הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

במשובט מעקב vivo של גזע hematopoietic ובתאים המסומנים על ידי חמישה חלבונים ניאון באמצעות Confocal וmultiphoton מיקרוסקופית

12.9K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/51669

⸱

6 באוגוסט 2014

 ,  , 
1Light Microscopy Core Facility, NHLBI/NIH, 2Hematology Branch, NHLBI/NIH

במאמר זה

הודעת תיקון

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

סיכום

5 חלבוני ניאון קומבינטורית סימון של תאי גזע ואבות היווצרות הדם מאפשר במעקב משובט vivo באמצעות confocal ושני פוטונים במיקרוסקופ, מתן תובנות ארכיטקטורת hematopoietic מח העצם במהלך רגנרציה. שיטה זו מאפשרת מיפוי גורל לא פולשנית של תאים נגזרים HSPCs ספקטרלי מקודדים ברקמות שלמות לתקופות נרחבות של זמן לאחר השתלה.

תקציר

פיתחנו ומאומתים ניאון סימון המתודולוגיה למעקב משובט של תאי גזע hematopoietic ואב (HSPCs) עם רזולוציה מרחב ובזמן גבוהה ללמוד בhematopoiesis vivo תוך שימוש במודל ניסיוני להשתלת מח העצם עכברי. קומבינטורית גנטי סימון באמצעות וקטורי lentiviral קידוד חלבוני ניאון (fps) אפשר מיפוי גורל תא באמצעות הדמיה מיקרוסקופית מתקדמת. וקטורי קידוד חמישה FPS שונה: Cerulean, EGFP, ונוס, tdTomato, וmCherry שמשו לtransduce מקביל HSPCs, יצירת צבעים מגוונים של תאי צבע מסומן. הדמיה באמצעות מיקרוסקופ ההיברידי confocal / שני פוטונים מאפשרת הערכה בו זמנית ברזולוציה גבוהה של תאים מסומנים באופן ייחודי וצאצאיהם בשיתוף עם רכיבים מבניים של הרקמות. נפח ניתוחים על פני שטחים גדולים מגלה כי ניתן לאתר תאים נגזרים HSPC מקודדים ספקטרלי הלא פולשני ברקמות שלמות שונות, כוללים מח העצם (BM), לתקופות נרחבות של זמן לאחר השתלה. מחקרים חיים שילוב multiphoton וידאו שער והזמן לשגות הדמיה confocal ב4D להדגים את האפשרות של מעקב סלולארי ומשובט דינמי באופן כמותי.

מבוא

ייצור תאי דם, hematopoiesis מכונה, מתוחזק על ידי אוכלוסייה קטנה של תאי גזע hematopoietic ואב (HSPCs). תאים אלה נמצאים בתוך מח העצם (BM) בנישה microenvironmental מורכבת הכוללת אוסטאובלסטים, תאי סטרומה, רקמת שומן, ומבנים של כלי דם, כל מעורבים בשליטה של התחדשות עצמית ובידול 1,2. כBM שלם באופן מסורתי נגיש לתצפיות ישירות, יחסי הגומלין בין HSPC וmicroenvironment שלהם נשארים uncharacterized במידה רבה in vivo. בעבר, הקמנו מתודולוגיה לדמיין את ארכיטקטורת 3D של BM שלם באמצעות הקרינה confocal והשתקפות מיקרוסקופיה 3. אנו מתאפיינים הרחבת HSPCs המסומן EGFP בBM, אבל השימוש רק FP יחיד מנע ניתוח של התחדשות ברמה משובט. מאוד לאחרונה אנו ניצלנו את lentiviral ג'ין אונטולוגיה (לגו) וקטורים constitutively להביע flחלבוני uorescent (FPS) כדי לסמן ביעילות תאים 4,5. Co-התמרה של HSPC עם 3 או 5 וקטורים יוצרת צבעים מגוונים של צבעים קומבינטורית, המאפשר מעקב של שיבוטים HSPC בודדים מרובים.

