מאמר שיטה

גבוהה Scalable תפוקה בחירה מספריות נוגדן סינטטיים-מוצג הפאג

DOI:

10.3791/51492

⸱

17 בינואר 2015

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1The Recombinant Antibody Network, 2The Banting and Best Department of Medical Research, University of Toronto, 3Antibiome Center, University of California, San Francisco at Mission Bay, 4Department of Biochemistry and Molecular Biology, The University of Chicago

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שיטה מתוארת בליווי חזותי לניהול בחירות להרחבה, תפוקה גבוהות מספריות נוגדן סינתטיות קומבינטורית-מוצג הפאג נגד מאות אנטיגנים בו-זמנית. שימוש בגישה זו במקביל, יש לנו מבודד שברי נוגדן שמפגינים זיקה גבוהה וספציפיות לאנטיגנים שונים כי הם פונקציונליים בimmunoassays הסטנדרטי.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הביקוש לנוגדנים אשר עונה על הצרכים של שני יישומי המחקר הבסיסיים וקליניים הוא גבוה ויגדיל באופן דרמטי בעתיד. עם זאת, נראה כי טכנולוגיות חד שבטיים מסורתיות לא לבד עד למשימה זו. זה הוביל לפיתוח שיטות חלופיות כדי לספק את הביקוש באיכות גבוהה וחומרים כימיים זיקה מתחדשים לכל האלמנטים הנגישים של proteome. לשם כך, שיטות תפוקה גבוהות לביצוע בחירות מספריות נוגדן סינטטיים-מוצג הפאג כבר המציאו עבור יישומים הכוללים אנטיגנים מגוונים ומותאמות לתפוקה ולהצלחה מהירות. במסמך זה, פרוטוקול מתואר בפירוט שממחיש עם הפגנת וידאו בחירה המקבילה של שיבוטים Fab-הפאג מספריות גיוון גבוהות נגד מאות יעדים או באמצעות מערכת רובוטיקה אוטומטית מטפל נוזלי ידני 96 ערוצים או. שימוש בפרוטוקול זה, משתמש יחיד יכול ליצור מאות אנטיגנים,בחר נוגדנים להם במקביל ולאמת את הנוגדן מחייב בתוך 6-8 שבועות. מודגש הם: i) פורמט אנטיגן קיימא, ii) אפיון אנטיגן מראש בחירה-, iii) שלבים קריטיים המשפיעים על הבחירה של שיבוטים זיקה מסוימים וגבוהים, וiv) דרכים אפקטיביות בחירת ניטור ואפיון שיבוט נוגדן שלב מוקדם. עם גישה זו, השגנו ברי נוגדן סינטטיים (Fabs) לכיתות יעד רבות, כולל קולטנים יחידים לעבור קרום, הורמונים מופרשים חלבון, וחלבונים תאיים רב-תחום. הם שברים אלה יומרו בקלות לנוגדנים באורך מלא ואומתו להציג זיקה גבוהה וספציפיות. יתר על כן, הם כבר הוכיחו להיות פונקציונליים במגוון רחב של immunoassays הסטנדרטי כולל מערבי סופג, ELISA, immunofluorescence הסלולרי, immunoprecipitation מבחני בנושא. מתודולוגיה זו תאיץ גילוי נוגדנים וסופו של דבר יביא אותנו קרוב יותר למימוש המטרה of יצירת נוגדנים מתחדשים, באיכות גבוהה לproteome.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עם תחילתו של עידן פוסט-גנומי, הזמינות של חומרים כימיים המחייבים באיכות גבוהה לאפיין ולווסת את החלבונים חיונית כדי לפתוח מחקר חדש ושדרות טיפוליות. נוגדנים ימשיכו להיות גורלי לשני חוקרים האקדמיים ותעשייתיים כמחקר בסיסי וכלי אבחון ותרופות פוטנציאליות. באופן לא מפתיע, חל גידול מרשים של חברות פיתוח נוגדן חוזה, שרובם להסתמך על טכנולוגיות hybridoma קונבנציונליות כדי לייצר נוגדנים מותאמים אישית. עם זאת, בחירה במבחנה באמצעות ספריות נוגדנים המוצגות הפאג הופכת טכנולוגיה חלופית רבת עוצמה שיכול להציע יתרונות ייחודיים והצלחה בו יכולות טכנולוגיות קונבנציונליות עומדות בפני מגבלות 1, 2.

לאור הביקוש הרב לנוגדנים באיכות גבוהה כמו כלי מחקר, שני אתגרים עיקריים ליצירת נוגדנים מתחדשים הם 1 תפוקת בחירה) ו -2) av אנטיגןailability. מספר הקבוצות עכשיו תאר בצינורות בחירת מבחנה שמטרתן להגדיל את התפוקה ושיעור זיהוי נוגדן. פירוט תיאורים אלה מגוון של גישות קיימא שכוללים בחירה על שני באורך מלא מטרות 3,4, או מבני הקשורים תחומים 5,6,7, או באמצעות 6,8 או צלחת מבוססת 3,4 תוכניות קיבוע אנטיגן מבוסס חרוז. בנוסף, האימוץ הגובר של טכנולוגיות סינתזת גן 9 הפך את דור אנטיגן שיטתי, במיוחד של תחומים מבודדים, עלות סבירה יעיל ואף עלול להקל על הקושי בהשגת כמות מספקת של אנטיגן המטוהר, באורך מלא. על ידי שימוש בשתי הטכנולוגיות במקביל, צינור עצמאי ודור אנטיגן מדרגי ובחירת הנוגדן תוכנן שיאפשר הבידוד המקביל של נוגדנים לקבוצות גדולות של תחומים אנטיגן הביעו ולהקל על הפיתוח של חומרים כימיים לצ'הracterizing מחלקות שלמות של חלבונים מבני או תפקודי הקשורות.

