הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

העברת כלי דם ג'ין ממתכת סטנט משטחים באמצעות adenoviral וקטורי Tethered דרך Hydrolysable חוצה linkers

9.4K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/51653

⸱

12 באוגוסט 2014

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pediatrics, Division of Cardiology, The Children's Hospital of Philadelphia, University of Pennsylvania

במאמר זה

סיכום

מחקרים אלה מדווחים על הצמדה הפיכה של וקטורים של גנים אדנו-ויראלים למשטחי מתכת חסרי ציפוי של סטנטים ודיסקי רשת מודל. שחרור ממושך של חלקיקים נגיפיים בעלי יכולת התמרה המותנה בהידרוליזה של קישורים צולבים המשמשים לקיבוע וקטור מביא לביטוי טרנסגן עמיד ספציפי לאתר בתאי כלי דם ובעורקים סטנטים.

תקציר

ב- סטנט restenosis מציג סיבוך משמעותי של נהלי revascularization מבוסס סטנט בשימוש נרחב כדי להקים מחדש את זרימת דם דרך מגזרים הצטמצמו באופן ביקורתי של עורקים הכליליים ופריפריה. סטנטים Endovascular מסוגלים שחרור מתכונן של גנים עם פעילות אנטי restenotic עשוי להציג אסטרטגיה חלופית למשמשים כיום סטנטים משחררי תרופה. על מנת להגיע לתרגום קליני, סטנטים משחררי גן חייבים להפגין קינטיקה הצפויה של שחרור-משותק סטנט גן וקטור ותמרת אתר ספציפי של כלי דם, תוך הימנעות תגובה דלקתית מוגזמת בדרך כלל מזוהית עם ציפוי הפולימר המשמש ללכידתו הפיסית של הווקטור. מאמר זה מתאר מתודולוגיה מפורטת לקשירה בלי מקטורן של וקטורי גן adenoviral לסטנטים המבוססים על הפיך מחייב של חלקיקי adenoviral לpolyallylamine בביספוספונטים (PABT) -modified משטח נירוסטה באמצעות linkers חוצי hydrolysable (HC). משפחה שלHC bifunctional (amine- ותיאול-reactive) עם t ממוצע 1/2 של הידרוליזה אסתר בשרשרת הנעה בין 5 ל 50 ימים שמשו לקשר הווקטור עם סטנט. הליך קיבוע הווקטור מתבצע בדרך כלל אותה במסגרת 9 שעות ומורכבת מכמה שלבים: 1) דגירה של דגימות המתכת בתמיסה מימית של PABT (4 שעות); 2) deprotection של קבוצות תיאול מותקנות בPABT עם טריס (phosphine 2-carboxyethyl) (20 דקות); 3 הרחבה) של קיבולת תגובת תיאול של משטח המתכת על ידי מגיב דגימות עם polyethyleneimine derivatized עם pyridyldithio (קבוצות) PDT (2 שעות); 4) המרה של קבוצות PDT לthiols עם dithiothreitol (10 דקות); 5) שינוי של adenoviruses עם HC (1 שעות); 6) טיהור של חלקיקי adenoviral שונה על ידי כרומטוגרפיה גודל הדרת טור (15 דקות) ו7) קיבוע של חלקיקי adenoviral תיאול-reactive על פני השטח thiolated הפלדה (1 שעה). טכניקה זו יש תחולה פוטנציאלית רחבה מעבר לסטנטים,על ידי הקלת הנדסה של התקני bioprosthetic פני השטח כדי לשפר את ההתאמה הביולוגית שלהם באמצעות מסירת הגן בתיווך המצע לתאי ממשק החומר הזר שהושתל.

מבוא

היעילות של טיפול גנטי ככלים טיפוליים הקשתה על ידי יכולת המיקוד העני של וקטורי ריפוי גנטי 1,2. חוסר תוצאות מיקוד נכונים ברמות תת הטיפוליות של ביטוי transgene במיקום היעד ומוביל להפצה רחבה של וקטורים לאיברים שאינם יעד 3, כוללים אלה אחראים להרכבת תגובות חיסוניות נגד שני הווקטורים והמוצר טיפולי מקודד 4, 5. פוטנציאל אחד אמצעים כדי לקזז את ההפקרות של התמרה ולקדם מטרה היא להציג את וקטורי גן במיקום הרצוי בצורה שמונעת הפצה החופשית שלהם באמצעות דם והלימפה. בדרך כלל, מאמצים אלה מסתמכים על מערכות אספקה ​​בזריקות מקומית הכוללות גם וקטורים ויראליים או שאינם נגיפיים ונכללו עם מטריצות הפיברין, קולגן או חומצה היאלורונית הידרוג'ל 6-10 המסוגלים וקטורי גן זמני שמירה במקום ההזרקה ידי כולא ה פיזיתשלהם ברשת פולימרים.

עוד הפרדיגמה מקובלת לריפוי גנטי מקומי מנצלת חוסר תנועה של וקטורי גן על פני השטח של התקנים תותבים מושתלים 11,12. שתלים קבועים רפואיים (endovascular, הסימפונות, סטנטים אורולוגים ומערכת עיכול, קוצבי לב, מפרקים מלאכותיים, רשתות כירורגית וגינקולוגית, וכו '.) משמשים מדי שנה בעשרות מיליון חולים 13. בעוד בדרך כלל יעיל, מכשירים אלה נוטים לסיבוכים הכהלכה נשלטים על ידי נהלים רפואיים הנוכחיים 14-17. התקנים תותבים מושתלים נוכחיים הזדמנות ייחודית שתשמש כפלטפורמות proxy לטיפול ריפוי גנטי מקומי. מנקודת המבט הפרמקוקינטי, derivatization של שתלים רפואיים עם מינוני קלט נמוכים יחסית של תוצאות וקטורי גן בהשגת שני ריכוזים מקומיים גבוהים של וקטורי גן על שתל ממשק הרקמה / והאטת קינטיקה של thei המשטחחיסול r ממיקום זה. כתוצאה ממגורים ממושכים וספיגה מוגברים על ידי אוכלוסיית התאים הממוקדות, חוסר תנועת וקטור ממזערת התפשטות וקטור הגן. כך החיסון המכוון של רקמות שאינם יעד מצטמצם.