שילוב HSPC המסומן בטכנולוגיית הדמיה חדשה רשאית להתחקות ביות HSPC פרט וקליטתם בBM של עכברים המוקרנים. וקטורים לגו שמשו כדי לסמן HSPC עם 3 או 5 fps שונה (מCerulean, eGFP, ונוס, tdTomato, וmCherry) ובצעו את קליטתם שלהם לאורך הזמן בBM על ידי מיקרוסקופ confocal ו2 פוטונים, המאפשרים הדמיה ברורה של עצם ואחר מבני מטריצה, ואת הקשר של שיבוטים HSPC לרכיבים של microenvironment. HSPC היו מטוהר כתאי שושלת שליליים מC57Bl / 6 עכברים BM, transduced עם וקטורים לגו, וreinfused על ידי הזרקה לוריד זנב לעכברי congenic-מלוטש myelo. על ידי מעקב אחר כמויות גדולות של רקמת עצם החזה BM אנו דמיינו engraftment endosteal מתרחש בתחילתהתחדשות BM. צבירי תאים עם ספקטרום צבעים מגוון הופיעו בתחילה בסמוך לעצם והתקדם באופן מרכזי על פני זמן. מעניין, אחרי יותר מ 3 שבועות מח מורכב מאשכולות משובטים מאקרוסקופי, המצביע על התפשטות hematopoiesis נגזר מHSPCs הבודד בסמיכות במוח, ולא הפצה נרחבת של HSPCs באמצעות זרם הדם. היה גיוון צבע פחות בנקודות זמן מאוחרות, המצביע על הקושי בtransducing לטווח ארוך אכלוס מחדש תאים עם וקטורים מרובים.

בנוסף, HSPCs נוצר אשכולות בטחול, איבר אחראי גם על hematopoiesis בעכברים. תאים בודדים המופק HPSC יכולים להיפתר בבלוטת התימוס, בלוטות לימפה, טחול, כבד, ריאות, לב, עור, שרירי שלד, רקמת שומן, וכליות, כמו גם. ניתן להעריך תמונות 3D איכותית וכמותית להעריך את חלוקת תאים עם הפרעות מינימליות של הרקמות. לבסוף, אנו מדגימיםד ההיתכנות של מחקרים דינמיים חיים ב4D על ידי שילוב של multiphoton סריקת תהודה וזמן לשגות הדמיה confocal. מתודולוגיה זו מאפשרת רזולוציה גבוהה שאינו פולשנית, רב ממדית מעקב תא גורלם של אוכלוסיות תאים מסומנות ספקטרלי באדריכלות 3D שלמה שלהם, מתן כלי רב עוצמה במחקר של התחדשות ופתולוגיה רקמה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל העכברים שוכנו ויטופלו בהתאם למדריך לטיפול והשימוש בחי מעבדה של המכון הלאומי לבריאות, ונרשם בפרוטוקול שאושר בועדת טיפול ושימוש בבעלי חיים NHLBI. נקבה B6.SJL-Ptprc (ד) Pep3 (ב) / BoyJ (B6.SJL) וC57Bl / 6 עכברים, 6-12 שבועות, שמשו כתורם למקבל, בהתאמה.

רשימה של חומרים, חומרים כימיים, וציוד מסופקת בטבלה 1.

.1 לגו התמרה של עכבר HSPCs והשתלת מח עצם

בצע את ההליכים מתוארים להלן בקבינט (מכסה המנוע בתרבית רקמה) רמת בטיחות ביולוגית מוסמכת 2 (BSL-2).