לקראת מטרה זו, צינור משולב שזוגות בזיהוי סיליקו של תחומים אנטיגן לבטאו, סינתזת גן, ביטוי חיידקי תפוקה גבוה של אנטיגנים ונוגדני בחירות המוצגות הפאג מדרגי פותחו. צינור זה דורש תשתית רק בסיסית זמינה לרוב מעבדות מדעי החיים (כוללים ספריות נוגדן אשר זמינות יותר ויותר באמצעות הסכם רישיון או העברת חומר), אבל הוא גם נוח לאוטומציה לשימוש בקנה מידה תעשייתית. שימוש בפרוטוקול זה, ניתן ליצור מאות תחומים אנטיגן-מתויג זיקה, והבודד באופן שגרתי שברי נוגדן ספציפיים מאוד לרב של אנטיגנים אלה.

טכנולוגיית תצוגת הפאג הראתה תאימות הפגינה עם מגוון רחב של פורמטים מגיב זיקת רקומביננטי כולל Fab, scFv, ותחומים Fv אוטונומיים ומערך הולך וגדל של "מסגרות אלטרנטיביות 'קטנות (חלבונים שנועדו חוזרים ankyrin (DARPINS), פיברונקטין (Fn), תחומים lipocalin ועוד 10). דיון מוגבל בדוגמא זו לבידודה של שברי נוגדן Fab, למרות שהוא בחזקת יכולות להיות מותאמות בשיטות אלה לסוגים אחרים של ספריות. באמצעות טכנולוגיה זו, Fabs עם זיקה של ננו-מולר נמוך לקטן, מתויג תחומים חלבון כוללים תחומים גורם שעתוק, תחומים SH2, חלבונים ואחרים מחייבים RNA נבחר בהצלחה, שרבים מהם לקשור חלבון באורך מלא ופונקציונליים בimmunoassays כגון immunofluorescence , Immunoprecipitation ואימונוהיסטוכימיה. חשוב לציין, שיבוטים המחייבים רקומביננטי מתחדשים באופן מלא ויכולים להיות מחדש שנוצרו מביטוי בונה באמצעות הנפקת ייצור חיידקים גדל עקביות, שחזור ועלות-תועלת, ובכך מצדיק את ההוצאה של אימות שיבוט קפדני.

בprot זהocol ווידאו המצורף, שיטות בסיסיות לבחירת נוגדנים מספריות המוצגות הפאג השתמשו בתחומי אנטיגן משותקים הם הפגינו. שיטה מסוימת זו מעסיקה תחומים חלבון מתויג GST משותקים על ידי ספיחה פסיבית בצלחות microwell, למרות תגים אחרים 11,12,13 ופורמטי בחירה 13,14,2 גם שימשו בהצלחה. שיקולים קריטיים להגדרה וההתנהגות של בחירות עם ניטור מקביל של פרמטרים בחירת מטרתו לאתר ובידוד נוגדנים משובטים במיוחד מועשר לאימות מפורטים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Antigen דור

הערה: תחומים Antigen יכולה להיות מסונתזת ומשובטת על ידי מגוון של ספקים מסחריים למבנה ביטוי IPTG-מושרה מתאים.

  1. להפוך מבני ביטוי לT1-הפאג כימי מוסמך, עמיד, BL21 E. תאי coli על ידי ערבוב 10 ng של קידוד DNA ב -20 μl של 1X KCM על קרח בצלחת גם PCR 96 ואחריו התוספת של 20 L של תאים כימיים מוסמכים.
  2. דגירה את תערובת התא / DNA על קרח למשך 20 דקות, בRT למשך 10 דקות ולאחר מכן על קרח שוב למשך 2 דקות לפני החילוץ עם מרק סופר אופטימלי מראש חימם 100 μl עם גלוקוז תקשורת (SOC), מכסים עם חותם צלחת לנשימה ורועד ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1 ב 200 סל"ד בייקר מסלולית 2.5 סנטימטר.
  3. μl 5 הצלחת של תאים הפכו לוריא-Bertani (LB) / צלחות אגר בתוספת carbenicillin (100 ג '/ מיליליטר) ולגדול O / N להשיג מושבות אחת המשמשות ליצירת מניות גליצרול.
  4. לחסן 1 מיליליטר של תקשורת / פחמימות 2YT עם מניית גליצרול 5 μl ולגדול במשך שעה 12 על 37 מעלות צלזיוס בבלוק 96 גם עמוק היטב עם הרועד בסל"ד 200 בייקר מסלולית 2.5 סנטימטר.
  5. לחסן media15 NZY (בתוספת גלוקוז 0.05%, לקטוז 2%, ו- 100 גר '/ מיליליטר carbenicillin) עם דילול 01:40 של תרבות זו, ולאחר מכן ללחוץ במשך 6-8 שעות על 30 מעלות צלזיוס ו -200 סל"ד ב2.5 סנטימטר מסלולית שייקר.
  6. חיידקי גלולה ולטהר חלבוני אנטיגני בתפוקה גבוהה בצלחת מסנן 96-היטב המכילה שרף Ni-נ.ת.ע 100 μl לפי protocols16,17 שפורסם בעבר.
  7. קבע את הריכוז של חלבונים מטוהרים על ידי assay18 מחייב לצבוע ברדפורד ולאפיין לגודל ובטהרה על ידי הפרדה ויזואליזציה של מיקרוגרם 10-50 עם כתם Coomassie על ג'ל SDS-דף (ראה איור 2).
    הערה: בשלב זה חלבונים יכולים להיות מאופיינים יותר על ידי שיטות שלהעריך צבירת חלבון 19 או מתקפל 20, בהתאם לאופי של אנטיגן והדרישות של צינור הבחירה.