קשירת פני השטח של וקטורי גן בחומרים ביולוגיים להשתלה (המכונים גם כמסירת גן בתיווך מצע או מסירת גן שלב מוצק) יושמה בניסויי תרבות תא ושל בעלי חיים באמצעות שני ספציפי (אנטיגן הנוגדן 18-20, avidin ביוטין 21,22) ושאינו ספציפיים 23-26 (תשלום, ואן דר ואלס) אינטראקציות. הקובץ המצורף קוולנטיים של וקטורים על פני השטח של המכשיר המושתל כבר נחשב בעבר כאינו פונקציונלי מאז קשרים חזקים יתר על המידה עם המשטח מונעים הפנמת וקטור על ידי תאי מטרה. לאחרונה הודגם כי מגבלה זו ניתן להתגבר על ידי השימוש במקשר צולב באופן ספונטני hydrolysable משמש כטשלה בין המשטח המתכתי שונה של חלבוני סטנט וקפסיד של הווקטור adenoviral 27,28. יתר על כן, שיעור שחרור הווקטור וכמובן ביטוי transgene במבחנת in vivo זמן יכולים להיות מווסת עם השימוש בlinkers חוצי hydrolysable מציג קינטיקה שונה של הידרוליזה 28.

הנייר הנוכחי מספק פרוטוקול מפורט לקובץ המצורף קוולנטיים הפיך של וקטורי adenoviral למשטח מתכת מופעל ומציג הגדרת ניסוי שימושית לחקר אירועי התמרה שהתפתחו במבחנה בשריר חלק בתרבית ותאי האנדותל ובחי במודל התרדמה עכברוש של אנגיופלסטיקה סטנט .

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

.1 הכנת Adenovirus שכותרתו Cy3 לניסויי השחרור

  1. להשעות 2 x 10 12 חלקיקים של מודעות ריקות (כ -2 x 10 11 יחידות זיהומיות) ב650 μl של קרבונט / חיץ ביקרבונט (CBB; pH 9.3).
  2. ממיסים את התוכן של בקבוקון 1 (0.2 מ"ג) של צבע פלואורסצנטי אמין-reactive (Cy3 (NHS) 2) ב 1 מ"ל CBB לריכוז סופי של 0.2 מ"ג / מ"ל.
  3. הוספה של פתרון הצבע להשעיה וירוס, מערבולת 100 μl במשך 5 שניות ודגירת השעה 1 ב28 ° C עם הרעד (100-200 סל"ד).
  4. לאזן 20 עמודה מ"ל Sepharose 6B עם PBS. הוסף 750 μl של ירידה מבחינת השעיה מודעות שכותרתו Cy3 למרכז מיטת ג'ל.
  5. לאחר השעיה נגיפית מחלחלת השרף, להוסיף 5 מ"ל של PBS. מחק את eluate.
  6. הוסף 0.5 מ"ל של PBS ולאסוף את eluate במכל זכוכית שכותרתו. חזור על 10x שלב זה איסוף כולל של עשרה 0.5 מ"ל שברים.
  7. ה assayדואר נאסף שברים על ידי ספקטרופוטומטריה (260 ו280 ננומטר) לתוכן DNA נגיפי.
  8. בריכת השברים המכילים יותר מ 10% בסך הכל (סכום של F1 עד F10) צפיפות אופטית (OD) ב 260 ננומטר. הערה: בדרך כלל שברי F3, F4, F5, F6 והם אספו ומעורבים.
  9. Re-assay השברים נקוו מעורבים על ידי ספקטרופוטומטריה (260 ו280 ננומטר) וassay ידי fluorometry (550 לשעבר / 570 ננומטר) לתוכן DNA נגיפי וCy3 שכותרתו חלבון קפסיד, בהתאמה. הערה: עקומת כיול Cy3 (NHS) 2 מכסה את מגוון 10 -9 10- 13- mol / L מוכן וassayed fluorimetrically על אותה הצלחת כמו שברים ויקוו.
  10. לחשב את תשואת וירוס שכותרתו וצפיפות תיוג. תניח שחלקיקי 1.19 x 10 12 וירוס / מ"ל מתאים ליחידה 1 OD לאורך דרך 1 סנטימטר 29. השתמש בנוסחה: תשואה = [(/1.19)*10 סכום 260nm OD 12 * V / מודעות קלט] * 100, שבו, 260nm OD הוא דה האופטיnsity של הניסוח נקווה ב260 ננומטר וV הוא הנפח של הניסוח ונקווה (מ"ל) לחישוב תשואת התאוששות מודעה (%). השתמש בנוסחה: צפיפות תיוג = C * 6.02 * 10 23 / ​​(OD 260nm /1.19)*10 12, כאשר C הוא ריכוז Cy3 של הניסוח נקווה (/ שומות מ"ל) ו260nm OD הוא הצפיפות האופטית של הניסוח נקווה ב 260 ננומטר כדי לחשב את צפיפות תיוג Cy3 ממוצעת. הערה: התאוששות אופיינית של וירוס שכותרתו היא> 70% ממינון הקלט. צפיפות התיוג היא 600-800 מולקולות fluorophore לחלקיקי וירוס אחד.
  11. Aliquot Cy3 שכותרת מודעה ריקה לחלקים קטנים יותר (בדרך כלל 5 x 10 11 חלקיקים) מתאימים לניסויי שחרור האדם. הערה: פרוטוקול נוכחי מציין את השימוש במודעות שכותרתו Cy3 אך ורק בניסוי השחרור. כל מחקרי התמרה מתבצעים עם וקטורים שכותרתו אינו.