  1. ייצור של לגו וקטורי קידוד 5fps
    1. השתמש בlentiviral "ג'ין אונטולוגיה" (לגו) פלסמידים וקטור, כל קידוד FP שונה מאמרגן חזק מכונן SFFV, כוללים לגו-Cer2 (Cerulean), לגו-G2 (EGFP), לגו-V2 (ונוס), לגו-T2 (TdTomato), והגו-C2 (mCherry) סיפק באדיבות על ידי ד"ר בוריס Fehse (אוניברסיטת המרכז הרפואי Hamburg-אפנדורף, המבורג, גרמניה); עכשיו זמין גם מAddgene 5-7.
    2. כדי לייצר וקטורים לגו, זרע 5 x 10 6 293T תאים ב10 מנות סנטימטר (להשתמש 12 מנות לכל וקטור) 24 שעות לפני transfection ב8 מ"ל של תקשורת I10 (IMDM השלים עם FCS 10% וגלוטמין / פניצילין / סטרפטומיצין).
    3. Transfect תאים עם פוספט סידן באמצעות המלצות ערכת CAPHOS שונה מעט:
      1. עבור כל וקטור תמהיל צלחת 15 מיקרוגרם לגו, 12 מיקרוגרם pCDNA3.HIVgag / pol.4xCTE, 4 מיקרוגרם קודם-TAT, ו1 מיקרוגרם פלסמידים pMD2.G-VSV-G בנוכחות של 50 μl 2.5 M CaCl 2, ומוסיף מים עד ל תניב נפח כולל 500 μl.
      2. פלסמידים המשקע DNA עם 500 μl של 2x HeBS (HEPES שנאגרו מלוח) ו דגירה של 20 דקות בטמפרטורת חדר לפני הוספה לכל צלחת של תאי 293T.
      3. דגירה תאים עבור6 שעות ב5% 37 מעלות צלזיוס חממת CO 2; להסיר תקשורת ולהוסיף הודעה hr transfection תרבות תקשורת 6 הטרי.
    4. לאסוף supernatants התרבות המכיל חלקיקי lentiviral מכל צלחת, יומי, במשך 3 ימים. כל אוסף supernatant למחרת להוסיף מדיה I10 טרי לכל צלחת.
      1. לסנן דרך 0.22 מיקרומטר נקבוביות, בריכה ולהתרכז supernatants ידי ultracentrifugation על הרוטור SW28 לשעה 2 ב 71,900 XG ו4 ° C..
      2. Resuspend supernatants ב1 מ"ל של תקשורת StemSpan. Aliquot מניות lentiviral ב200 μl ולאחסן ב -80 מעלות צלזיוס.
  2. טיטרציה של lentiviral חלקיקים
    לקבוע את כייל של חלקיקי וקטור לגו בsupernatants נאסף באמצעות לכמת transducing יחידות מ"ל / שימוש בתאי NIH3T3. Titers לאפשר חישוב הנפח של כל supernatant וקטור הדרוש כדי לגרום לריבוי היחסי הרצוי של זיהום (משרד הפנים) ליעד ניסויתאים.
    1. צלחת 5 x 10 4 NIH3T3 תאים לכל טוב (12 גם צלחת) ב2 מ"ל של תקשורת I10 יום אחד לפני טיטרציה.
    2. הכן דילולים סידוריים פי 5 של supernatants וקטור בתקשורת I10 תוספת סולפט protamine (4 מ"ג / מ"ל ​​הוא 1,000x).
    3. הסר את המדיה מהתאים, ולהחליף עם 500 μl של דילולים supernatant המכילים את המקבילה של 2, 0.8, 0.32, ו0.128 μl של נגיף מרוכז.
    4. לקבוע את המספר (לא) של תאים נוכחים לכל גם בעת התמרה, ספירת שליטה אחד גם.
    5. 6 שעות לאחר התמרה, להוסיף 2 מ"ל של תקשורת I10 ודגירה במשך 3 ימים על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.
    6. קציר התאים מכל גם באמצעות טריפסין-EDTA, ולקבוע את אחוז תאי ניאון (% FP) באמצעות cytometry זרימה.
    7. חשב את כייל כדלקמן, בממוצע titers התקבל לכל היטב (דילול) וכתוצאה מכך FP% בין 1% ו50: כייל (מ"ל / חלקיקי וקטור) = לאx% FP / עוצמת קול של supernatant וקטור (מ"ל). ממוצע titers התקבל לכל דילול אם FP% הוא בין 1% ו50.
  3. אוסף נייד עכבר, טיהור, התמרה, והשתלה (סכמטי שמוצגת באיור 1 א מותאם מMalide et al. 4).