2. הכנה וכותרות של ספריית הפאג

  1. פיק מושבה אחת של E. T1 הפאג עמיד coli תאים לתוך 1 מיליליטר של תקשורת 2YT בתוספת 50 מיקרוגרם / מיליליטר טטרציקלין.
  2. ברגע שצמיחת תאים הוקמה חזותית, לדלל את התרבות בנפח גדול יותר של 2YT בתוספת 50 מיקרוגרם / מיליליטר טטרציקלין על מנת להבטיח נפח מספיק של תאים לזיהום (בדרך כלל 45 μl לדילול ספרייה, ראה להלן.).
  3. הכן את הספרייה לשימוש על ידי מזרז הפאג ממאגר אחסון עם 1 / נפח 5 של 20% PEG-8000 autoclaved, 2.5 M NaCl (PEG-NaCl) דוגרים על קרח למשך 30 דקות וpelleting זירז הפאג ידי צנטריפוגה ב 12,000 x ז.
  4. בטל supernatant וגלול זירז הפאג בנפח מתאים של pH 7.4 1x PBS, BSA 0.2% ו 0.05% Tween (PBT), התאמת to ריכוז הפאג מתאים לבחירות (במידת צורך), כדי להבטיח כיסוי ספרייה הולם. ראה שלב 2.9 ודיון.
  5. לדלל aliquot הפאג 5 μl לμl 45 של 1x PBS pH 7.4 בצלחת רב גם סטרילי, לערבב, וליצור סדרה של 10 דילולים לקפל באותו המאגר.
  6. הוסף 5 μl של דילול כל הפאג 45 μl של E הפאג עמיד T1. coli תאים בגידול שלב יומן (OD 600 = 0.4-.8) בצלחת אחרת multiwell, מכסים בחותם לנשימה ולדגור על 37 מעלות צלזיוס עם הרועד בסל"ד 200 למשך 30 דקות בייקר מסלולית 2.5 סנטימטר.
  7. צלחת 5 μl של תאים נגועים מכל אחת מהבארות לצלחת אגר מראש חימם בתוספת 100 ג '/ מיליליטר carbenicillin ולגדול O / N ב 37 מעלות צלזיוס עד מושבות גלויות.
  8. לחשב את סך הפאג / ml כדלקמן:
    הפאג / ml = מספר מושבות בצלחת carbenicillin במדגם x 200 x 10 i (כאשר i = num המקסימום לדלל ביותרבער של דילולים שבמושבות הן לכאורה).
  9. כדי לקבוע את מספר בארות אנטיגן מצופים, כדי להבטיח כיסוי של גיוון הספרייה, לחשב באופן הבא:
    נדרש מספר בארות אנטיגן מצופים =
    כיסוי של פי רצוי * גיוון ספרייה
    # של הפאג ל -100 μl

3. נוגדן מבחר מתוך ספריות-מוצג הפאג

3.1) Antigen קיבוע

  1. כדי להימנע להקפיא להפשיר מחזורים שיכולים להשפיע על איכות אנטיגן וכדי להקל על דילולים, להכין צלחת חלבון אנטיגן המניה מנורמלת ל100x ריכוזי עבודה (לדוגמא, 500 ג '/ מיליליטר) aliquot ולבלתי מחייבים 96-גם צלחות.
  2. הכן צלחות מצופים אנטיגן מפתרונות חלבון המניה ביום קודמים לכל סיבוב של בחירות על ידי דילול מצלחות המניה עם PBS.
  3. מעיל 96-גם צלחות קלקר גבוהות מחייב חלבון עם חלבון אנטיגן GST מתויג או p בקרה השלילי של 100 μlrotein (GST, BSA, neutravidin, וכו ') בשעה 5 מיקרוגרם / מיליליטר PBS. Shake ב 250 סל"ד 4 ° CO / N על שייקר microplate.
  4. הסר פתרון חלבון ממצופה microplates, לחסום את הצלחות מצופים אנטיגן וסלקציה שלילית עם 200 μl חיץ חסימה (BSA 0.2% ב 1x PBS pH 7.4) ולנער ב 250 סל"ד ב RT במשך 1-2 שעות.
  5. לאחר החסימה, לשטוף את הצלחות מצופים חלבון החסום ארבע פעמים עם 200 μl של 1x PBS pH 7.4 עם Tween 0.05% (PT) חיץ באופן ידני או באמצעות מכונת כביסה microplate אוטומטית.

3.2) הספרייה טרום אישור וAntigen-הפאג דגירה

  1. רוקן את הספרייה של אי (או tag-) שיבוטים ספציפיים מחייבים-מוצג הפאג בר נוגדן באמצעות העברה של 100 μl (10 12 הפאג) של ספריית הפאג מוכנה במאגר PBT למספר הבארות מצופים בחלבון בקרה שלילי או תג זיקה חופשי חלבון (לדוגמא, GST) שווה ערך למספר מטרות דגירה הפאגבבארות במשך 1-2 שעות בRT עם הרעד ב 250 סל"ד.
    הערה: כחלופי או אמצעים נוספים של סלקציה שלילית, דגירה יכולה גם להתבצע בנוכחות עודפת (5-25 מיקרומטר) תג חלבון מסיס זיקה (למשל, GST) כדי להסיר נוסף שיבוטים מחייבים תג ולשפר את התאוששות של יעד ספציפי מחייב שיבוטים.
  2. supernatant ההעברה הפאג מסלקציה שלילית לצלחות מצופים אנטיגן דגירה במשך 1-2 שעות בRT עם הרועד בסל"ד 250 ללכידתו של שיבוטים המחייבים ספציפיים.
  3. הסר הפאג מאוגד ולשטוף בארות של microplate 8-15 פעמים עם חיץ PT באופן ידני או באמצעות מכונת כביסה microplate. הסר חיץ לשטוף עודף רק לפני elution.

3.3) Elution, זיהום והפאג הגברה

  1. מוקדם ביום בחירות, לאסוף מושבה אחת של E. T1 הפאג עמיד coli תאים לתוך 1 מיליליטר של תקשורת 2YT בתוספת 50 מיקרוגרם / מיליליטר טטרציקלין ולגדול ב 37 מעלות wi Cה רועד ב 200 סל"ד בייקר מסלולית 2.5 סנטימטר או שווה ערך.
  2. ברגע שצמיחת תאים הוקמה וניתן לראות על ידי העין, להגביר את עוצמת הקול של מדיה עם 2YT בתוספת 50 מיקרוגרם / מיליליטר טטרציקלין על מנת להבטיח נפח מספיק של תאים לזיהום (בדרך כלל לבחירה 100 μl היטב).
  3. לגדול התאים עד OD 600 של .4-0.8 הוא הגיע (כ 5-7 שעות), ולאחר מכן לelute הפאג כבול להוסיף תאי 100 μl לצלחת אנטיגן שטף ולנער על 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
  4. להוסיף הפאג עוזר M13K07 לריכוז סופי של 1 x 10 10 CFU / ml ולדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 45 דקות עם הרעד ב 200 סל"ד.
  5. העברת תאי 1.2 מיליליטר של 2YT בתוספת 150 מיקרוגרם / מיליליטר carbenicillin ו -75 מיקרוגרם / מיליליטר kanamycin ב96-גם לחסום גם עמוק עם V-תחתון ולגדול O / N ב 37 מעלות צלזיוס עם הרועד בסל"ד 200 בכ -2.5 סנטימטר ייקר מסלולית.