2 הפעלה של דוגמאות מתכת

  1. שטוף את ים אל חלדטיל רשת דיסקים או סטנטים נירוסטה ברציפות בisopropanol (5 דק 'x 2) וכלורופורם (5 דק' x 2) בשעה 55 ° C עם הרעד (100 סל"ד). הסר את הממס.
  2. מחממים את הדגימות למשך 30 דקות ב200 C °.
  3. לפזר בביספוספונטים polyallylamine עם תיאול קבוצות סמויות מותקנות (PABT 27,28,30) במים (1-2% w / v) בשעה 72 מעלות צלזיוס עם הרעד (100 סל"ד). כדי להתאים את pH 4.5-5 עם KHCO 3.
  4. דגירה דגימות מתכת בפתרון PABT ל2-4 שעות ב72 מעלות צלזיוס עם הרעד (100-200 סל"ד). הערה: ההליך עשוי להיות מושהה בשלב זה. הדגימות יציבות במשך 3 ימים ב 4 ° C..
  5. יש לשטוף את הדגימות שלוש פעמים עם מים מזוקקים פעמיים (DDW).
  6. לחשוף את הדגימות לטריס phosphine (2-carboxyethyl) (TCEP; 15 מ"ג / מ"ל ​​במאגר M 0.1 אצטית) ל15 דקות ב 28 ° C עם הרעד (100-200 סל"ד).
  7. יש לשטוף 5x בDDW degassed.
  8. לחשוף את הדגימות לpolyethyleneimine 2% עם קבוצות pyridyldithio מותקנות (PEI PDT 27,28,30) בDDW degassed באווירת ארגון לשעה 2 ב 28 מעלות צלזיוס עם (סל"ד רועד 100-200). הערה: ההליך עשוי להיות מושהה בשלב זה. הדגימות יציבות במשך 2 שבועות ב 4 ° C..
  9. יש לשטוף את הדגימות שלוש פעמים עם DDW.
  10. לחשוף את הדגימות ל10 מ"ג / מ"ל ​​dithiothreitol / DDW להמיר קבוצות pyridyldithio לthiols.
  11. יש לשטוף 5x שוב בDDW degassed.

.3 Adenovirus הפעלה וקיבוע משטח מתכת

  1. להשעות 5 x 10 11 חלקיקים של שני eGFP מודעות או מודעות לוק (כ 5 x 10 10 יחידות זיהומיות) ב487.5-495 μl של קרבונט / חיץ ביקרבונט (CBB; pH 9.3). הערה: מחקרי השחרור, להשתמש 5 x 10 11 של Cy3 שכותרתו חלקיקים ריקים מודעה (להתאים את עוצמת קול ל487.5-495 μl עם CBB).
  2. לפזר HC עם משתנה שיעורי הידרוליזה [28 (במהירות (t 1/2 = 5 ד), intermediately (t 1 /2 = 12 ד) ולאט לאט HC (t ד 1/2 = 50), כלומר RHC, IHC או SHC; איור 1] או צולב מקשר שאינו hydrolysable (NHC), sulfo-LC-SPDP בCBB ב20 מ"מ.
  3. מייד להוסיף 5-12.5 μl של פתרון צולב מקשר להשעית הווירוס להיקף כולל של 500 μl (ריכוז סופי 200-500 מיקרומטר של צולב מקשר), מערבולת ודגירה במשך שעה 1 ב28 ° C עם הרעד (100- 200 סל"ד).
  4. לאזן 20 עמודה מ"ל Sepharose 6B עם degassed 5 מ"מ EDTA / PBS (EPBS). הוספת dropwise 500 μl של ההשעיה Ad-הותאם צולב מקשר למרכז מיטת השרף.
  5. הוסף 5 מ"ל של EPBS degassed. מחק את eluate.
  6. הוסף 0.5 מ"ל של EPBS degassed ולאסוף את eluate במכל זכוכית שכותרתו. חזור על פעולה זו פעמים 10 איסוף כולל של עשרה ברים 0.5 מ"ל.
  7. לקבוע OD של שברים שנאספו באמצעות ספקטרופוטומטריה ב260 ו280 ננומטר ולהמיר OD לtiters וירוס (1.19 x 10 12 / מ"ל Corresponds לOD 1) 29.
  8. בריכה שהברים המכילים> 10% מוירוס eluted (שים לב: בדרך כלל, שברי F3-F6). חזור על assay כייל spectrophotometric להשעיה ותקווה.
  9. העבר את ההשעיה נגיפית לבקבוקון עם דגימות מתכת פעילה (כמו לכל 2.11). דגירה באווירת ארגון לשעת 1 ב28 ° C עם הרעד (100-200 סל"ד). הערה: דגימות מתכת Ad-קשור שהושגו בשלב זה נמצא בשימוש נוספת בניסויי שחרור ותמרה שלאחר מכן מתוארים בסעיפי הפרוטוקול 5-7.