    1. להקריב את עכברי תורם על ידי נוהל שאושר. מח עצם קציר מגפיים קדמי ואחוריים: לנתח humeri, עצמות ירך וtibias, ביסודיות להסיר את כל השרירים, רצועות ורקמות עודפות מעצמות, חצה את סופו של כל עצם קרוב ככל האפשר למפרק, ולשטוף את מח העצם מתוך העצם באמצעות מחט G 27-0 במזרק המכיל תקשורת I10.
    2. גלולה כל התאים במח עצם עבור 10 דקות ב XG 500, 4 ° C וlyse תאים אדומים פעמיים עם 50 מ"ל חיץ ACK. תאים גלולים ב10 מ"ל תקשורת I10.
    3. לטהר שלילי שושלת תאי אב (Lin-) עם ערכת דלדול שושלת MACS לפי protoco ערכה שונהl:
      1. השתמש 30 μl של microbeads אנטי ביוטין במקום 10 μl / 10 7 תאים; השלם את שלבי כביסה עם תקשורת I2 (IMDM בתוספת 2% FCS) במקום חיץ.
      2. הכנס צעד כביסה אחת בין הדגירה עם קוקטייל ביוטין-נוגדן והדגירה עם Anti-ביוטין microbeads; ולאזן את העמודה עם I10 במקום חיץ.
    4. תאי Lin- תרבות ל48 שעות בצפיפות התחלה של 5 x 10 5 תאים / מ"ל בתקשורת StemSpan תוספת 10 ng / IL-3 מ"ל העכברי, 100 ng / ml העכברי IL-11, 100 ng / ml האנושי Flt-3 ליגנד, ו50 ng / גורם תאי גזע עכברי מ"ל.
    5. העברת 1 עד 4 x 10 5 תאים ל12 גם צלחות מצופות RetroNectin וtransduce עם supernatants לגו, כל אחד בריבוי של זיהום (משרד הפנים) של 6-7 כדי להשיג 50% יעילות ביטוי לכל FP, בנוכחות StemSpan תקשורת וציטוקינים שפורטו לעיל ו4 מיקרוגרם / סולפט protamine מ"ל.
    6. Transduce תאיםעם כל וקטור לגו בנפרד כמתואר בשלב 1.3.5 ולערבב תאים הבאים התמרה (שמכונה Mix) או עמיתים לtransduce תאים עם כל supernatants הווקטור 5 לגו בו זמנית (שמכונה Co). הסרת תאים 24 שעות מאוחר יותר, לשטוף פעם עם תקשורת StemSpan ללא ציטוקינים, וresuspend אותם בתקשורת StemSpan ללא ציטוקינים להשתלה, או להעביר אותם לתקשורת טריות עם ציטוקינים, ותרבות ל96 שעות נוספות לפני מיקרוסקופיה confocal וcytometry זרימה.
      1. לבצע השתלת מח עצם על ידי יציקת transduced Lin- HSPCs באמצעות הזרקה לוריד זנב למקבלי 11 מנה אחת Gy מראש מוקרנים-(6-18 שעות לפני השתלה) נמענים, בהיקף של 100 μl, במינון תא לכל עכבר המתאים ל1 תאי -4 x 10 5 Lin- מצופה במקור לתמרה. בכל ניסוי, השתלת עוקבה שלמה של בעלי חיים עם אותה האוכלוסייה של תאי BM תורם transduced.
      2. לאפיון במבחנה של H transducedהחברות הייעודיות, תרבות התאים ל4-5 ימים נוספים בStemSpan השלימו עם ציטוקינים ולנתח על ידי cytometry זרימה ליעילות התמרה, ועל ידי מיקרוסקופ לגיוון צבע.
        1. להקריב את העכברים בודדים ולאחזור רקמות ואיברים להדמיה, בשעה שונות מצביעה עד 120 ימים לאחר השתלה.
          1. תרסיס עם אתנול הפרווה של העכבר ולחתוך את העור בצד הגחון הימנעות הפצת שיער.
          2. לנתח ובלו על פי נהלים קבועים בטחול, בלוטות לימפה popliteal, ריאות, לב, עור, רקמת שומן, שריר שלד, בכליות, בכבד, כמו גם את הראש לגישה לcalvaria.
          3. לחלופין, להשתמש calvaria או להגדיר חלון עצם הדמיה לחיות שוב ושוב לאורך זמן 2,8,9 או איברים שטחיים תמונה כגון בלוטות העור ולימפה בחי.
        2. מניחים איברים בודדים במנות תרבות מכסה זכוכית מספר 0 35 מ"מ ב50-10056; l PBS להדמיה אותם בשלמות ללא חתך, קיבעון או עיבוד נוסף כמתואר בשלב 2.5.
        3. הדמיה נפח, לשמור על האיברים בPBS הקר עד לשימוש. הדמיה זמן לשגות פנו מייד להדמית איברים בDMEM, 10 FBS% מכיל 20 HEPES מ"מ ב 37 מעלות צלזיוס