3.4) הפאג הכנה וסיבובים חוזרים ונשנים של Selection

  1. חיידקי גלולה ידי צנטריפוגה ב 4000 XG במשך 15 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
  2. לערבב כמויות שווה של supernatants הפאג מצלחות לשכפל במיני-צינור 96-גם קופסא הכחולה microplate סטרילי, לנטרל עם 1/10 ה נפח של 10X PBT ומערבבים. סיבובים חוזרים של בחירה (החל מהשלב 3.1.1) במשך 3-4 סיבובים או עד ההעשרה הוא ציין (ראו סעיפים 4. ו7.) בהשוואה לחלבון בקרה שלילית.
    הערה: בסיבובים המוקדמים של בחירה כאשר העשרה משמעותית / זיהוי לא צפויה (כלומר, סיבובים 1 ו -2), כימות של כתוביות קלט והפלט הפאג (שתוארו בסעיף 7 ותוצאות נציג שמוצג באיור 3) עשויה להיות מועילה בהבטחה ריכוזי מינימום הפאג לבחירות מוצלחות (שתוארו בדיון) והם יותר מתאימים מאשר ELISAs נקווה.

4. אפיון על ידי נקווה ELISA

  1. חלבון נקשרים 96-גם מעיל גבוהing צלחות קלקר עם של GST מתויג חלבון אנטיגן או חלבון בקרה שלילית (GST, BSA, neutravidin וכו ') 100 μl ב -2 מיקרוגרם / מיליליטר כאמור בסעיף 3.1 ולנער על 4 מעלות CO / N.
  2. הסר אנטיגן העודף, לחסום את הצלחת עם 200 μl של חיץ חסימה עם הרעד במשך 1-2 שעות בRT ב 250 סל"ד על שייקר microplate ולשטוף ארבע פעמים עם חיץ PT 200 μl ביד או על ידי מכונת כביסה צלחת אוטומטית.
  3. החל מsupernatant הפאג 100 μl (בדילול 1: 10-1: 20 במאגר PBT), לנער ב 250 סל"ד במשך 15 דקות ב RT, ולשטוף את הצלחת שמונה פעמים עם חיץ PT 200 μl.
  4. הוספה של אנטי-M13-HRP 100 μl (1: 5,000 במאגר PBT). Shake ב 200 סל"ד במשך 30 דקות ב RT, ולאחר מכן לשטוף את הצלחת שש פעמים עם חיץ PT 200 μl ופעמים עם 200 μl של PBS.
  5. החל מיום 1 ב100 μl: מצע TMB 1 ולפתח במשך 5-15 דקות (או עד שצבע משמעותי פיתח), ואז לעצור את התגובה על ידי תוספת של של 1 MH 3 100 μl PO 4 ולקרוא את הצלחת ב 450 ננומטר.
  6. באופן כללי, להעשרה בבריכות הפאג ניתן לצפות בסיבובים 3-4 כיחס ספציפי מחייב לעומת מחייב הלא ספציפית של> 2 (ראה איור 4)
    הערה: זה אינפורמטיבי לציין אות מחייבת מוחלטת שגבוהה בחלבון תג הזיקה מציין העשרת קלסרים תג ספציפי (ולא קלסרים יעד), ושהאות מחייבת המוחלטת גבוהה בחלבון הבקרה השלילי מצביעה על העשרה שאינה ספציפי או " קלסרים דביקים ".

5. Clone בחירה, סידור ואפיון

5.1) בידוד של המשובטים Fab-הפאג יחיד

  1. כדי לבודד שיבוטים בודדים עבור סידור ואפיון, להדביק 1/10 ה נפח של בריכת הפאג המוגבר לE. הפאג עמיד T1 coli תאים בשלב יומן של צמיחה (OD 600 = 0.4-.8) בצלחת microtiter מסביב לתחתית, מכסים בbreathaחותם צלחת ble דגירה עם הרועד ב 200 סל"ד במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס.
  2. הכן דילולים סדרתי של פי 10 בתקשורת 2YT וצלחת על צלחות אגר נפרדות בתוספת 100 ג '/ מיליליטר carbenicillin.
  3. פיק מושבות אחת בעד 450 μl של תקשורת 2YT / פחמימות בתוספת 1 ​​x 10 9 M13K07 הפאג / מ"ל ולגדול O / N במיני-צינור 96 קופסא הכחולה microplate היטב סטרילי דוגרים על 37 מעלות צלזיוס עם הרועד ב 200 סל"ד.
  4. חיידקי גלולה ידי ספינינג ב 4000 XG במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
  5. supernatant הפאג המשובט יכול לשמש לריצוף של שיבוטים Fab-הפאג (כמתואר בסעיף 5.4) או למשובט ELISAs כדי לקבוע סגוליות נגד אנטיגנים משותקים (כמתואר בסעיפים 5.3 ו -21) שלתוצאות נציג מוצגות באיור מחייב ישיר 5.