.4 כימות של וקטור Ad-קשורים פני שטח על ידי PCR

  1. הכן רשתות גיבשו עם-משותק משטח מודעת eGFP קשור באמצעות NHC, SHC, IHC וRHC (n = 3 עבור כל סוג) כמפורט בסעיפים 2 ו -3.
  2. השתמש בערכת QIAamp DNA Micro לבודד DNA הנגיפי. הנח את רשתות בנפרד לתוך צינורות פלסטיק 1.5 מ"ל מכילים 200 μl של תערובת מורכבת מ180 μl של ATL בuffer ו20 μl של K proteinase (שניהם מהערכה). להוסיף כמות ידועה של חלקיקי המודעות eGFP (כסטנדרטים לעקומת הכיול) לתוך הצינורות נפרדים המכילים את אותה התערובת. לדגור על 56 מעלות צלזיוס למשך הלילה בלי לרעוד.
  3. הוסף 200 μl של חיץ AL (מהערכה), מערבב על ידי vortexing, להוסיף 200 μl של 100% אתנול, ו דגירה בטמפרטורת חדר למשך 5 דקות.
  4. מעבירים את התערובת מצינור אחד על עמודה בודדת MinElite (מהערכה) וספין ב8,000 סל"ד דקות 1. יש לשטוף את הצינורות המכיל רשת עם 180 μl של חיץ ALT הטרי, להוסיף על עמודות וספין בהתאמה ב8,000 סל"ד דקות 1. מחק את eluates.
  5. הוסף 500 μl של חיץ AW1 (מהערכה) לתוך העמודים וספין ב8,000 סל"ד דקות 1. מחק את eluates.
  6. הוסף 500 μl של חיץ AW2 (מהערכה) לתוך העמודים וספין ב8,000 סל"ד דקות 1.
  7. מחק את eluates.
  8. ספין ב14,000 סל"ד במשך 3 דקות נוספות until העמודות יבשות לחלוטין. מחק את eluates.
  9. הוסף 50 μl מים כיתה MilliQ לעמודות. ספין ב14,000 סל"ד במשך 5 דקות. לאסוף 50 μl של eluate מכל עמודה לתוך צינור איסוף בודד (מהערכה).
  10. הכן פתרון PCR מיקס מאסטר על ידי שילוב מתרבה של (12.5 μl הבא של הכוח Sybr הירוק PCR מיקס מאסטר, 0.63 μl של 10 פריימר תחושת מיקרומטר eGFP [ACG TAA ACG GCC ACA AGT TC -3 '5'-], 0.63 μl של 10 פריימר מיקרומטר eGFP אנטי תחושה [5'- AAG TCG TGC TGC TTC ATG TG -3 '], 6.3 μl מים כיתה MilliQ). הכפל כרכים אלה במספר תגובות מתוכננות לרבות בקרות "אין DNA".
  11. עומס 5 μl של מודעות eGFP DNA (משלב 4.8) ו20 μl של PCR מיקס מאסטר לתוך בארות שלושה עותקים של צלחת תגובת MicroAmp אופטית 96 היטב. חותם את הצלחת עם MicroAmp אופטי דבק קולנוע. ספין הצלחת ב 1,000 סל"ד 1 דקות לחסל בועות אוויר.
  12. מניחים את הצלחת לתוך כלי הקיבול של מנוע PCR 7500 בזמן אמת. בתפריט הראשי של מערכת SDS תוכנת 7500 (v1.4 ומעלה) בחר באפשרות "צור ניסוי חדש". לחץ על "הבא". במסך "אשף ניסוי חדש" לבחור Sybr ירוק מתפריט גלילה, ולחץ על "הוסף". לחץ על "הבא" כדי לקבל פריסה של הצלחת. סמן את כל הבארות להיות מנותחות, בחר Sybr ירוק. סמן ברציפות אין בארות שליטת DNA, סטנדרטים DNA מודעות eGFP ונעלם, ולסמן אותם באמצעות כינויים המתאימים מתפריט הגלילה.
  13. לעבור ללשונית המכשיר. בחר באפשרות "להוסיף שלב ניתוק", לשנות את עוצמת הקול גם מברירת המחדל 50 μl ל25 μl. לחץ על התחל.
  14. לנתח את התוצאות באמצעות PCR לאחר בדיקת סיכום QC לחריגים ואי סדרים אחרים.

.5 שחרור קינטיקה של Hydrolysable חלקיקי וקטור-קשור מקשר צלב מדגם פלדת Mesh

  1. שטוף את דגימות רשת derivatized עם מודעות שכותרתו Cy3 באמצעות RHC, IHC, SHC וNHC (לפי 3.9) בBSA% 1 / (hr x 1 3) PBS עם הרעד (100-200 סל"ד).
  2. באמצעות מלקחיים עדינים סטריליים, למקם את רשתות לתוך בארות בודדות של צלחת 96 היטב prefilled עם 200 μl של חיץ elution (BSA 0.1% / 0.1% Tween-20 / PBS).
  3. קח את תמונות ניאון של חלק מכל רשת מרכזי. רשום את ההגדרות של מיקרוסקופ ומצלמת CCD המשמשת לרכישת תמונה.
  4. Assay צלחת fluorimetrically (550 לשעבר / 570) במצב סריקה היטב עם צמצום מרבי. השתמש בבארות עם רשתות שאינן derivatized כביקורת רקע.
  5. דגירה את הצלחת על 37 מעלות צלזיוס עם הרעד (50 סל"ד).
  6. בזמנים שנקבעו מראש (טווח 1-30 ימים) לשאוב חיץ elution מבלי להפריע רשתות ולהוסיף 200 μl של חיץ elution הטרי. חזור על שלבים 4.3-4.5 לאחר החלפת החיץ.

.6 התמרה של התרבית Cells על ידי וקטורי מודעות משותקים-Mesh

  1. שטוף את eGFP המודעות - או מודעות לוק -derivatized רשתות שלוש פעמים עם PBS סטרילי במשך 5 דקות עם הרעד (100 סל"ד).
  2. בעזרת מלקחיים סטריליות בסדר להסיר את דיסקי רשת אחד אחד ובנפרד להכניס אותם לתוך הבארות של צלחת 96 היטב עם סוג התא של עניין בשלב היומן של צמיחה.
  3. דגירה התאים ל24 שעות על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.
  4. השתמש בassay המתאים שאינו מסוף הקצה (מיקרוסקופ פלואורסצנטי, fluorometry לeGFP או הדמיה פליטת אור ללוציפראז) כדי לקבוע את הפריסה המרחבית של ביטוי גנים בבארות המידה ו.
  5. לחלופין, מדיום תחליף לPBS כדי להגביר את הרגישות של assay fluorometry (485/535 ננומטר) אם ביטוי נמוך eGFP צפוי. הערה: אם fluorometer מצויד ביכולת סריקה היטב, לקרוא את הצלחת במצב סריקה היטב להעריך את הפריסה המרחבית של eGFP להביע תאים בבארות. Exchange PBS עבור בינוני לאחר שסיים fluorometry.
  6. תמונת תאי transduced בבארות עם רשתות המודעות eGFP -eluting (שניהם בסיסי ופריפרית הרשת) באמצעות מערכת סינון FITC. קח את תמונות נציג ב40-200X הגדלה. רשום את ההגדרות של מיקרוסקופ פלואורסצנטי ומצלמת CCD המשמשת לרכישה של תמונות המדויקות.
  7. הוסף 5 μl של מניית וציפרין בPBS (10 מ"ג / מ"ל) ישירות לבארות עם -eluting מודעות לוק משתלב לריכוז סופי של 500 מיקרוגרם / מ"ל ו לדגור על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 עבור 10 דקות לפני הדמיה פליטת אור . תקשורת לשאוב ולהחליף ללא מדיה וציפרין לאחר הדמיה.
  8. מבחני נקודות קצה חזרו בזמנים שנקבעו מראש (עד 2 שבועות) כדי ללמוד את קינטיקה של ביטוי גן הכתב הבא העברת גנים בתיווך מצע.