מיקרוסקופית 2 Confocal ושני פוטונים וניתוח תמונה

  1. לבצע הדמיה מיקרוסקופית באמצעות מערכת confocal חמישה ערוצים וmultiphoton Leica SP5 מצויד בקו רב ארגון, ננומטר 561 דיודה, ננומטר HeNe 594, וHeNe לייזרים גלויים 633 ננומטר. השתמש במצב 2 פוטונים, femtosecond פעמו טי: ספיר לייזר (Ti-Sa), מתכונן לעירור מ680 ננומטר 1,080 עם תיקון פיזור. השתמש בניסויים הכוללים אדום העביר FPS (tdTomato וmCherry), מתנד פרמטרים אופטיים (OPO) לייזר להארכת טווח אורכי גל הפלט ככל 1,030-1,300 ננומטר, ברצף או בו זמנית עם tהוא לייזר Ti-Sa.
  2. רקמות שונות תמונה באמצעות HCX-IRAPO-L 25X / 0.95 אובייקטיבי NA טבילה במים (WD = 2.5 מ"מ),-PLAPO-HC CS / 0.70 אובייקטיבי 20X NA יבש (WD = 0.6 מ"מ), או HC-PL-IRAPO 40X /1.1 מטרת טבילה במי NA (WD = 0.6 מ"מ).
  3. לקבל ספקטרום הקרינה confocal איסוף ערימות מבדה (xyλ) של אור הנפלט ב5 ננומטר-רוחבי פס של הספקטרום הנראה מתאי BM transduced עם וקטור FP לגו בודד כמו גם של שליטה, לא-מושתל BM.
    1. תמונות תהליך עם תוכנת v2.4.1 Leica LAS-AF כדי ליצור ספקטרום התייחסות של כל 5 FPS כמו גם של autofluorescence (איור 2 א). שימוש בספקטרום FP הבודד וההבדל בבהירות הקרינה (מבוטא% מEGFP) של Cerulean (79%), ונוס (156%), tdTomato (283%) וmCherry (47%) להגדיר 5 ערוצי הדמיה רציפים כדלקמן: Cerulean (458/468-482 ננומטר), EGFP (488/496-514 ננומטר), ונוס (514/523-558 ננומטר), tdTomato (561/579-597 ננומטר), וmCherry (594/618-670 ננומטר) ( איור 2).
    2. לאמת הפרדת FPS מדויקת, כמו התאים transduced עם כל FP פרט גלויים רק בערוץ המקביל ונעדר מהשאר (איור 2 ג). בנוסף, גישה מרובות ערוצים מוגדרים זה יוצרת 5 ערוצים ייחודיים "colorprint" המאפשר ניתוח צבע שלאחר מכן ומעקב משובט ויש את היתרון של הפחתת פעמים רכישה בהשוואה להדמיה של רוח רפאים.
  4. פליטת הקרינה נפרדת, במצב 2 פוטונים, על ידי יעילות גבוהה מראות dichroic המותאם אישית ולאסוף עם ארבעה ערוצים שאינם descanned גלאי (NDD) באופן הבא: מראה dichroic ב568 ננומטר ואחריו מראה dichroic ב465 ננומטר, ואחריו 452/45 מסנן פליטת ננומטר לSHG או autofluorescence וCerulean, מסנן 525/40 ננומטר פליטה לEGFP או ונוס, ומראה dichroic 648 ננומטר ו620 / 60 ננומטר מסנן פליטה לtdTomato או mCherry.
    1. לחשוף מידע מבני על ידי i מיקרוסקופ שני פוטוניםהדמיה ניגוד ntrinsic (כמתואר לעיל) של autofluorescence רקמות מאלסטין, NADH, (נרגש ב780 ננומטר), והרמוני שני שנוצרו אות (SHG) מקולגן העצם ופיברילציה (נרגשת ב920 ננומטר או 860 ננומטר שנאסף במפוזר גב כיוון) 10,11.
  5. עבור נפח 3D טיוח, לאסוף סדרה של תמונות xyz (בדרך כלל גודל voxel 1 x 1 x 4 מיקרומטר 3) לאורך ציר z ב5 מיקרומטר מרווחים על פני טווח של מעמקים (150-300 מיקרומטר) בכל רחבי מוח העצם ורקמות אחרות, על פני אזורים גדולים באמצעות פונקצית האריח של התוכנה כדי ליצור באופן אוטומטי כרכי רקמה של הכוללים את כל fossae עצם החזה, כ 2.5 x 1.2 מ"מ 2 (XY) ו300 מיקרומטר (z) (2D-2E דמויות) ו1 סרט.