5.2) ביטוי של השיבוטים Fab לאפיון

  1. בעקבות שיבוט לדואר מתאיםוקטור Xpression (ראה דיון), להרים E. אחת coli מושבות הפכו עם ביטוי בונה בעד 1 מיליליטר של תקשורת / פחמימות 2YT בצלחת 96 עמוקה היטב היטב באמצעות קצה קיסם או פיפטה סטרילית ולגדול ל12-16 שעות על 37 מעלות צלזיוס עם הרועד ב 200 סל"ד. ניתן לעשות זאת באופן ידני או עם בורר מושבה אוטומטית.
  2. ההעברה 40 μl של תרבות גדלה ל -1.5 מיליליטר של תקשורת NZY בתוספת גלוקוז / לקטוז / גליצרול בבלוק גם deepwell 96 לפי המתודולוגיה של et al למדן. 15
    הערה: לחלופין, ניתן לגדל תאים במשך 3-4 שעות (OD .8-1.0) בביטוי בתוספת שאינו וחלבון הנגרם על ידי התוספת של 1 מ"מ IPTG.
  3. מכסה את גוש התרבות (ים) עם חותם לנשימה ולהביע את השיבוטים Fab במשך 6-8 שעות על 30 מעלות צלזיוס עם הרועד ב 200 סל"ד. צלחות ספין ב 4000 XG במשך 15 דקות עד גלולה תאי חיידקים, להסיר את supernatant, צלחות כיסוי עם חותם נייר כסף ולהקפיא כדורים ב -20 ° C עד תמוגה.
  4. לשחרר Fabs הביע מכדורים שנאספו עם של חיץ תמוגה 100 μl (טריס HCl 50 מ"מ, 200 מ"מ NaCl, pH 1.25% Triton X-100 8.0 עם 1 מ"ג / מיליליטר יזוזים ו -10 מעכבי benzonase / תרבות ופרוטאז מיליליטר U) ורועד עבור 2 שעות על 4 מעלות צלזיוס.
  5. הסר פסולת תא על ידי צנטריפוגה ב 4000 XG במשך 15 דקות על 4 מעלות צלזיוס ולאסוף supernatant lysate הגולמי לשימוש באפיון ראשוני של הספציפיות על ידי צלחות ELISA (ראה סעיף 5.3).

5.3) אפיון Clone על ידי ישיר כריכה המשובטת Fab ELISA

  1. לשתק אנטיגנים כמתואר בסעיף 3.1 במקום aliquotting 30 μl של 2 מיקרוגרם אנטיגן / מיליליטר PBS לבארות של צלחת גם 384. פריסות אנטיגן מבוסס Quad בצלחת יכולות להקל על העברה מגיב בעת שימוש 96 ראשים מחלק המבוסס על ערוץ. לשטוף וצלחות ELISA בלוק כאמור בסעיף 3.1.
  2. lysates פינה נאסף מ סעיף 5.2 ניתן ליישם ישירות לאנטיגן המשותק לevaluation של כריכה. דגירה 30 μl של lysate לכל גם במשך 15 דקות ב RT עם הרעד ב 200 סל"ד.
    הערה: חלבון שיבוט מזוקק Fab יכול לחלופין לשמש על ידי דילול עד 10 מיקרוגרם / מיליליטר במאגר PBT ויישום 30 μl של כל שיבוט לבארות חסמו המכיל אנטיגן או חלבון בקרה שלילי (GST, BSA וכו ') ופיתוח באותו אופן שתואר להלן. לחלופין, Fab-הפאג יכול לשמש גם על ידי דילול 10 μl של supernatant הפאג (שתואר בסעיף 5.1) ב -20 חיץ μl PBT (1: 3) וגילוי עם נוגדנים אנטי-M13-HRP (שתואר בשלבי 4.4-4.5)
  3. הסר lysate העודף ולשטוף בארות באופן ידני או באמצעות צלחת אוטומטית שטפה 8x עם 100 μl של חיץ PT ולהסיר חיץ עודף.
  4. דגירה 30 μl של דילול 1: 5000 של נוגדן אנטי דגל המשני במאגר PBT למשך 30 דקות ב RT עם הרעד ב 200 סל"ד.
  5. לשטוף, לפתח ולכמת לפי סעיפים 4.3-4.5.
    הערה: נציגי תוצאותשיבוטים המחייבים שני ספציפיים ולא ספציפיים הממחישים מוצגים באיור 5.

5.4) רצף Clone

  1. הכן תערובת אמן PCR כפי שצוין בטבלה 2.
  2. הוסף 2 μl של תבנית PCR המתאימה (או supernatant הפאג או מושבה המכיל phagemid אחת מחדש מושעה חיידקים) 20 μl של תמהיל אב PCR מוכן עם פריימרים המתאימים בבארות של צלחת PCR.
    הערה: תערובות הורים נפרדות הנדרשות לקביעת רצף של שני גני השרשרת הכבדים וקלים.
  3. הפעל את תגובת PCR באמצעות הפרמטרים המפורטים בטבלה 2 - הגדרות PCR.
  4. ודא הצלחה של תגובת PCR על ידי ערבוב 5 μl של התגובה השלימה עם צבע טעינה על 1% agarose ג'ל בתוספת כתם ההדמיה DNA והדמיה על transilluminator 300 ננומטר.
  5. הוסף 2 μl של מוצר ה- PCR עד 10 μl של מים סטריליים המכילים 0.2; Μl כל אחד מphosphatase exonuclease ואלקליין השרימפס ולדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות ואחריו איון אנזים ב 80 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות כדי להסיר פריימרים עודפים כהכנה לריצוף.