.7 אישור של קיבולת התמרה משומר במושהות נקודות זמן

  1. הכן את מודעות eGFP דהרשתות rivatized באמצעות RHC, IHC, SHC וNHC לקשירת וקטור (לפי 2.1-2.11 ו3.1-3.9) ובנפרד למקם את רשתות בבארות של צלחת 96 היטב עם תאי 60-80% ומחוברות שור אב העורקים אנדותל (BAEC ).
  2. לנתח התמרה של BAEC התרבותי עם-משותק רשת Ad eGFP בימים 1 ו 2 מיקום הודעה רשת, באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי וfluorometry (לפי 6.4-6.5).
  3. 48 שעות לאחר תחילתו של התמרה לשטוף את הבארות המכילה רשת עם PBS פעמיים.
  4. הוסף 200 μl של 0.25 טריפסין% / EDTA היטב כל אחד ודגירה במשך 15 דקות על 37 מעלות צלזיוס עם הרעד (100 סל"ד). 3x לשטוף עם PBS.
  5. השתמש במיקרוסקופ וfluorometry ניאון כדי לוודא הסרת כל תאי eGFP חיובי הקשורים לרשתות שלמות.
  6. זרע טרי passaged BAEC לתוך הבארות עם רשתות שוחררו באופן חלקי ב60-80% צפיפות זריעה ראשונית (2-2.7 x 10 4 תאים / טוב).
  7. דגירה את הצלחת על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 לתקופות קבועות מראש של זמן (1-10 יום) לפני ההערכה של אירועי התמרה על ידי מיקרוסקופ וfluorometry ניאון "חדשים".

.8 סטנט פריסה בדגם תרדמת העכברוש של סטנט אנגיופלסטיקה-משחררי מודעות

  1. נהלי כל החיה שתוארו בפרוטוקול זה לעמוד בתקנות הפדרליות על שימוש בבעלי חיים במעבדה ואושרו על ידי IACUC של בית החולים לילדים של פילדלפיה. לדבוק בתנאים כירורגית ספטית כל המכשירים הם מעוקרים החיטוי. כדי להבטיח סטריליות רציפה מעקר את חרוז מועסק בין שימוש במכשירים בעד חמישה בעלי חיים ברציפות.
  2. הכן מודעות לוק -eluting סטנטים לפי 2.1-2.11 ו3.1-3.9. אחסן את סטנטים derivatized הווירוס בסטרילי PBS ב 4 מעלות צלזיוס למשך לא יותר מ24 שעות לפני השימוש.
  3. הרדימי חולדות זכרי ספראג-Dawley (400-450 גר ') עם הזרקת IP של קטמין (100 מ"ג / קילוגרם), וxylazine (5 מ"ג / קילוגרם). Determine עומק ההרדמה על ידי תגובת קמצוץ כפה וטונוס שרירים. החל משחה וטרינר עיניים כדי למנוע יובש של קרנית ולובן עין. הערה: ההרדמה משאיפת עם 4% וisoflurane 2% (1 ליטר / דקה) לגרימה ושמירה על הרדמה, בהתאמה, היא אפשרית, אבל פוגעת בגישה חופשית לאזור צווארו של בעל החיים, ולכן אינו מומלצת למשתמשים לא מנוסים.
  4. להעריך מחדש את עומק ההרדמה על ידי קמצוץ הבוהן. להתגלח וצוואר הכנת הסביבה נקיה מחיידקים ואזור חזה עליון. לנהל אנטיביוטיקה (Cefazolin; 20 מ"ג / קילוגרם; IM), משכך כאבים (meloxicam; 0.5 מ"ג / קילוגרם; SC) ומלוח (10 מ"ל / קילוגרם; SC). לצנתר את וריד הזנב עם קטטר G 24 ולנהל הפרין (200 IU / קילוגרם; IV). הערה: במינון של enrofloxacin 10 מ"ג / קילוגרם (IM) (Baytril) יכול לשמש במקום Cefazolin. הימנע משימוש באנטיביוטיקה חסרת פעילות משמעותית נגד חיידקים גראם חיוביים. 10-15 מ"ג / קילוגרם carprofen (Rimadyl) עשוי לשמש במקום meloxicam כמשכך כאבים מקדים. משככי כאבים נרקוטיים (ה.g., מורפיום, עצירות) יש להימנע בגלל התכונות מדכאות-הנשימה שלהם.
  5. בצע חתך קו האמצע דרך fascia העור והצוואר. השתמש בטכניקות לנתיחה בוטות כדי לבודד את עורק תרדמה החיצוני משמאל. לקשור את עורק התרדמה החיצוני באתר הנגיש הדיסטלי ביותר. החל מייתר זמני הזזה למוצא של עורק התרדמה הפנימי.
  6. לעשות חתך arteriotomy 2 מ"מ בעורק התרדמה החיצוני משמאל.
  7. הכנס קטטר פוגארטי 2-צרפתי לתוך עורק התרדמה המשותף דרך החתך בעורק התרדמה החיצוני. לנפח את קצה הצנתר עם מי מלח ולהעביר 3x מקשת אב העורקים להסתעפות התרדמה כדי לערטל האנדותל.
  8. להחליק חתיכת הצינור (1.04 מ"מ OD, ID 0.99 מ"מ) על קטטר פוגארטי ולתוך עורק התרדמה המשותף. למשוך את צנתר פוגרטי.
  9. הר וcrimp לוק מודעות -derivatized סטנט על הבלון של 1.5קטטר אנגיופלסטיקה קוטר מ"מ. הכנס את הסטנט דרך צינורות הטפלון ולקדם אותו לאמצע הקטע של עורק התרדמה המשותף. הימנע משפשוף סטנט על קיר הצינור או כלי שיט.
  10. לפרוס את הסטנט ב12 כספומט ל30 שניות ולמשוך את צנתר אנגיופלסטיקה.
  11. לקשור את הפרוקסימלי של עורק תרדמה החיצונית לאתר arteriotomy ולשחרר את המייתר הזמני בעורק התרדמה הפנימי.
  12. לתקן את פצע הניתוח בשכבות עם ריצת 4.0 תפר Vicryl ולהדק את העור.
  13. לשחזר את החיה על כרית חימום עד אמבולטורי ולחזור לכלוב המבודד שלה. אמנם אין סימנים של כאב או אי נוחות מוצגים בדרך כלל על ידי בעלי החיים שלאחר הניתוח מעבר ל12 שעות הראשונות שלאחר ההליך, לשקול הארכת טיפול meloxicam (0.5 מ"ג / קילוגרם, SC יומי) ל72 שעה.

