/Eukaryotic Elongation Factor 1A2. Complex. Mol Cell Biol. 33, 2510-2526 (2013).
  28. Warner, J. R., Knopf, P. M., Rich, A. A multiple ribosomal structure in protein synthesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 49, 122-129 (1963).
  29. Gierer, A. Function of aggregated reticulocyte ribosomes in protein synthesis. J Mol Biol. 6, 148-157 (1963).
  30. Wright, G. W., Simon, R. M. A random variance model for detection of differential gene expression in small microarray experiments. Bioinformatics. 19, 2448-2455 (2003).
  31. Eggers, D. K., Welch, W. J., Hansen, W. J. Complexes between nascent polypeptides and their molecular chaperones in the cytosol of mammalian cells. Mol Biol Cell. 8, 1559-1573 (1997).
  32. Grosso, S., et al. PKCbetaII modulates translation independently from mTOR and through RACK1. Biochem J. 415, 77-85 (2008).
  33. Oh, W. J., et al. mTORC2 can associate with ribosomes to promote cotranslational phosphorylation and stability of nascent Akt polypeptide. EMBO J. 29, 3939-3951 (2010).
  34. Zinzalla, V., Stracka, D., Oppliger, W., Hall, M. N. Activation of mTORC2 by association with the ribosome. Cell. 144, 757-768 (2011).
  35. Bjur, E., et al. Distinct translational control in CD4+ T cell subsets. PLoS Genet. 9, e13(2013).
  36. Leek, J. T., Storey, J. D. Capturing heterogeneity in gene expression studies by surrogate variable analysis. PLoS Genet. 3, 1724-1735 (2007).
  37. Guttman, M., Russell, P., Ingolia, N. T., Weissman, J. S., Lander, E. S. Ribosome Profiling Provides Evidence that Large Noncoding RNAs Do Not Encode Proteins. Cell. 154, 240-251 (2013).
  38. Hsieh, A. C., et al. The translational landscape of mTOR signalling steers cancer initiation and metastasis. Nature. 485, 55-61 (2012).
  39. Thoreen, C. C., et al. A unifying model for mTORC1-mediated regulation of mRNA translation. Nature. 485, 109-113 (2012).

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

מדרג צפיפות סוכרוזבידוד ריבוסומיםניתוח תרגום mRNAטיפול בציקלוהקסימידאולטרה-צנטריפוגציהמיצוי RNAפעילות תרגומיתפרופיל ריבוסומי
Polysome היפוך חלוק וניתוח של יונקי Translatomes בקנה מידת הגנום
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.