6. Scaling לבחירות אוטומטיות

6.1) טיפול נוזלי מבוסס פיפטה

  1. הכן 1% (w / v) bromophenol הכחול במים ולהסיר חלקיקים מסיסים באמצעות מסנן 0.45 מיליליטר.
  2. כדי לקבוע את הטווח ליניארי של הספיגה על קורא הצלחת, להכין דילול 1: 1000 של הפתרון הכחול bromophenol 1% במים, ולהמשיך עם שני פי דילולים סדרתי (16 דילולים סך הכל).
  3. העבר את כל דילול 100 μl לצלחת גם שטוחה 96 תחתון ולקרוא את הספיגה ב 590 ננומטר. ספיגת העלילה מוחלטת מול גורם לדילול ולבחור דילול באמצע לקצה גבוה של הטווח ליניארי לבדיקות שלאחר מכן.
  4. להוסיף bromophenol הכחול למים או לפתרון האמיתישיהיה pipetted מבוסס על הדילול נבחר בשלב הקודם בנפח מספיק לpipetting לשלוש 96 צלחות גם, בתוספת הנפח המת במאגר.
  5. לכייל pipettor ערוץ אחד כדי לספק את בדיקת הנפח ידי pipetting מים על איזון וניתוח (מים 100 μl שוקל בRT 100 מ"ג.)
  6. השימוש בpipettor המכויל, להעביר את בדיקת הנפח של הפתרון הצבוע לפחות שלוש בארות של צלחת גם שטוחה 96 תחתון ולקרוא absorbances ב590 ננומטר, בשלושה עותקים.
  7. שוקל שלוש צלחות גם ריקות שטוחות תחתונה 96 על איזון אנליטיים ולהקליט ההמונים שלהם.
  8. פיפטה בדיקת נפח ממאגר לכל אחת משלוש 96 צלחות גם ולמדוד absorbances ב590 ננומטר, בשלושה עותקים.
  9. לשקול כל צלחת ולחשב את ההבדל במסה.
  10. ראשית, להעריך אם absorbances בכל טוב הוא אחידים בטווח של סובלנות (לדוגמא., +/- 5%) ובין אם הם עולים בקנה אחד עם הabsorbances דואר מתקבל על ידי יד pipetting עם pipetman המכויל. אם ערוצים מסוימים הם מעל או מתחת למתן-באופן עקבי (למשל ראה איור 6), בצע את הליכי תיקון ולחזור על תהליך ההערכה עד שכל הערוצים לספק כמויות אחידות.
  11. שנית, ברגע שכל הערוצים אישרו לספק כרכים אחידים, לבדוק את הדיוק של נפח שעל ידי חישוב ההפרש המסה הממוצע, בכל טוב. לדוגמא, קבוצת מטפל הנוזלי מכויל באופן מושלם עבור 100 μl תספק 9.60 גרם של מים לכל צלחת, או 0.10 גרם של מים בכל טוב. אם הנפח האמיתי נמסר הוא מעל או מתחת לנפח המיועד באופן עקבי, אז גורם תיקון יכול להיות מיושם, כלומר, תכנות 110 μl כדי לספק בעצם 100 μl.
    הערה: לנפחים קטנים, למשל, 10 μl, השתמש פי עשרה יותר bromophenol כחול בפתרון הצבוע, ולפני aliquot 90 μl מים ל96 הצלחות גם ביד, על מנת להבטיח כי absorbances הוא למדידה וירידה בטווח ליניארי.

6.2) כביסה צלחת אוטומטית

  1. לשתק יעד חיובי וחלבוני בקרה שליליים בבארות נפרדות של 96 גם microplates (שתי צלחות לכל מצב להיבדק) כמפורט בסעיף 3.1.
  2. לחסום אתרי קישור הלא ספציפי על ידי דגירה עם חסימת פתרון עבור שעה אחת ב RT.
  3. להוסיף aliquots 100 μl הזהה של 10 13 CFU / mL פתרון Fab-הפאג בPBT לכל הבארות בכל הצלחות מחייבים לכוון ודגירה עם תסיסה עדינה ב RT עבור שעה 2.
  4. לשטוף שתי צלחות על פי כל תנאי, צלחת אחת לזיהום וטיטרציה וצלחת אחת לELISA.
  5. להעריך את היעילות של השטיפה על ידי זיהום חיידקים ישיר ולטיטרציה (כמתואר בסעיף 3.3 (ללא תוספת M13K07) ו7.2.1) או פיתוח עם אנטי-M13 נוגדן HRP ומצע colorimetric (כמפורט בסעיף 4).
  6. fr כתוביות הפאגאום שיבוטים ספציפיים לעתים קרובות להניב בטווח של 10 הפאג 5 -10 7 / מיליליטר מחלבון משותק נגד שהשיבוט נקשר באופן ספציפי. חלק שייר הקישור לחלבון שלילי שליטה (לדוגמא, BSA) הוא צפוי ובדרך כלל 10 2 -10 5 הפאג / ml הם נצפו, אך כתוביות נמוכות מאוד (כלומר., <10 1) יכולות לאותת כביסה יתר על המידה מחמירה, שיכול להתפשר בחירה.
  7. להפאג הכריכה נקבע על ידי ELISA, להשוות את האותות המחייבים מוחלטים לחלבוני בקרה חיוביים ושליליים כדי לקבוע אם הכביסה רובוטית היא שווה ערך לתוצאות הוקמו שטיפת ידיים (איור 7).

6.3) חיטוי מכונת כביסת פלייט

  1. כדי להתחיל, להפעיל את פרוטוקול הטיהור להיבדק.
    הערה: אנו ממליצים על שימוש לפחות פעמיים בסך הכל קו הנפח, וראש ולספוג את הראש מכונת הכביסה במשך 5 דקות ב0.5% נתרן היפוכלוריט fr, טרי מדוללאקונומיקה מסחרית om (בדרך כלל 6% היפוכלוריט נתרן).
  2. ראש ולספוג את הראש מכונת הכביסה במשך 5 דקות במים סטריליים (autoclaved) ולבסוף, ראש המערכת עד הקווים מלאות באוויר.
  3. ראש הקווים עם מים סטריליים או חיץ לשטוף.
  4. לשטוף microplate 96 גם סטרילי פעם, להסיר ממכונת הכביסה וחותם עם חותם צלחת סטרילית. זה צלחת השליטה מראש זיהום.
  5. Aliquot של O 100 μl / N מוגבר supernatant תרבות הפאג לכל הבארות של צלחת 96 באר.
  6. לשטוף את הצלחת המכיל הפאג פעם אחת, ולאחר מכן להסיר ממכונת הכביסה וחותם עם חותם צלחת פלסטיק או נייר. זה צלחת שליטת זיהום.
  7. לבצע את פרוטוקול הטיהור נבדק. בדוגמא זו, חזור על השלבים 6.3.1 ו6.3.2.
  8. לשטוף microplate סטרילי פעם אחת, ולאחר מכן להסיר ממכונת כביסה וחותם. זהו מבחן צלחת טיהור.
  9. צלחת 50 μl של שלב א 'יומן coli לצלחות טיטרציה; זה מראש infecצלחת שליטת tion.
  10. לפרוץ דרך מראש זיהום, זיהום וטיהור 96-גם צלחות ולהוסיפו של ע '100 μl coli בשלב צמיחת יומן-שלב לכל הבארות, באמצעות טיפים חדשים לכל אחד.
  11. לאטום ולדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות ב 200 סל"ד.
  12. צלחת 50 μl של תאים נגועים משלוש בארות של כל צלחת 96-גם לצלחות 2YT / פחמימות 10 סנטימטרים אקראיים ולדגור על 37 מעלות CO / N.
  13. העברת 50 μl של תאים נגועים מכל הבארות של כל צלחת לצלחות גם עמוקות המכילות 1 מיליליטר 2YT בתוספת 100 ג '/ מיליליטר carbenicillin לכל טוב ולגדול O / N על 37 מעלות צלזיוס.
  14. חזור על פרוטוקול הטיהור ולהשאיר את מכונת הכביסה קווי ייבוש.
    הערה: לא O צמיחה / N על צלחות או במדיום נוזלי יש לשים לב על צלחות שליטה מראש זיהום, שליטה מראש זיהום או מבחן טיהור. רבות מושבות וצמיחה צריכים להיות שנצפו על צלחת שליטת זיהום; אם לא, אין מסקנות לגבי היעילות שלפרוטוקול טיהור יכול להתבצע. באופן אידיאלי, צלחות הטיהור תניב שום מושבות ולא O צמיחה / N בכל אחת מהבארות בO / צלחות N. ההחמרה של פרוטוקול הטיהור יכולה להיות מוגברת עם ריכוזים גבוהים יותר אקונומיקה, יותר לספוג פעמים ומחזורים נוספים.