.9 פליטת אור הדמיה של ביטוי העורקים ג'ין

  1. בנקודות זמן קבועות מראש (יום 1 - 3טווח שבועות) לאחר פריסת סטנט משחררי גן בעורק התרדמה המשותפת, להרדים את העכברוש בהרדמה isoflurane משאיפת (isoflurane 2-4% בחמצן).
  2. הסר את הסיכות כירורגי, סביבה נקיה מחיידקים להכין את האתר ולפתוח מחדש את הפצע הניתוחי. באמצעות גישה לנתיחה, מחדש רווח בוטה לעורק תרדמה המשותף השמאל ולהפריד אותו מהעצב התועה ורקמות חיבור סמוכות.
  3. הכן תערובת של 50 מ"ג / מ"ל ​​Luciferin בPBS ו25% Pluronic F-127 ב PBS (1: 4 V / V) ולאחסן אותו על קרח. הערה: ניסוח זה מציג כפתרון צמיג על 4 מעלות צלזיוס ומייד פונה לג'ל במגע עם רקמות על 37 מעלות צלזיוס.
  4. החל 200 μl של / תערובת Pluronic Luciferin מצוננת ישירות למגזר החשוף של עורק התרדמה המשותף ולאמת מוצקות ג'ל.
  5. מניחים את החיה במצב שכיבה בחדר ההדמיה של מנגנון IVIS-Spectrum ולשמור על הרדמה isoflurane עם מסכת פנים.
  6. בacquisitiבחלון לוח בקרה (חיים תמונה, גרסת 4.2 או גבוהים יותר) לבחור את "B" העמדה (מצלמה 6.6 סנטימטר להתנגד מרחק) וbinning "בינוני" גורם מהתפריטים הנפתח שכותרתו "שדה הראייה" ו" binning ", בהתאמה. הקלד "2.5 סנטימטר" בתיבת גובה הנושא. בחר "דק" כיחידת זמן בתיבה "זמן חשיפה", ולבחור ערך מספרי של "2".
  7. שלוש דקות לאחר היישום של / ג'ל Pluronic Luciferin, להתחיל רכישת תמונה על ידי לחיצה על הכפתור "רכישה" על המסך. הערה: זמן רכישת תמונה יכול להשתנות בין 1 ל 6 דקות בהתאם לעוצמת האות הצפויה.
  8. לאחר שרכש את התמונה, לשטוף את הג'ל את עם מי מלח ומורח את חלל periarterial עם החלת מגזה וצמר גפן סטרילי.
  9. לסגור את הפצע עם תפר Vicryl ולהדק את העור.
  10. לשחזר את בעלי החיים ולחזור לכלוב שלה. הדמיה חוזרת ב t מאוחר יותרנקודות IME ללמוד את מהלך הזמן של ביטוי עורקים הביא על ידי וקטורי Ad-משותק סטנט.
  11. לחלופין, לבצע הדמיה הבאה ממשל מערכתי של וציפרין. הרדימי ומכין את בעל החיים כמו לכל 9.1-9.2. לצנתר את וריד הזנב עם קטטר 24 G וקטטר המאובטח עם קלטת כירורגית.
  12. הכן פתרון של וציפרין בPBS (50 מ"ג / מ"ל) ולהזריק 1 מ"ל של הפתרון באמצעות קטטר מעל מרווח 10 שניות. דקות אחד לאחר ההזרקה להתחיל רכישת תמונה לפי 9.7-9.8. הערה: שיעור הזרקה מהיר יותר (<10 שניות) יכול לעורר פעילות התקפים ודום נשימה. בעלי החיים חייבים להיות מורדמים אם התקפים או דום נשימה להתרחש במהלך הדמיה.
  13. בצע צעד 9.10.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

ניסויי שחרור וקטור

קשירה של וקטורי adenoviral אל פני השטח של שתלים, כולל מכשירים התערבותית כגון סטנטים endovascular, קרובה לווקטור לאתר המחלה, באופן חלקי מייתרת את חוסר המיקוד הפיזי "הווקטורים. עם זאת, כדי להיות מסוגל להשיג את ההשפעות טיפוליות באמצעות התמרה של רקמת המטרה, הווקטור חייב להשתחרר מהשטח (איור 2). השימוש בlinkers הצולב hydrolysable השערה לאפשר 1, שתלים) קובץ מצורף...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

הפרוטוקול המובא מתאר את שיטה תפעולית למסירת גן מצע תיווך המושגת באמצעות קובץ מצורף הפיך של וקטורי adenoviral לבלי מקטורן משטחי נירוסטה. בעוד שפותח לצורך הספציפי של טיפול גנטי מבוסס סטנט של היצרות כלי דם, טכניקה זו יש יישומים רחבים הרבה יותר בתחומים של חומרים ביולוגיים, שתלים ביו וריפוי גנטי.