    1. תמונת calvarial מח ישירות דרך הגולגולת ללא חתך 2, 8.
    2. עצם החזה סעיף לאורך המישור הסגיטלי (ביתור) ולאחר מכןtransversally במפרק בין 2 sternal פוסי ותדמית באמצעות פניה לחתוך 3,4,12 (הסקירה באיור 1 ב מותאם מTakaku et al 3).
  6. הדמיה הזמן לשגות 4D, מקום טרי נכרתה בלוטה לימפה, טחול, ריאות popliteal, או דגימות עצם calvarial נימולה על מנות תרבות מספר 0 coverglass 35 מ"מ, ב50-100 μl DMEM, 10% FBS המכיל 20 HEPES מ"מ ב 37 מעלות צלזיוס ולהשתמש 2 פוטון עירור Ti-Sa (860 ננומטר) בשילוב עם עירור confocal (458 ננומטר, 488 ננומטר, 514 ננומטר, 561 ננומטר, 594 ננומטר) וסורק תהודה לייקה (8000 הרץ / sec), לוקח z-ערימות (~ 80 מיקרומטר) בשעה 20 מרווחי שניות לשעה עד 1.
    1. לשימוש הדמיה 2P שלושה צבעים בו זמנית Ti-Sa מכוון ב860 ננומטר בו זמנית עם לייזר OPO (מכוון ב1,130 ננומטר לtdTomato; או 1,140 ננומטר mCherry) (סרט 2).
  7. שיקום וניתוח של כרכי 3D ורצפי זמן 4D
    1. השתמש softw Imaris x64הם גרסת 7.6, או חבילות תוכנה חלופיות להפוך את הרעפים ערימות של תמונות גלם לשניתנו נפח (3D) נתונים של תאי ניאון בתוך מח עצם ורקמות שונות ולייצא אותם כסרטי 3D-סיבוב, כפי שתואר בעבר 3,4 (סרט 1) שלב אחר שלב דוגמא:
      1. בImaris, פתח את תמונת z-הערימה; בחר באפשרות "לעלות" על מנת להציג את ההדמיה נפח 3D.
      2. השתמש "לנווט" להגביר את עוצמת הקול בסביבת 360 °.
      3. בחר "אנימציה" כדי ליצור אנימציה; משתמש במסגרות מפתח כדי להוסיף צפיות נבחרו, הזום, סיבובים של הנפח; בתצוגה מקדימה של הסרט, לערוך את צורך ולשמור את הקובץ בפורמט רצוי סרט (לשעבר: avi, mov).
    2. להערכה כמותית של תדירות תא ושיבוט 3D, עמדות, הגדלים והפצה, תהליך נוסף z-הערימות באמצעות מודולים Imaris XT המשלבים יישומי MATLAB ביצוע שקילת משקל הג מרחקurements (באמצעות אלגוריתם שינוי מרחק) ואשכולות ניתוח, כפי שתואר לעיל 3,4. להפוך את הרצפים של ערימות תמונה לאורך זמן לסרטים שניתנו נפח ארבעת ממדים (4D) עם תוכנת x64 Imaris, ולהשתמש בנקודה וניתוח שטח למעקב semiautomated של תנועתיות תא בשלושה ממדים באמצעות אלגוריתמי תנועת אוטורגרסיה.
    3. לבצע ניתוח multispectral של תאים באופן הבא: לחלץ את הצבע רב כתמים שכותרתו על ידי הוספת כל 5 הערוצים באמצעות חשבון ערוץ של Imaris XT לערוץ חדש; לקבוע עבור כל הנקודות (תאים) את הקרינה בעוצמה הממוצעת בכל אחד מ5 ערוצי הרכיב. לייצא את הערכים בתוכנת Excel לעלילת גרפים המציגים את "colorprint" הייחודי כלומר% יחסי של כל FP בתא בודד (גרף איור 2E). לתקן את הנתונים שנקבעו לנדידת רקמה, ולחשב תא מהירות ותזוזה לאורך זמן, אורכי מסלול, שבילים, ומרחקים; ערכי יצוא בExcel תוכנה עבור מtware לתכנן גרפים. להרכיב דמויות מורכבות עם תוכנת Adobe Photoshop CSS 5.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