7. קלט / פלט titrations

7.1) titrations הפאג הקלט

  1. לדלל aliquot 5 μl של הפאג 50 μl עם PBS-מסונן סטרילי ומערבבים.
  2. הכן דילול של פי 10 סידורי בPBS-מסונן סטרילי עד 10 10 באמצעות פיפטה רבת-ערוצית או pipettor 96 ערוץ.
  3. לחסן 5 μl של הפאג מדולל בעד 45 μl של א 'T1 הפאג עמיד תאי coli ביומן-שלב של צמיחה (OD .6-.8) ודגירה מכוסה חותם נשימה למשך 30 דקות על 37 מעלות צלזיוס.
  4. 5 μl הצלחת של תאים נגועים ל/ צלחת אגר LB בתוספת 100 מיקרוגרם / מיליליטר carbenicillin דגירה O / NC ° 37 t.
  5. ריכוז הפאג ניתן להעריך מהמדגם לדלל ביותר שבו מופיעות מושבות על פי החישובים המפורטים בסעיף 2.8.

7.2) פלט הפאג Pitrations

  1. בעקבות elution של הפאג-מחויב צלחת על ידי התוספת של א ' coli תאים, לדלל aliquot 5 μl של תאים נגועים בהפאג 50 μl עם תקשורת 2YT autoclaved
  2. הכן דילול של פי 10 סידורי בתקשורת 2YT autoclaved 10 6 בעזרת פיפטה רבת-ערוצית או 96 pipettor ערוץ.
  3. צלחת 5 μl של תאים נגועים לצלחת אגר בתוספת 100 מיקרוגרם / מיליליטר carbenicillin דגירה O / N ב 37 מעלות צלזיוס.
  4. ריכוז הפאג ניתן להעריך מהמדגם לדלל ביותר שבו מופיעות מושבות על פי החישובים המפורטים בסעיף 2.8.
    הערה: בשני המקרים (כלומר, כתוביות קלט והפלט הפאג, (cel כולל השוואה עם מספרי מושבה בשני טטרציקליןמספר יב) וkanamycin (titre הפאג עוזר) יכולים גם להיות אינפורמטיבי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפרוטוקול המתואר במסמך זה נעשה שימוש כדי לבודד ברי נוגדנים למגוון רחב של תחומים שני אנטיגן structurally- והקשורים-תפקודי מספריות Fab קומבינטורית-מוצג הפאג במקביל. נושאים הקשורים לזמינות אנטיגן ניתן לעקוף, במקרים רבים, על ידי זיהוי בסיליקון ושל תחומים אנטיגן לבטאו שמתאימים לבחירת נוגדן 23. על ידי צימוד ביטוי אנטיגן לבחירת נוגדנים באותה המעבדה (איור 1) הוא הופך להיות אפשרי על מנת לבנות צינור משולב, שבו ניתן לשלוט בפרמטרי אנטיגן קריטיים לבחירה בקלות רבה יו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בעת ביצוע בבחירות נוגדן מבחנה, שני גורמים העיקריים להצלחה הם בחירת 1) הבידוד של מטרות אנטיגני מקופלות היטב לבחירה על ו -2) הזמינות של ספריית נוגדן גיוון תפקודית גבוהה. במקרים רבים, את הזמינות של כמויות מספיקות של מקופל היטב, חלבון באורך מלא יכולה להיות מגבילה. גישה אחת להתגברות על מגבלה זו היא להשתמש בתחומים שזוהו מניתוח bioinformatic 22 ומסונתזים להכנסה לתוך וקטור ביטוי חיידקים עם תג זיקה מתאים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