למרות שמחקרים שהוצגו לי אך ורק בשימוש נירוסטה כמצע מתכת טיפוסי, PABT נקשר סגסוגות מתכת אחרות כגון קובלט / כרום וניטינ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

פיתוח פרוטוקולים ומחקרים שהוצגו במאמר זה נתמכו בחלקם על ידי מענקי פיתוח מדענים של איגוד הלב האמריקאי (I.F. 0735110N ו-M.C. 10SDG4020003), מענק המכון הלאומי ללב, ריאות ודם של ארה"ב HL 72108 (R.J.L.), והמכון הלאומי ללב, ריאות ודם T32 007915 (S.P.F). צנתרי אנגיופלסטיקה נתרמו באדיבות על ידי NuMED (הופקינטון, ניו יורק). המחברים מבקשים להודות לסיוע המזכירות של גב' סוזן קרנס.

תודות

למחברים אין אינטרסים פיננסיים מתחרים לחשוף.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
316 דיסקי רשת נירוסטהElecton Microscopy SciencesE200-SS
גנרי 304 סטנטים מנירוסטה בדרגהLaserageמותאמת אישית
AdeGFPאוניברסיטת פנסילבניה Vector CoreAD-5-PV0504
AdLucאוניברסיטת פנסילבניה Vector CoreAD-5-PV1028
AdEMPTYאוניברסיטת פנסילבניה Vector CoreA858
Cy3(NHS)2GE HealthcarePA23000
Sepharose 6BSigma-Aldrich6B100-500ML
UV 96-well לוחותCostar3635
פלואורומטריה 96 בארותצלחות Costar3915
תרבית תאים צלחות 96 בארותFalcon353072
Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP)Pierce Thermo Scientific20490
Dithiothreitol (DTT)Pierce Thermo Scientific20290
sulfo-LC-SPDPPierce Thermo Scientific21650
ספקטרופוטומטרהתקנים מולקולריים SpectraMax 190
ספקטרופלואורומטרמכשירים מולקולרייםSpectraMax Gemini EM
אינקובטור שייקר אורביטליVWR1575R
תנור זרימת אוויר אופקיShel Lab1350 FM
Centra-CL2 צנטריפוגה חברת ציוד בינלאומית426
מערבל מערבולת דיגיטליפישר תרמו סיינטיפיק02-215-370
אקליפס TE300 מיקרוסקופ פלואורסצנטיניקון מצלמת CCD TE300
DC 500LeicaDC-500
7500 מערכת PCR בזמן אמתApplied Biosystemsלא זמין
תחנת ביולומינסנציה ספקטרום IVISפרקינס-אלמרלא זמין
מלח דיפוטסיום EDTAסיגמא-אולדריץ'ED2P
סרום בקר אלבומין שבר V (BSA)פישר תרמו סיינטיפיקBP1600-100
Tween-20Sigma-AldrichP1379
מלקחיים של DumontFine Science Tools11255-20
A10 קו תאים ATCCCRL-1476
תאי אנדותל אבי העורקים של בקרLonzaBW-6002
לוציפרין, מלח אשלגןזהב ביוטכנולוגיהLUCK-1Ge
פלורוניק F-127סיגמא-אולדריץ'P2443-250G
PBS ללא סידן ומגנזיוםGibco14190-136
סרום בקר עובריGemini Bio-Products100-106
תמיסת פניצילין/סטרפטומיציןGibco11540-122
DMEM, גלוקוז גבוהCorning cellgro10-013-CV
0.25% טריפסין/EDTAGibco25200-056
QIAamp DNA מיקרו קיטQiagen56304
Power Sybr Green PCR Master MixApplied Biosystems4367659
מיקרו אמפר אופטי 96 בארות צלחת תגובהמיושמת ביו-מערכות N8010560
מיקרו-אמפר סרט דבק אופטיביו-מערכות יישומיות4360954
Cephazolin אפוטקסלא זמין
לוקסיקום (מלוקסיקם)נורברוקלא זמין
הפרין נתרןAPP תרופותלא זמינות
קטבט (קטמין)VEDCOלא זמין
Anased (קסילזין) לואידאינו זמין
פוראן (איזופלורן) בקסטרלא זמין
מלקחיים מעוקלים של קשתית מוריהכלי מדע עדינים11370-31
מלקחיים מעוקלים עדינים במיוחד של Graefeכלי מדע עדינים11152-10
Dumont #5 מלקחייםכלי מדע עדינים11252-20
מספריים קפיציים של Vannasכלי מדע עדינים15018-10
מספריים עדינים - ToughCutFine ScienceTools 14058-09
מספריים כירורגייםכלי מדע עדינים14101-14
תפר ויקריל (5-0)EthiconJ385
(משי 4/0) Fine Science Tools18020-40
קליפס תפר מישלFine ScienceTools 12040-02
מרחיב פצעים (ספקולת עיניים של לנקסטר)KLS Martin34-149-07
מעקר חרוזים חמיםFine Science Tools18000-45
מוליך קליפ תפר מישלFine Science Tools112028-12
Insyte Autoguard 24 G IV קטטרבקטון-דיקינסון381412
2F קטטר פוגרטיאדוארדס מדעי החיים120602F
צינורות טפלוןVention041100BST
קטטר PTANuMedמותאמת אישית
רפידות גזהקנדל הלת'9024
אפליקטורים כותנהWOD1003סולון
מזרק בקסטר281321
10 מ"ל (Luer-Lok)Beckton-Dickinson309604
1 מ"ל (Luer-Lok)Beckton-Dickinson309628
Clippers עם להב #40Oster 78005-314
סרט כירורגי Transpore3MMM 15271
משחה וטרינרית PuralubePharmadermאינו זמין
הזמנה חוט תפר הזמנה ייצור מזרק