ההר-כל confocal 3D שחזורי מיקרוסקופיה / 2 פוטונים של קורס זמן מח עצם sternal חשף את הקליטה ולהרחבה של שיתוף 5fps המושתל בתבנית עם מאפיינים ראויים לציון: שיבוטים הופיעו מסומנים בצורה ברורה, מסומן homogenously עם פלטה רחבה של צבעים בתחילה והתקדמות לאורך זמן כדי להכיל באופן מועדף תאים של בעיקר בצבע אחד. התקנת מיקרוסקופיה confocal ודוגמאות מייצגות של HSPC המסומן 5fps הדמיה במוח עצם sternal הן באיור 2 וסרטים 1 ו -2.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

אנו מתארים כאן את הפרטים של מתודולוגיה חזקה המציאה לאחרונה למעקב תא משובט, המשלבים את המגוון הגדול שנוצר על ידי קומבינטורית סימון עם וקטורי קידוד-5FP לגו והדמיה עם confocal טנדם ומיקרוסקופיה 2 פוטונים כדי להשיג נפח והדמיה דינמית ברקמות חיות. זו הרחיבה את השימוש בצבע המבוסס על FP סימון על ידי הקלטת זהות רפאים confocal ב5 ערוצים 8 סיביות "ברורים". כך היחס היחסי של Cerulean, EGFP, ונוס, tdTomato, mCherry בתוך כל תא יוצר "colorprint" ייחודי לזיהוי צאצאים משובטים. ת...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים שום אינטרסים כלכליים מתחרים.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי תוכנית המחקר התוך-כיתתית של מכון הלב, הריאות והדם הלאומי של המכונים הלאומיים לבריאות. אנו מודים לבוריס פהסה (המרכז הרפואי האוניברסיטאי המבורג-אפנדורף, המבורג, גרמניה) על אספקת חמשת הפלסמידים הווקטוריים של LeGO; כריסטיאן א. קומבס וניל ס. יאנג (NHLBI, NIH) על דיונים, תמיכה ועידוד לאורך מחקר זה, ואנדרה לה-רושל (NHLBI, NIH) על סיוע בהזרקות לווריד הזנב.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
<ייצור חזק>של וירוסים
LeGO-Cer2Addgene27338ביטוי של Cerulean
LeGO-G2Addgene25917ביטוי של eGFP
LeGO-V2Addgene27340ביטוי של Venus
LeGO-T2Addgene27342ביטוי של tdTomato
LeGO-C2Addgene27339ביטוי של mCherry
Calciumm Phosphate Transfection KitSigmaCAPHOS-1KT
צלחת תרבית רקמותBD Falcon353003
IMDMGibco, Life Technology12440-053
סרום בקר עוברי מושבת בחוםSigmaF4135-500ML
עט סטרפטוקוקוס גלוטמיןGibco, חיים טכנולוגיה10378-016
צינורות צנטריפוגהבקמן קולטר326823
SW28 אולטרה-צנטריפוגהבקמן קולטרL60
Millex מסנן מונע מזרק Unite (0.22 & micro; m)MilliporeSLGS033SS
<חזק>איסוף תאי עכבר, טיהור, התמרה והשתלה
ACK מאגר ליסינגאיכות ביולוגית בע"מ.118-156-101
ערכת דלדול תאי שושלת (עכבר)Miltenyi Biotec Inc. ארה"ב130-090-858
עמודות LS + צינורותMiltenyi Biotec Inc. ארה"ב130-041-306
מסנני הפרדה מראש (30 ומיקרו; m)Miltenyi Biotec Inc. ארה"ב130-041-407
מדיום נטול סרום StemSpan SFEM לתרבית והרחבה של תאים המטופויאטיים (500 מ"ל)StemCell Technologies Inc 9650
עכברים IL-11 CFמו"פ & די סיסטמס בע"מ418-ML-025/CF100 ומיקרו; גרם/מ"ל הוא פי 1,000
עכברים רקומביננטיים SCFRDI חטיבת פיצג'רלד תעשיות בינלאומיות RDI-2503100 ומיקרו; גרם/מ"ל הוא 2,000x
עכברים רקומביננטיים IL-3מו"פ & די סיסטמס בע"מ403-ML-05020 ומיקרו; גרם/מ"ל הוא 2,000x
FLT-3 LigandMiltenyi Biotec Inc. ארה"ב130-096-480100 ומיקרו; גרם/מ"ל הוא צלחות 1,000x
12 בארות, CostarCorning Inc.3527
RetronectinTakara Bio IncT100A/Bהשעיה ב-50 ומיקרו; גרם/מ"ל
פרוטמין סולפטסיגמאP-40204 ומיקרו; g/ml הוא 1,000x
Confocal and Two-photon Microscopy
DMEMLonza12-614F
1 M HepesCellgro, Mediatech Inc.25-060-CI
צלחת תרבית תחתונה מזכוכית P35G-0-20-CMatTek CorporationP35G-0-20-C
צלחת תרבות תחתונה מזכוכית P35G-0-14-CMatTek CorporationP35G-0-14-C
Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass #1 Borosilicate Coverglass; 4 בארותThermo Scientific155383
Coverslips 22 מ"מ מס' 2תומאס סיינטיפיק6662-Q55
Leica TCS SP5 AOBS מיקרוסקופ קונפוקלי ורב-פוטוני חמישה ערוציםLeica Microsystems
Chameleon Vision II -TiSaph טווח לייזר 680-1,080 ננומטרקוהרנטי
זיקית קומפקטית טווח לייזר OPO 1,030-1,350 ננומטרקוהרנטי
HCX-IRAPO-L 25X/0.95 NA מטרת טבילה במים (WD=2.5 מ"מ)Leica Microsystems
HC-PLAPO-CS 20X/0.70 NA אובייקט יבש (WD=0.6 מ"מ)Leica Microsystems
HC-PL-IRAPO 40X/1.1 NA מטרת טבילה במים (WD=0.6 מ"מ)Leica Microsystems
תוכנת Imaris גרסה 7.6Bitplane