יש לי המחברים אין לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ברצוננו להודות NIH Common הקרן - תכנית ריאגנטים לכידת חלבון למימון פעילות הפיתוח של נוגדן בחירה ואפיון צינור רשת נוגדן רקומביננטי והקרן הקנדית לחדשנות לרכישת מימון של הפלטפורמה רובוטית הבחירה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
חומרים
ניו ברונסוויק Innova44 שייקר חממה הניתן לערוםEppendorfM1282-0004
ליקווידטור 96 ערוצים ידני מערכת פיפטינג ספסלAnachem LtdLIQ-96-200
שייקר מיקרופלייטVWR12620-926
ThermoScientific Sorvall ST-40 צנטריפוגה ספסלמוצרתרמו
ELx405 בחר מכונת כביסה מיקרופלייט באר עמוקהBiotekELX405USD
מותאם אישית תפוקה גבוהה אוטומטי בחירת פאג'ים רובוטS& P Robotics
צינור פלקון חרוטי מפלסטיק: 50 מ"לVWR21008-178
צינור פלקון חרוטי מפלסטיק: 15 מ"לVWR89039-668
Axygen 1.7 מ"ל צינורות מיקרוצנטריפוגהקורנינגMCT-175-L-C
96 בארות/384 בארות צלחת מקסיסורפסיגמאM9410-1CS
קורנינג 96 בארות V-תחתון עמוק באר בלוקCorning3960
Axygen Mini-tube 96 בארות מיקרופלייט סטרילי קופסה כחולהקורנינגAXY-MTS-06-C-R-S
סרט איטום צלחת דבק נושםVWR60941-084
ריאגנטים
שםמספרקטלוגי
גליקולביושופPEG800.1
תמצית שמריםביושופYEX401.1
ביו-טריפטוןביושופTRP402.1
NZ אמיןסיגמאC7290
גלוקוזסיגמאG8270-1KG
לקטוזביושופLAC234
גליצרולביושופGLY001.500
קרבניצילין ביושופCAR544.10
קנמיציןביושופKAN201.25
טטרציקלין ביושופTET701.25
Tween 20ביושופTWN510.500
מונו-בסיסי אשלגן פופטביושופPPM302.1
נתרן פוספט דו-בסיסיאנאכמיה84486-440
נתרן כלוריביושופSOD001.10
אשלגן כלוריביושופPOC308.1
סידן כלוריביושופCCL302.500
מגנזיום סולפטEMDMX0070-1
מגנזיום כלורידביושופMAG510.500
NH4ClAmresco0621-1KG
Na2SO4BioshopSOS513.500
agarBioshopAGR001.500
SybrSafe DNA כתם ג'לInvitrogenS33102
חומצה זרחתיתAcros Organics201140010
ליזוזיםBioshopLYS702.25
benzonaseNovagen71205
Triton X-100BioshopTRX506.500
קוקטייל מעכב פרוטאז טבליותRoche11 836 170 001
שרף Ni-NTA Qiagen1018240
1,000x פאג' עוזר (M13K07) מלאי (1013 פאג' למ"ל)NEBN0315S
HRP מצומד נוגדן ספציפי ל-M13 (anti-M13-HRP).GE Healthcare27-9241-01
מצע TMB: מערבבים נפחים שווים של TMB ו-H2O2 peroxidase substrate KPL50-76-00
dNTPsBiobasicDD0056
Taq polymeraseGenscriptE00007
ExonucleaseGE Healthcare EZ0073X-EZ
שרימפס פוספטאז אלקלייןHealthcareE70092Z-EZ
75004525 החברה פוליאתילן GE

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Winter, G., Milstein, C. Man-made antibodies. Nature. 349, 293-299 (1991).
  2. Miersch, S., Sidhu, S. S. Synthetic antibodies: concepts, potential and practical considerations. Methods. 57, 486-498 (2012).
  3. Schofield, D. J., et al. Application of phage display to high throughput antibody generation and characterization. Genome Biol. 8, R254(2007).
  4. Hust, M., et al. A human scFv antibody generation pipeline for proteome research. J. Biotechnol. 152, 159-170 (2011).
  5. Colwill, K., Graslund, S. A roadmap to generate renewable protein binders to the human proteome. Nat. Methods. 8, 551-558 (2011).
  6. Mersmann, M., et al. Towards proteome scale antibody selections using phage display. Nat. Biotechnol. 27, 118-128 (2010).
  7. Pershad, K., et al. Generating a panel of highly specific antibodies to 20 human SH2 domains by phage display. Protein Eng. Des. Sel. 23, 279-288 (2010).
  8. Turunen, L., Takkinen, K., Soderlund, H., Pulli, T. Automated panning and screening procedure on microplates for antibody generation from phage display libraries. J Biomol. Screen. 14, 282-293 (2009).
  9. Hughes, R. A., Miklos, A. E., Ellington, A. D. Gene synthesis: methods and applications. Methods Enzymol. 498, 277-309 (2011).
  10. Boersma, Y. L., Pluckthun, A. DARPins and other repeat protein scaffolds: advances in engineering and applications. 22, 849-857 (2011).
  11. Terpe, K. Overview of tag protein fusions: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems. Appl. Microbiol. Biotechnol. 60, 523-533 (2003).
  12. Lichty, J. J., Malecki, J. L., Agnew, H. D., Michelson-Horowitz, D. J., Tan, S. Comparison of affinity tags for protein purification. Protein Expr. Purif. 41, 98-105 (2005).
  13. Fellouse, F. A., et al. High-throughput generation of synthetic antibodies from highly functional minimalist phage-displayed libraries. J. Mol. Biol. 373, 924-940 (2007).
  14. Paduch, M., et al. Generating conformation-specific synthetic antibodies to trap proteins in selected functional states. Methods. 60, 3-14 (2013).
  15. Studier, F. W. Protein production by auto-induction in high density shaking cultures. Protein Expr. Purif. 41, 207-234 (2005).
  16. Huang, H., Sidhu, S. S. Studying binding specificities of peptide recognition modules by high-throughput phage display selections. Methods Mol. Biol. 781, 87-97 (2011).
  17. McLaughlin, M. E., Sidhu, S. S. Engineering and analysis of peptide-recognition domain specificities by phage display and deep Sequencing. Methods Enzymol. 523, 327-349 (2013).
  18. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).
  19. den Engelsman, J., et al. Strategies for the assessment of protein aggregates in pharmaceutical biotech product development. Pharm. Res. 28, 920-933 (2011).
  20. Lavinder, J. J., Hari, S. B., Sullivan, B. J., Magliery, T. J. High-throughput thermal scanning: a general, rapid dye-binding thermal shift screen for protein engineering. J. Am. Chem. Soc. 131, 3794-3795 (2009).
  21. Fellouse, F. A., Sidhu, S. S. Making antibodies in bacteria. in Making and Using Antibodies: A Practical Handbook. Howard, G. C., MR, K. aser , CRC Press. Boca Raton, Florida. 151-172 (2013).
  22. Acton, T. B., et al. Preparation of protein samples for NMR structure, function, and small-molecule screening studies. Methods in Enzymology. 483, 23-47 (2011).
  23. Mahon, C. M., et al. Comprehensive interrogation of a minimalist synthetic CDR-H3 library and its ability to generate antibodies with therapeutic potential. J. Mol. Biol. 425, 1712-1730 (2013).
  24. Persson, H., et al. CDR-H3 diversity is not required for antigen recognition by synthetic antibodies. J. Mol. Biol. 425, 803-811 (2013).
  25. Bradbury, A. R., Sidhu, S., Dubel, S., McCafferty, J. Beyond natural antibodies: the power of in vitro display technologies. Nat. Biotechnol. 29, 245-254 (2011).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

FabELISA

מאמרים קשורים