מקורות

  1. Boeckle, S., Wagner, E. Optimizing targeted gene delivery: chemical modification of viral vectors and synthesis of artificial virus vector systems. AAPS J. 8, E731-E742 (2006).
  2. Waehler, R., Russell, S. J., Curiel, D. T. Engineering targeted viral vectors for gene therapy. Nat Rev Genet. 8, 573-587 (2007).
  3. Campos, S. K., Barry, M. A. Current advances and future challenges in Adenoviral vector biology and targeting. Curr Gene Ther. 7, 189-204 (2007).
  4. Bangari, D. S., Mittal, S. K. Current strategies and future directions for eluding adenoviral vector immunity. Curr Gene Ther. 6, 215-226 (2006).
  5. Barry, M. A., et al. Systemic delivery of therapeutic viruses. Curr Opin Mol Ther. 11, 411-420 (2009).
  6. De Laporte, L., Shea, L. D. Matrices and scaffolds for DNA delivery in tissue engineering. Adv Drug Deliv Rev. 59, 292-307 (2007).
  7. Gustafson, J. A., Price, R. A., Greish, K., Cappello, J., Ghandehari, H. Silk-elastin-like hydrogel improves the safety of adenovirus-mediated gene-directed enzyme-prodrug therapy. Mol Pharm. 7, 1050-1056 (2010).
  8. Kidd, M. E., Shin, S., Shea, L. D. Fibrin hydrogels for lentiviral gene delivery in vitro and in vivo. J Control Release. 157, 80-85 (2012).
  9. Lei, Y., et al. Incorporation of active DNA/cationic polymer polyplexes into hydrogel scaffolds. Biomaterials. 31, 9106-9116 (2010).
  10. Lei, Y., Rahim, M., Ng, Q., Segura, T. Hyaluronic acid and fibrin hydrogels with concentrated DNA/PEI polyplexes for local gene delivery. J Control Release. 153, 255-261 (2011).
  11. Jang, J. H., Schaffer, D. V., Shea, L. D. Engineering biomaterial systems to enhance viral vector gene delivery. Mol Ther. 19, 1407-1415 (2011).
  12. Salvay, D. M., Zelivyanskaya, M., Shea, L. D. Gene delivery by surface immobilization of plasmid to tissue-engineering scaffolds. Gene Ther. 17, 1134-1141 (2010).
  13. Moss, A. J., Hamburger, S., Moore, R. M., Jeng, L. L., Vol Howie, L. J. Advance Data. 191, National Center for Health Statistics Vital and Health Statistics. (1991).
  14. Gristina, A. G., Naylor, P., Myrvik, Q. Infections from biomaterials and implants: a race for the surface). Med Prog Technol. 14, 205-224 (1988).
  15. Santerre, J. P., Woodhouse, K., Laroche, G., Labow, R. S. Understanding the biodegradation of polyurethanes: from classical implants to tissue engineering materials. Biomaterials. 26, 7457-7470 (2005).
  16. Tang, L., Eaton, J. W. Inflammatory responses to biomaterials. Am J Clin Pathol. 103, 466-471 (1995).
  17. Zimmerli, W., Sendi, P. Pathogenesis of implant-associated infection: the role of the host. Semin Immunopathol. 33, 295-306 (2011).
  18. Fishbein, I., et al. Bisphosphonate-mediated gene vector delivery from the metal surfaces of stents. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 159-164 (2006).
  19. Levy, R. J., et al. Localized adenovirus gene delivery using antiviral IgG complexation. Gene Ther. 8, 659-667 (2001).
  20. Ma, G., et al. Anchoring of self-assembled plasmid DNA/anti-DNA antibody/cationic lipid micelles on bisphosphonate-modified stent for cardiovascular gene delivery. Int J Nanomedicine. 8, 1029-1035 (2013).
  21. Hu, W. W., Lang, M. W., Krebsbach, P. H. Development of adenovirus immobilization strategies for in situ gene therapy. J Gene Med. 10, 1102-1112 (2008).
  22. Jang, J. H., et al. Surface immobilization of hexa-histidine-tagged adeno-associated viral vectors for localized gene delivery. Gene Ther. 17, 1384-1389 (2010).
  23. Bengali, Z., Shea, L. D. Gene Delivery by Immobilization to Cell-Adhesive Substrates. MRS Bull. 30, 659-662 (2005).
  24. Holmes, C. A., Tabrizian, M. Substrate-mediated gene delivery from glycol-chitosan/hyaluronic acid polyelectrolyte multilayer films. ACS Appl Mater Interfaces. 5, 524-531 (2013).
  25. Pannier, A. K., Wieland, J. A., Shea, L. D. Surface polyethylene glycol enhances substrate-mediated gene delivery by nonspecifically immobilized complexes. Acta Biomater. 4, 26-39 (2008).
  26. Wang, C. H., Pun, S. H. Substrate-mediated nucleic acid delivery from self-assembled monolayers. Trends Biotechnol. 29, 119-126 (2011).
  27. Fishbein, I., et al. Local delivery of gene vectors from bare-metal stents by use of a biodegradable synthetic complex inhibits in-stent restenosis in rat carotid arteries. Circulation. 117, 2096-2103 (2008).
  28. Fishbein, I., et al. Adenoviral vector tethering to metal surfaces via hydrolyzable cross-linkers for the modulation of vector release and transduction. Biomaterials. 34, 6938-6948 (2013).
  29. Mittereder, N., March, K. L., Trapnell, B. C. Evaluation of the concentration and bioactivity of adenovirus vectors for gene therapy. J. Virol. 70, 7498-7509 (1996).
  30. Forbes, S. P., et al. Modulation of NO and ROS production by AdiNOS transduced vascular cells through supplementation with L-Arg and BH4: Implications for gene therapy of restenosis. Atherosclerosis. 230, 23-32 (2013).
  31. Niinomi, M., Nakai, M., Hieda, J. Development of new metallic alloys for biomedical applications. Acta Biomater. 8, 3888-3903 (2012).
  32. Brito, L. A., Chandrasekhar, S., Little, S. R., Amiji, M. M. Non-viral eNOS gene delivery and transfection with stents for the treatment of restenosis. Biomed Eng Online. 9, 56(2010).
  33. Egashira, K., et al. Local delivery of anti-monocyte chemoattractant protein-1 by gene-eluting stents attenuates in-stent stenosis in rabbits and monkeys. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 27, 2563-2568 (2007).
  34. Ohtani, K., et al. Stent-based local delivery of nuclear factor-kappaB decoy attenuates in-stent restenosis in hypercholesterolemic rabbits. Circulation. 114, 2773-2779 (2006).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

Sprague Dawley
העברת כלי דם ג'ין ממתכת סטנט משטחים באמצעות adenoviral וקטורי Tethered דרך Hydrolysable חוצה linkers
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.