מקורות

  1. Lo Celso,, C,, Scadden, D. T. The haematopoietic stem cell niche at a glance. J Cell Sci. 124, 3529-3535 (2011).
  2. Lo Celso, C., et al. Live-animal tracking of individual haematopoietic stem/progenitor cells in their niche. Nature. 457, 92-96 (2009).
  3. Takaku, T., et al. Hematopoiesis in 3 dimensions human and murine bone marrow architecture visualized by confocal microscopy. Blood. 116, e41-e55 (2010).
  4. Malide, D., Metais, J. Y., Dunbar, C. E. Dynamic clonal analysis of murine hematopoietic stem and progenitor cells marked by 5 fluorescent proteins using confocal and multiphoton microscopy. Blood. 120, e105-e116 (2012).
  5. Weber, K., Mock, U., Petrowitz, B., Bartsch, U., Fehse, B. Lentiviral gene ontology (LeGO) vectors equipped with novel drug-selectable fluorescent proteins new building blocks for cell marking and multi-gene analysis. Gene Ther. 17, 511-520 (2010).
  6. Weber, K., Bartsch, U., Stocking, C., Fehse, B. A multicolor panel of novel lentiviral 'gene ontology' (LeGO) vectors for functional gene analysis. Mol Ther. 16, 698-706 (2008).
  7. Weber, K., et al. RGB marking facilitates multicolor clonal cell tracking. Nat Med. 17, 504-509 (2011).
  8. Lo Celso,, Lin, C. P., Scadden, D. T. In vivo imaging of transplanted hematopoietic stem and progenitor cells in mouse calvarium bone marrow. Nature protocols. 6, 1-14 (2011).
  9. Kohler, A., et al. Altered cellular dynamics and endosteal location of aged early hematopoietic progenitor cells revealed by time-lapse intravital imaging in long bones. Blood. 114, 290-298 (2009).
  10. Campagnola, P. J., et al. Three-dimensional high-resolution second-harmonic generation imaging of endogenous structural proteins in biological tissues. Biophys J. 82, 493-508 (2002).
  11. Weigert, R., Sramkova, M., Parente, L., Amornphimoltham, P., Masedunskas, A. Intravital microscopy a novel tool to study cell biology in living animals. Histochem Cell Biol. 133, 481-491 (2010).
  12. Zhang, Y., et al. Mouse models of MYH9-related disease mutations in nonmuscle myosin II-A. Blood. 119, 238-250 (2012).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תיקון


Formal Correction: Erratum: In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy
Posted by JoVE Editors on 1/01/1970. Citeable Link.

A correction was made to In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy. At the time of publication, there was a typo in the discussion, which displayed an incorrect depth.

This was corrected in the discussion from:

This approach combines the benefits of single-cell resolved high resolution imaging together with optical sectioning via confocal microscopy. Very large x - y (mm2) regions of the intact dense tissue volume can be examined by generating tiled-images. These high resolution images from optical sections can be used to computationally reconstruct (automatically and “on-the-fly”) complete 3D volumes of great complexity to depths of ~ 30 μm, comprising ~ 20-30 layers of cells, vascular, bone and collagen structures. 3D reconstructions can be used for morphometric non-invasive quantitative analyses of biologic interest. One important caveat to point out is that large volume/high resolution imaging is time-consuming, for instance 1 hr per ~1 mm3 of tissue (one fossae of the sternum), therefore we recommend imaging no more than 1 mouse per experiment per day when bone marrow as well as different tissues need to be examined in detail.

to:

This approach combines the benefits of single-cell resolved high resolution imaging together with optical sectioning via confocal microscopy. Very large x - y (mm2) regions of the intact dense tissue volume can be examined by generating tiled-images. These high resolution images from optical sections can be used to computationally reconstruct (automatically and “on-the-fly”) complete 3D volumes of great complexity to depths of ~ 300 μm, comprising ~ 20-30 layers of cells, vascular, bone and collagen structures. 3D reconstructions can be used for morphometric non-invasive quantitative analyses of biologic interest. One important caveat to point out is that large volume/high resolution imaging is time-consuming, for instance 1 hr per ~1 mm3 of tissue (one fossae of the sternum), therefore we recommend imaging no more than 1 mouse per experiment per day when bone marrow as well as different tissues need to be examined in detail.

תגיות

4DSpectral Unmixing
במשובט מעקב vivo של גזע hematopoietic ובתאים המסומנים על ידי חמישה חלבונים ניאון באמצעות Confocal וmultiphoton מיקרוסקופית
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.